Особенности эндоцитоза GD2-специфичных антител разных форматов в опухолевых клетках

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация

Одним из наиболее перспективных направлений таргетной терапии рака на основе моноклональных антител является использование конъюгатов антител с лекарством (ADC). К настоящему моменту для применения в клинике одобрено 15 препаратов данного класса и более 100 находятся на стадии клинических испытаний. ADC нацеливают на разные опухолевые маркеры, и в том числе на углеводные антигены в составе гликосфинголипидов. Среди них ганглиозид GD2 является наиболее перспективным опухолевым маркером, и в недавних работах показан значительный потенциал применения анти-GD2 ADC. Важными характеристиками маркера, от которых во многом зависит эффективность ADC, являются способность к интернализации рецептора после формирования комплекса антиген–антитело и его попадание в лизосомы клеток. Способность к интернализации и механизмы эндоцитоза комплексов GD2-специфичных антител с GD2 изучены слабо. В данной работе было проведено исследование механизмов интернализации комплексов ганглиозида GD2 и наиболее актуальных для применения GD2-специфичных антител различного формата, включающих полноразмерные антитела, минибоди и scFv-фрагменты. Все использованные варианты антител интернализовались опухолевыми GD2-позитивными клетками и попадали в лизосомальные компартменты. Полноразмерные антитела и минибоди показали высокую эффективность эндоцитоза GD2-позитивными клетками, который реализуется преимущественно за счет механизмов макропиноцитоза и кавеол-опосредованного эндоцитоза. Полученные данные могут быть востребованы для разработки более эффективных таргетных препаратов для лечения GD2-позитивных опухолей.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

А. О. Макарова

ФГБУН ГНЦ РФ Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: khol@mail.ru

биологический факультет

Россия, 117997 Москва; 119991 Москва

М. М. Титов

ФГБУН ГНЦ РФ Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: khol@mail.ru

биологический факультет

Россия, 117997 Москва; 119991 Москва

Д. В. Калиновский

ФГБУН ГНЦ РФ Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: khol@mail.ru
Россия, 117997 Москва

И. В. Холоденко

ФГБНУ Институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича

Email: khol@mail.ru
Россия, 119121 Москва

А. В. Кибардин

Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева

Email: khol@mail.ru
Россия, 117997 Москва

С. С. Ларин

Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева

Email: khol@mail.ru
Россия, 117997 Москва

Е. В. Свирщевская

ФГБУН ГНЦ РФ Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: khol@mail.ru
Россия, 117997 Москва

С. М. Деев

ФГБУН ГНЦ РФ Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Первый Московский государственный медицинский университет имени Сеченова; Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»

Email: khol@mail.ru
Россия, 117997 Москва; 119991 Москва; 123098 Москва

Р. В. Холоденко

ФГБУН ГНЦ РФ Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; ООО «Реал Таргет»

Автор, ответственный за переписку.
Email: khol@mail.ru
Россия, 117997 Москва; 108841 Москва

