EVALUATION OF FREE RADICALS LEVEL IN THE LIVER AND KIDNEYS OF LABORATORY MICE WHEN EXPOSED TO SHORT-TERM SUPERCOOLING

Abstract


This work has studied the effect of short-term supercooling on the organisms of laboratory mice. The effect of low temperatures leads to the activation of oxidative processes, which are characterized by a change in the level of free-radical metabolites of oxygen in the body. Thereby, we performed a bio-chemical luminescence analysis of homogenates of the tested tissues of laboratory animals subjected to short-term supercooling. It was done in order to estimate the level of free radicals, since the intensity of bio-chemical luminescence allows determining the rate of the reaction during which these radicals are formed. The intensity of chemical luminescence is directly proportional to the rate of radical formation, thus it becomes possible to evaluate the level of free radicals that are being formed in this system. The results of our study indicate that the level of oxygen free radicals in liver and kidneys increases when laboratory mice are exposed to short-term cold stress. All cells and tissues of animals emit light in the course of their vital activity, in other words, they have so-called intrinsic chemical luminescence. However, this light is so weak that it was not possible to detect it for a long time. Therefore it was called the "superweak luminescence". This intrinsic luminescence is mainly due to the reactions involving free radicals, and measuring such luminescence is used in scientific studies aimed at laboratory analysis in the cases when it is important to detect and study the appearance of these radicals in living systems. Such low intensity of luminescence is the main obstacle for such research projects and extensive use of intrinsic chemical luminescence for analytical purposes. In this regard, the measurement of chemical luminescences in the presence of certain compounds, the so-called activators, became considerably widespread. According to the mechanism of action they are divided into two groups: chemical and physical. The action of physical activators is based on such physical process as energy transfer from the molecule of the product of chemical luminescence reaction to the activator.

Full Text

Любой живой организм в процессе своей жизнедеятельности подвергается воздействию различных неблагоприятных факторов со стороны внешней среды, которые вызывают формирование стрессовых реакций (Куренков 2006). Одним из важнейших стрессовых факторов является холод (Шаповаленко и др. 2011). Переохлаждение организма и формирование его устойчивости к действию низких температур остается одной из значимых и актуальных проблем в настоящее время (Поздняков 2005). Воздействие низких температур на теплокровный организм способствует формированию окислительного стресса (Доровских и др. 2016), что является важнейшим признаком биохимической терморегуляции у животных. При этом усиливаются процессы свободнорадикального окисления, приводящие к образованию большого количества свободных радикалов (СР) (Поздняков 2005; Владимиров, Проскурнина 2009; Кривохижина и др. 2013). Последние представляют собой нормальные продукты метаболизма живых клеток, однако уменьшение защитных механизмов против воздействия СР или увеличение их производства может быть одним из важных причинных факторов клеточного повреждения (Koszegi и др. 2017). Их образование сопровождается слабым свечением или хемилюминесценцией (ХЛ) (Владимиров 1999). Целью данного исследования явилась оценка интенсивности биохемилюминесценции (БХЛ) гомогенатов тканей исследуемых внутренних органов у лабораторных мышей, подвергнутых кратковременному переохлаждению, и у животных, которые не подвергались стрессовому воздействию. Материалы и методы Исследование было проведено на 30 белых беспородных мышах-самцах весом 22-25 г в возрасте 3-х месяцев. Животные содержались в стандартных условиях вивария на обычном рационе. В ходе эксперимента лабораторные мыши были поделены на 2 группы: контрольная группа и опытная, в которой мы моделировали кратковременный холодовой стресс путем помещения животных в холодильную камеру при температуре 4°C. По истечении одного часа пребывания на холоде животных подвергали декапитации и извлекали материал для исследования: печень и почки, из которых затем были приготовлены гомогенаты для дальнейшего определения интенсивности БХЛ. Были приготовлены 10%-е гомогенаты (в расчете 1 г ткани на 9 мл среды). В качестве среды для выделения использовали 0,9%-й водный раствор NaCl (хлорида натрия). После взятия необходимых органов приступали к гомогенизации тканей. Процедуру гомогенизации проводили в фарфоровой ступке путем добавления к ткани 0,9% NaCl, после чего растирали фарфоровым пестиком до образования однородной массы, т. е. гомогената. Затем полученные гомогенаты сливали в пластиковые пробирки и центрифугировали при 3 000 об./мин в течение 10 минут. После центрифугирования аккуратно отбирали надосадочную жидкость в эппендорфы для последующего исследования. Для оценки уровня СР необходимо использовать специальные вещества - активаторы люминесценции. В нашем исследовании в качестве такого активатора использовали люминол, который в присутствии СР окисляется и переходит в электронно-возбужденное состояние с высоким квантовым выходом, что резко повышает интенсивность свечения (Хабибуллин, Федосов 2006; Tamiya и др. 2018). Измерение интенсивности БХЛ гомогенатов тканей определяли с помощью прибора «Биохемилюминометр БХЛ - 3606М» (Россия). Гомогенат в объеме 40 мкл вносили в кювету с 2 мл физиологического раствора NaCl 0,9% и добавляли несколько кристалликов люминола. После этого кюветы с гомогенатами помещали в кюветный барабан биохемилюминометра (Рубин 1974). Каждый элемент люминометра обладает своей спектральной чувствительностью, и измеряемое свечение не является истинным, поэтому для получения истинного уровня свечения необходимо внести поправки на чувствительность прибора. В данной работе использовался наиболее простой метод получения кривой спектральной чувствительности прибора - измерение свечения вещества с уже известным истинным уровнем свечения. В качестве такого вещества использовался эталонный раствор, который помещался в первую ячейку кюветного барабана (Барабой, Орел 1987). Свет хемилюминесценции (ХЛ) измеряется с помощью чувствительного прибора, электрический сигнал от которого усиливается, а затем обрабатывается и записывается. Излучение от кювет попадает на фотокатод фотоумножителя, который световой сигнал превращает в электрический. Материал фотокатода фотоумножителя определяет его диапазон чувствительности. Для того чтобы перекрыть весь диапазон длин волн, требуется два различных фотоумножителя. Предел чувствительности фотоумножителя определяется уровнем его темнового тока. Темновой ток вызывается электронами, сорванными с поверхности промежуточных эмиттеров фотоэлектронного умножителя, и обладает меньшей амплитудой, чем ток с фотокатода. Поэтому в прибор встроен амплитудный дискриминатор, который пропускает только импульсы с амплитудой определенной заданной величины. Темновой ток активируется теплом и снижается путем охлаждения фотоумножителя (Слобожанина, Белоенко 1990). Таким образом, электрический сигнал усиливается усилителем, а затем регистрируется и анализируется компьютером. На компьютере, в свою очередь, отображается информация в виде графика зависимости интенсивности свечения от времени (Барабой, Орел 1987). По полученным графикам свечения была рассчитана светосумма за 10 минут с момента наступления стационарной фазы свечения. Результаты и их обсуждение Полученные результаты исследования представлены в таблице, данные которой свидетельствуют о достоверном увеличении уровня биохемилюминесценции гомогенатов исследуемых тканей при кратковременном действии холодового стресса на животных по сравнению с уровнем БХЛ гомогенатов мышей, которые не подвергались стрессовому воздействию. Свечение гомогенатов печени и почек мышей, не подвергнутых переохлаждению, наблюдается в интервале светосуммы (49-67)*103 условных единиц (у.е.) со средним значением (52,873±1,092)*103 у.е. в печени и (56,655±2,126)*103 у.е. в почках. Таблица Интегральная интенсивность биохемилюминесценции гомогенатов внутренних органов, у.е.*103 (M±m) Группа мышей Печень Почки I - контроль (n=15) 52,873±1,092 56,655±2,126 II - стресс (n=15) 64,494±2,062*** 66,289±1,871*** Примечание: *** - Р<0,001 - статистическая значимость различий по сравнению с контролем; n - количество мышей в выборке. Свечение гомогенатов этих же тканей животных в условиях кратковременного действия холода наблюдалось в интервале светосуммы (54-80)*103 у.е. со средним значением (64,494±2,062)*103 у.е. в печени и (66,289±1,871)*103 у.е. в почках соответственно. Выводы ХЛ интегрально характеризует соотношение про- и антиоксидантной способности организма (Степанова и др. 2011). В условиях кратковременного холодового стресса наблюдается усиление процессов свободно-радикального окисления (СРО), в результате чего достоверно повышается уровень свободно-радикальных метаболитов кислорода. Полученные нами результаты согласуются с имеющимися литературными данными об усилении СРО и увеличении СР при действии стрессовых факторов на организм (Поздняков 2005; Доровских и др. 2013; Учасов и др. 2013).