Список литературы

  1. Crescioli, S., Kaplon, H., Wang, L., Visweswaraiah, J., and Kapoor, V. (2025) Antibodies to watch in 2025, mAbs, 17, 2443538, doi: 10.1080/19420862.2024.2443538.
  2. Carter, P. J., and Rajpal, A. (2022) Designing antibodies as therapeutics, Cell, 185, 2789-2805, doi: 10.1016/j.cell.2022.05.029.
  3. Dumontet, C., Reichert, J. M., Senter, P. D., Lambert, J. M., and Beck, A. (2023) Antibody-drug conjugates come of age in oncology, Nat. Rev. Drug Discov., 22, 641-661, doi: 10.1038/s41573-023-00709-2.
  4. Mihaylova, R., Momekova, D., Elincheva, V., and Momekov, G. (2024) Immunoconjugates as an efficient platform for drug delivery: a resurgence of natural products in targeted antitumor therapy, Pharmaceuticals, 17, 1701, doi: 10.3390/ph17121701.
  5. Li, J. H., Liu, L., and Zhao, X. H. (2024) Precision targeting in oncology: the future of conjugated drugs, Biomed. Pharmacother., 177, 117106, doi: 10.1016/j.biopha.2024.117106.
  6. Esapa, B., Jiang, J., Cheung, A., Chenoweth, A., Thurston, D. E., and Karagiannis, S. N. (2023) Target antigen attributes and their contributions to clinically approved antibody-drug conjugates (ADCs) in haematopoietic and solid cancers, Cancers, 15, 1845, doi: 10.3390/cancers15061845.
  7. Corrigan, P. A., Cicci, T. A., Auten, J. J., and Lowe, D. K. (2014) Ado-trastuzumab emtansine: a HER2-positive targeted antibody-drug conjugate, Ann. Pharmacother., 48, 1484-1493, doi: 10.1177/1060028014545354.
  8. Bardia, A., Mayer, I. A., Vahdat, L. T., Tolaney, S. M., Isakoff, S. J., Diamond, J. R., O'Shaughnessy, J., Moroose, R. L., Santin, A. D., Abramson, V. G., Shah, N. C., Rugo, H. S., Goldenberg, D. M., Sweidan, A. M., Iannone, R., Washkowitz, S., Sharkey, R. M., Wegener, W. A., and Kalinsky, K. (2019) Sacituzumab Govitecan-hziy in refractory metastatic triple-negative breast cancer, N. Engl. J. Med., 380, 741-751, doi: 10.1056/NEJMoa1814213.
  9. Rosenberg, J. E., O'Donnell, P. H., Balar, A. V., McGregor, B. A., Heath, E. I., Yu, E. Y., Galsky, M. D., Hahn, N. M., Gartner, E. M., Pinelli, J. M., Liang, S. Y., Melhem-Bertrandt, A., and Petrylak, D. P. (2019) Pivotal trial of Enfortumab Vedotin in urothelial carcinoma after platinum and anti-programmed death 1/programmed death ligand 1 therapy, J. Clin. Onco., 37, 2592-2600, doi: 10.1200/JCO.19.01140.
  10. Gilbert, L., Oaknin, A., Matulonis, U. A., Mantia-Smaldone, G. M., Lim, P. C., Castro, C. M., Provencher, D., Memarzadeh, S., Method, M., Wang, J., Moore, K. N., and O'Malley, D. M. (2023) Safety and efficacy of mirvetuximab soravtansine, a folate receptor alpha (FRα)-targeting antibody-drug conjugate (ADC), in combination with bevacizumab in patients with platinum-resistant ovarian cancer, Gynecol. Oncol., 170, 241-247, doi: 10.1016/j.ygyno.2023.01.020.
  11. Bogani, G., Coleman, R. L., Vergote, I., Raspagliesi, F., Lorusso, D., and Monk, B. J. (2023) Tisotumab vedotin in recurrent or metastatic cervical cancer, Curr. Probl. Cancer, 47, 100952, doi: 10.1016/j.currproblcancer.2023.100952.
  12. Yu, J., Fang, T., Yun, C., Liu, X., and Cai, X. (2022) Antibody-drug conjugates targeting the human epidermal growth factor receptor family in cancers, Front. Mol. Biosci., 9, 847835, doi: 10.3389/fmolb.2022.847835.
  13. Kalinovsky, D. V., Kibardin, A. V., Kholodenko, I. V., Svirshchevskaya, E. V., Doronin, I. I., Konovalova, M. V., Grechikhina, M. V., Rozov, F. N., Larin, S. S., Deyev, S. M., and Kholodenko, R. V. (2022) Therapeutic efficacy of antibody-drug conjugates targeting GD2-positive tumors, JITC, 10, e004646, doi: 10.1136/jitc-2022-004646.
  14. Philippova, J., Shevchenko, J., and Sennikov, S. (2024) GD2-targeting therapy: a comparative analysis of approaches and promising directions, Front. Immunol., 15, 1371345, doi: 10.3389/fimmu.2024.1371345.
  15. Hammood, M., Craig, A. W., and Leyton, J. V. (2021) Impact of endocytosis mechanisms for the receptors targeted by the currently approved antibody-drug conjugates (ADCs)-A necessity for future ADC research and development, Pharmaceuticals, 14, 674, doi: 10.3390/ph14070674.
  16. Aggarwal, D., Yang, J., Salam, M. A., Sengupta, S., Al-Amin, M. Y., Mustafa, S., Khan, M. A., Huang, X., and Pawar, J. S. (2023) Antibody-drug conjugates: the paradigm shifts in the targeted cancer therapy, Front. Immunol., 14, 1203073, doi: 10.3389/fimmu.2023.1203073.
  17. He, J., Zeng, X., Wang, C., Wang, E., and Li, Y. (2024) Antibody-drug conjugates in cancer therapy: mechanisms and clinical studies, MedComm, 5, e671, doi: 10.1002/mco2.671.
  18. Tibbetts, R., Yeo, K. K., Muthugounder, S., Lee, M. H., Jung, C., Porras-Corredor, T., Sheard, M. A, and Asgharzadeh, S. (2022) Anti-disialoganglioside antibody internalization by neuroblastoma cells as a mechanism of immunotherapy resistance, CII, 71, 153-164, doi: 10.1007/s00262-021-02963-y.
  19. Wargalla, U. C., and Reisfeld, R. A. (1989) Rate of internalization of an immunotoxin correlates with cytotoxic activity against human tumor cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 5146-5150, doi: 10.1073/pnas.86.13.5146.
  20. Buhtoiarov, I. N., Neal, Z. C., Gan, J., Buhtoiarova, T. N., Patankar, M. S., Gubbels, J. A., Hank, J. A., Yamane, B., Rakhmilevich, A. L., Reisfeld, R. A., Gillies, S. D., and Sondel, P. M. (2011) Differential internalization of hu14.18-IL2 immunocytokine by NK and tumor cell: impact on conjugation, cytotoxicity, and targeting, J. Leukoc. Biol., 89, 625-638, doi: 10.1189/jlb.0710422.
  21. Kalinovsky, D. V., Kholodenko, I. V., Kibardin, A. V., Doronin, I. I., Svirshchevskaya, E. V., Ryazantsev, D. Y., Konovalova, M. V., Rozov, F. N., Larin, S. S., Deyev, S. M., and Kholodenko, R. V. (2023) Minibody-based and scFv-based antibody fragment-drug Conjugates selectively eliminate GD2-positive tumor cells, Int. J. Mol. Sci., 24, 1239, doi: 10.3390/ijms24021239.
  22. Kholodenko, I.V., Kalinovsky, D.V., Svirshchevskaya, E.V., Doronin, I. I., Konovalova, M. V., Kibardin, A. V., Shamanskaya, T. V., Larin, S. S., Deyev, S. M., and Kholodenko, R. V. (2019) Multimerization through pegylation improves pharmacokinetic properties of scFv fragments of GD2-specific antibodies, Molecules, 24, 3835, doi: 10.3390/molecules24213835.
  23. Haraguchi, M., Yamashiro, S., Yamamoto, A., Furukawa, K., Takamiya, K., Lloyd, K. O., Shiku, H., and Furukawa, K. (1994) Isolation of GD3 synthase gene by expression cloning of GM3 alpha-2,8-sialyltransferase cDNA using anti-GD2 monoclonal antibody, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 10455-10459, doi: 10.1073/pnas.91.22.10455.
  24. Nath, N., Godat, B., Zimprich, C., Dwight, S. J., Corona, C., McDougall, M., and Urh, M. (2016) Homogeneous plate based antibody internalization assay using pH sensor fluorescent dye, J. Immunol. Methods, 431, 11-21, doi: 10.1016/j.jim.2016.02.001.
  25. Kalinovsky, D. V., Kholodenko, I. V., Svirshchevskaya, E. V., Kibardin, A. V., Ryazantsev, D. Y., Rozov, F. N., Larin, S. S., Deyev, S. M., and Kholodenko, R. V. (2023) Targeting GD2-positive tumor cells by pegylated scFv fragment-drug conjugates carrying maytansinoids DM1 and DM4, Curr. Issues Mol. Biol., 45, 8112-8125, doi: 10.3390/cimb45100512.
  26. Rennick, J. J., Johnston, A. P. R., and Parton, R. G. (2021) Key principles and methods for studying the endocytosis of biological and nanoparticle therapeutics, Nat. Nanotechnol., 16, 266-276, doi: 10.1038/s41565-021-00858-8.
  27. Sandvig, K., Kavaliauskiene, S., and Skotland, T. (2018) Clathrin-independent endocytosis: an increasing degree of complexity, Histochem. Cell Biol., 150, 107-118, doi: 10.1007/s00418-018-1678-5.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Получение и анализ анти-GD2 мАт-pHAb. а – Общая схема получения конъюгатов GD2-специфичных антител в разных форматах с pH-чувствительным красителем pHAb Dye. б – Прямой иммуноферментный анализ, на подложке сорбирован ганглиозид GD2. Добавлены серийные разведения антител: анти-GD2 мАт и мАт-pHAb, минибоди и минибоди-pHAb, а также scFv-фрагментов и scFv-pHAb. После инкубации с антивидовыми HRP-меченными антителами или анти-FLAG HRP-меченными антителами (титр 1 : 6000) реакцию проявляли Ultra TMB-ELISA Substrate Solution

Скачать (439KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Данные спектрофлуориметрии, показывающие уровень флуоресценции анти-GD2 мАт-pHAb, добавленных путем серийных разведений к клеточным линиям B16 и В78-D14. Измерения проводились после инкубации клеток с антителами без отмывки, либо с 2-кратной отмывкой в PBS для удаления несвязанных с клетками флуоресцентно-меченных антител; анти-HER2 мАт-pHAb были взяты в качестве отрицательного контроля

Скачать (324KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Спектрофлуориметрический анализ анти-GD2 мАт-рНAb. а – Данные спектрофлуориметрии, отражающие зависимость уровня флуоресценции от времени инкубации с клетками линии В78-D14 c анти-GD2 мАт-рНAb в концентрациях 50 и 100 нМ. б – Сравнение интенсивности флуоресценции анти-GD2 мАт-pHAb после инкубации с клетками без отмывки либо с 2-кратной отмывкой в PBS. в – Флуоресценция анти-GD2 мАт-рНAb в растворах с рН 2,0; 4,5; 7,2. г – Флуоресценция анти-GD2 мАт-рНAb в растворе с рН 7,2

Скачать (226KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Оценка интернализации полноразмерных анти-GD2 мАт, меченных pH-чувствительным красителем, в клеточных линиях B16 (а, в) и В78-D14 (б, г) после инкубации в течение 24 ч. На гистограммах (а и б) представлены данные проточной цитофлуориметрии, где красным цветом отмечена флуоресценция контрольных образцов (К ауто), синим – флуоресценция клеток после инкубации с анти-GD2 мАт-pHAb. На конфокальных изображениях представлены клетки линий B16 (в) и В78-D14 (г) после добавления анти-GD2 мАт-pHAb и инкубации в течение 24 ч. Синяя флуоресценция – ядра, окрашенные Hoechst33258; красная флуоресценция – анти-GD2 мАт-pHAb

Скачать (369KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Оценка колокализации полноразмерных анти-GD2 мАт-pHAb (красная флуоресценция) и лизотрекера LTG (зеленая флуоресценция) (а) и анти-GD2 мАт-FAM (зеленая флуоресценция) и лизотрекера LTR (красная флуоресценция) (б) в клеточной линии В78-D14 после инкубации в течение 24 ч. Синяя флуоресценция – ядра, окрашенные Hoechst33258

Скачать (431KB)
Метаданные
7. Рис. 6. Анализ интернализации анти-GD2-антител в разных форматах. а – Цитометрический анализ интернализации анти-GD2-антител в форматах полноразмерных антител (мАт), минибоди и scFv-фрагментов, меченных pH-чувствительным красителем (К ауто – флуоресценция контрольных образцов), в клеточных линиях В16, B78-D14, T98g, 1321N1 и U87-MG после инкубации в течение 24 ч. б – Спектрофлуориметрический анализ интернализации анти-GD2-антител в форматах полноразмерных антител, минибоди и scFv-фрагментов, меченных pH-чувствительным красителем, в клеточных линиях В16, B78-D14, T98g, 1321N1 и U87-MG после инкубации в течение 24 ч

Скачать (507KB)
Метаданные
8. Рис. 7. Конфокальные изображения клеток линий B16, B78-D14 и T98g после инкубации с анти-GD2-антителами и минибоди, меченными pH-чувствительным красителем, в течение 24 ч. Синяя флуоресценция – ядра, окрашенные Hoechst33258; красная флуоресценция – анти-GD2 мАт-pHAb

Скачать (368KB)
Метаданные
9. Рис. 8. Влияние ингибиторов эндоцитоза на эффективность интернализации анти-GD2 мАт (а) и минибоди (б), меченных pH-чувствительным красителем. За значение 100% интернализации было принято RFI контрольного образца с добавлением анти-GD2 мАт-pHAb или минибоди-рНAb, а % интернализации образцов с добавлением ингибитора (I) рассчитывали, как отношение RFI I/RFI K ´ 100

Скачать (114KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2025