About the authors

A. V. Belkin

Tyumen State University


Candidate of Biological Sciences, Associate Professor at the Department of Human and Animal Anatomy and Physiology

V. N. Dubrovsky

Tyumen State University


Candidate of Biological Sciences, Associate Professor at the Department of Human and Animal Anatomy and Physiology

K. Y. Maslakova


postgraduate at the Department of Human and Animal Anatomy and Physiology

N. V. Turbasova

Tyumen State University


Candidate of Biological Sciences, Associate Professor at the Department of Human and Animal Anatomy and Physiology

References

  1. Барабой В. А., Орел В. Э. 1987. Анализ взаимосвязи кинетики спонтанной хемилюминесценции сыворотки крови и кинетики опухолевого процесса в эксперименте // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины Т. 104, 7, 104-106.
  2. Владимиров Ю. А. 1999. Свечение, сопровождающее биохимические реакции // Соровский образовательный журнал 6, 25-32.
  3. Владимиров Ю. А., Проскурнина Е. В. 2009. Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция // Успехи биологической химии. Т. 49, 341-388.
  4. Доровских В. А., Симонова Н. В., Ли О. Н., Доровских В. Ю., Штарберг М. А., Ландышев С. Ю., Мишук В. П., Савинова Т. А. 2013. Влияние сукцинатсодержащих препаратов на интенсивность процессов пероксидации в условиях холодового воздействия // Бюллетень физиологии и патологии дыхания 50, 56-60.
  5. Доровских В. А., Симонова Н. В., Ли О. Н., Доровских Ю. В. 2016. Возможности коррекции процессов перекисного окисления липидов биомембран, индуцированных холодовым воздействием // Бюллетень физиологии и патологии дыхания 59, 59-63.
  6. Кривохижина Л. В., Кантюков С. А., Ермолаева Е. Н., Кривохижин Д. Н. 2013. Хемилюминесценция тромбоцитов. Использование метода хемилюминесценции для определения активности тромбоцитов // Вестник Тюменского гос. ун-та 6, 174-181.
  7. Куренков Д. В. 2006. Влияние ионизирующего излучения и некоторых факторов стресса на эффективность сорбентов цезия: Автореф. дис… канд. биол. наук. Москва.
  8. Поздняков О. Г. 2005. Возрастные и тканеспецифические особенности свободнорадикальных процессов и антиоксидантной системы у крыс на раннем этапе холодового воздействия: Автореф. дис… канд. биол. наук. Астрахань.
  9. Рубин А. Б. 1974. Современные методы исследования фотобиологических процессов. Москва: МГУ.
  10. Слобожанина Е. И., Белоенко Е. Д. 1990. Спектрально-флуоресцентное исследование синовиального выпота в диагностике хронических заболеваний суставов // Ревматология 1, 32-34.
  11. Степанова И. П., Макарова Я. С., Патюков А. Г. 2011. Взаимосвязь между показателями стандартной и интегральной форм тестирования про- и антиоксидантной систем крови // Омский научный вестник 1(104), 58-61.
  12. Учасов Д. С., Ярован Н. И., Бондаренко Е. В., Бойцова О. А. 2013. Профилактика нарушений в оксидантно-антиоксидантной системе у сельскохозяйственных животных // Фундаментальные исследования 10(3), 584-588.
  13. Хабибуллин Р. Р., Федосов А. В. 2006. Теоретические и практические аспекты процесса люминол-зависимой хемилюминесценции в живых организмах // Башкирский химический журнал. Т. 13, № 2, 106-107.
  14. Шаповаленко Н. С., Доровских В. А., Коршунова Н. В., Штарберг М. А., Сластин С. С., Невмывако Е. Е. 2011. Влияние холодового стресса на интенсивность перекисного окисления липидов и антиоксидантную систему тканей экспериментальных животных // Бюллетень физиологии и патологии дыхания 39, 22-25.
  15. Koszegi T., Sali N., Rakic M., Horvath-Szalai Z., Csepregi R., Koncic M. Z., Papp N., Poor M. 2017. A novel luminol-based enhanced chemiluminescence antioxidant capacity microplate assay for use in different biological matrices // Journal of Pharmacological and Toxicological Methods 88, 153-159.
  16. Tamiya E., Inoue Y., Saito M. 2018. Luminol-based electrochemiluminescent biosensors for highly sensitive medical diagnosis and rapid antioxidant detection // Japanese Journal of Applied Physics 57(3) // https://doi.org/10.7567/JJAP.57.03EA05

Statistics

Views

Abstract - 0

Article Metrics

Metrics Loading ...

Refbacks

  • There are currently no refbacks.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies