SPORE FORMING BACTERIA ISOLATED FROM ATMOSPHERIC AEROSOLS IN SOUTHWESTERN SIBERIA DURING ATMOSPHERIC TRANSFER OF AIR MASSES

Full Text

Введение Микроорганизмы аэрозолей Западной Сибири часто транспортируются с юго-западным направлением ветра из степей и пустынь Средней Азии. Пылевые явления в засушливых бесснежных районах - распространенное явление, которое обеспечивает доставку микроорганизмов на значительные расстояния, измеряющиеся тысячами километров (Griffin 2007). Изучение состава микробиоты во время пыльных бурь позволяет заключить, что наиболее распространенной группой бактерий являются спорообразующие, относящиеся, чаще всего, к роду Bacillus, причем их численность может возрастать в несколько раз по сравнению с периодом до пыльной бури (Jeon et al. 2011). Азиатские пылевые события - один из самых значимых факторов, способствующих изменению доминирующих групп в микробном сообществе аэрозолей воздуха, а именно повышению численности спорообразующих бактерий (Park et al. 2018; Kellogg, Griffin, 2006). Микробное сообщество аэрозолей атмосферного воздуха вызывает интерес с точки зрения возможного биотехнологического потенциала, так как способность микроорганизмов противостоять агрессивным факторам атмосферы (ультрафиолетовое излучение, фотоокислители и ксенобиотики, перепады температур и влажности и др.) предполагает наличие ферментов, активных в экстремальных условиях. Одними из часто встречающихся в аэрозолях воздуха микроорганизмами являются спорообразующие бактерии (Andersson et al. 1995; Liu et al. 2018) - убиквисты, попадающие в атмосферу с восходящими воздушными потоками с поверхности почвы, водных объектов, растительного покрова, сельскохозяйственных угодий. Спорообразующие бактерии являются продуцентами широкого спектра ферментов, антибиотиков, биосурфактантов. Бактерии рода Bacillus применяются для получения щелочных протеаз, амилаз, целлюлаз, глюканаз, протеаз, а также других биологически активных соединений: рибофлавина, инозина, рибозидов и аминокислот (Pons 2013; Schallmey et al. 2004; Андреева и др. 2010), что находит применение в пищевой, кожевенной, фармацевтической отраслях, медицине. Перспективным направлением биотехнологической промышленности является получение с помощью продуцентов рода Bacillus липаз (Saraswat et al. 2017; Hemlata et al. 2016), протеаз (Uttatree et al. 2017; Aguilar et al. 2018), широкого спектра полисахарид-деградирующих ферментов (Печуркина и др. 2008; Malick et al. 2017), применяемых в химической, строительной, текстильной, пищевой и других отраслях. Спорообразующие бактерии, как биообъекты биотехнологического производства, характеризуются быстрой скоростью размножения, нетребовательностью к составу питательных сред, возможностью культивирования их в жидких средах как в циклическом, так и в проточном режимах, внеклеточным продуцированием метаболитов. В связи с широким распространением в природе, удобствами применения спорообразующие бактерии являются часто используемыми микроорганизмами для получения биотехнологических продуктов. Материалы и методы Отбор высотных проб атмосферного воздуха осуществляли над территорией Караканского бора в 50 км к югу от Новосибирска с помощью лаборатории «Оптик-Э», смонтированной на самолетах АН-30 или ТУ-154. Самолет пролетал в дневное время над лесным массивом последовательно на высотах 7 000, 5 500, 4 000, 2 000, 1 500, 1 000 и 500 м. Для отбора проб атмосферных аэрозолей в течение 10 минут использовали импинджеры с расходом 50 л/мин, содержащие 50 мл раствора Хенкса в качестве сорбирующей жидкости. Наземные пробы воздуха отбирали в течение 30 минут в импинджеры с расходом 50 л/мин на площадках, расположенных на территории ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» и в поселке Ключи Новосибирской области. Отобранные пробы высевали на стандартные питательные среды, позволяющие выявить микроорганизмы различных таксономических групп (Методы... 1984; Определитель... 1997) и инкубировали при температурах 28-30 и 6-10ºС в течение 3-14 суток. Расчет числа жизнеспособных микроорганизмов в пробах проводился по стандартным методикам (Ашмарин, Воробьев 1962), при этом количество микроорганизмов усреднялось по 3-4 параллелям проб, рассеянных на 4-5 различных средах. Индивидуальные колонии микроорганизмов использовали для получения чистых культур и последующего анализа фенотипических свойств стандартными методами. Оптимум рН среды роста определяли при культивировании штаммов на вариантах агаризованной среды LB с рН 5,0, 7,0 и 9,0. Температурный диапазон роста определяли при культивировании штаммов на агаризованных средах при температурах 5, 20, 30, 37, 42 и 55°С. Изучение физиологических, биохимических, ферментативных свойств изолятов выполняли стандартными методами (Методы... 1984). Скрининг липолитической активности культур проводили на желточном агаре (Методы ... 1984) и агаризованной среде LB с добавлением СaCl2 до 0,01% и соответствующих субстратов. В качестве субстратов использовали монолаурат (твин-20), моноолеат (твин-80), с концентрацией в среде до 1,0%, и нонидет Р-40 (NP-40), тритон Х-100 и Emp-88, с содержанием в среде до 0,05%. Амилолитическую активность культур определяли при их высеве на крахмало-аммиачный агар, протеолитическую - по способности к гидролизу желатина и казеина молока (Методы... 1984). Чашки со средами, засеянными испытуемыми культурами, выдерживали в термостате при 28-30°С в течение двух суток и учитывали результат. Деструкцию нефтепродуктов оценивали визуально в жидкой минеральной питательной среде 8Е с добавлением источника углерода - нефти месторождения Западной Сибири (ХМАО) (Андреева и др. 2007). Морфологию клеток микроорганизмов исследовали методом фазово-контрастной микроскопии с помощью микроскопа Axioskop 40 ("CarlZeiss", Германия). Генетический анализ бактериальных изолятов проводили с помощью ПЦР со специфическими праймерами на 16S рРНК (Hunt et al. 2006). Клетки бактериальных изолятов разрушали лизирующим буфером (комплект реагентов для выделения ДНК/РНК, «НПФ Литех», Россия) и выделяли суммарную мРНК согласно прилагаемой к набору инструкции. Построение кДНК проводили с использованием рендом-праймеров, реактивов, буфера и обратной транскриптазы производства ЦНИИ Эпидемиологии (Москва, Россия). ПЦР проводили с использованием буфера и полимеразы производства «СибЭнзим» (Новосибирск, Россия) в соответствии с инструкцией по применению. Использовали следующую программу для проведения ПЦР: 94°C - 10 сек, 60°C - 15 сек, 72°C - 30 сек, 40 циклов, затем - 72°C - 7 мин. Продукты ПЦР анализировали в 2,0% агарозном геле. Нуклеотидные последовательности 16S рРНК протеобактерий проводили на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3130xl ("Hitachi", Япония) с использованием набора ABI prism Big Dye terminator V3.1 cycle. Для секвенирования использовали продукты амплификации длиной 1360 п.о. Выравнивание производили с помощью программы "Lasergene 9". Филогенетический анализ осуществляли с помощью программного обеспечения "MEGA7". Содержание плазмидной ДНК в штаммах определяли методом скрининга по стандартной методике (Маниатис и др. 1984). Нуклеазную активность определяли на тест-среде с добавлением ДНК ("Sigma", США) (Методы... 1984). Определение активности РНКаз в культуральной среде ПДГГ при культивировании бактерий при температуре 30°С в течение 18-24 ч проводили путем определения количества кислоторастворимых продуктов, образующихся при гидролизе высокополимерной РНК дрожжей (1 мг/мл). За единицу активности фермента принимали его количество, катализирующее образование 1 А260 кислоторастворимых продуктов в течение 60 мин при 37°С в 50 мМ трис-HCl, pH 8,0. Состав среды ПДГГ (г/л): пептон - 9,27, дрожжевой экстракт - 5,00, NaCl - 3,00; 10 мл 50%-го глицерина, 2 мл 20%-й глюкозы; рН 7,0-7,2. Выделенные штаммы микроорганизмов хранили при низкотемпературном замораживании в коллекции природных изолятов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Результаты и обсуждение Мониторинг биогенной компоненты проб атмосферного аэрозоля юга Западной Сибири ведется, начиная с конца 1998 г., большим коллективом исследователей. Результаты высева проб аэрозолей в жидкие и на агаризованные питательные среды группировали по высотам с распределением выделенных жизнеспособных микроорганизмов на морфогруппы (бациллы, кокки, неспороносные бактерии, грибы, актиномицеты, дрожжи), что позволяет проиллюстрировать высокую вариабельность представительства различных микроорганизмов в пробах атмосферного воздуха. Ежемесячное вертикальное зондирование атмосферы над одним и тем же участком Караканского бора Новосибирской области позволило накопить данные по распределению микроорганизмов на различных высотах, способности к росту при различных температурах и значениях рН среды. Общая концентрация микроорганизмов в аэрозолях юга Западной Сибири, определенная нами, составляла в среднем от <1 до > 5×105 КОЕ/м3 пробы, при этом концентрация психрофильных микроорганизмов, способных расти при температуре 6-10ºС, в разных пробах составляла значительную часть от общего числа: от 3,20×102 до 1,13×105 КОЕ/м3. Очевидно, что преобладание психрофильных микроорганизмов можно объяснить низкими средними температурами в местах отбора проб на территории Сибири. Из аэрозолей атмосферного воздуха были выделены и идентифицированы бактерии родов Kocuria, Brevundimonas, Deinococcus, Micrococcus, Arthrobacter, Flavobacterium, Acetobacter, Acinetobacter, Staphylococcus, Streptococcus, Sphingomonas, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus, Micrococcus, Psychrobacter, Arthrobacter, Streptomyces, штаммы дрожжей рода Saccharomyces, Candida, плесневые грибы более всего были представлены родами Alternaria, Penicillium, Mucor, Trichoderma, Fusarium, Aspergillus и рядом других. Количество спорообразующих микроорганизмов значительно варьировалось за годы исследований и составляло от 0,5% в 2005 г. до 51% в 2007 г. для самолетных проб и от 0,89% в 2002 г. до 83,9% в 2016 г. для наземных проб. Особо вызывает интерес количество спорообразующих бактерий, представленных в пробах аэрозолей воздуха в течение октября - декабря 2016 г., когда наблюдалось значительное преобладание их как в высотных, так и в наземных пробах воздуха. Стандартными методами из проб осенью 2016 г. в период преобладания юго-западных ветров из Казахстана выделены 62 штамма спорообразующих бактерий, по совокупности фенотипических свойств и данных геномного анализа идентифицированных как относящиеся к родам Bacillus, Paenibacillus, Brevibacillus, Lysinibacillus, Oceanobacillus и ряду других. Из спорообразующих бактерий был наиболее представлен род Bacillus: среди изолятов выявлены такие виды как B. beringensis, B. boroniphilus, B. cereus, B. firmus, B. korlensis, B. pumilus, B. thuringiensis, B. subtilis, B. brevis. Показательно, что типичными видами-обитателями в луговых, подзолистых, серых почвах на пахотных и пастбищных землях лесостепной зоны Сибири являются B. idosus, B. mesentericus, B. agglomeratus, B. megaterium, B. mycoides (Артамонова 2002), отсутствующие в наших пробах. Это позволяет предположить, что источником выделенных спорообразующих бактерий являлись удаленные юго-западные территории. Представители спорообразующих бактерий являются доминантными и субдоминатными в экологических сообществах засушливых регионов с чрезвычайно низкой обеспеченностью влагой и питательными веществами, повышенной инсоляцией. Например, в аэрозолях воздуха пустынь Гибсона (Австралия), Сахаре (Африка) обнаруживались в большом количестве виды Bacillus safensis, Bacillus megaterium, в виде минорных компонент идентифицированы Bacillus subtilis. (Белов и др. 2017). Переносимые на большие расстояния с пылью из азиатских пустынь микробные сообщества включали, преимущественно, бактерии Bacillus subtilis и Bacillus pumilus (Maki et al. 2014, 2015). Осенью 2009 г. в исследовании бактериального состава аэрозолей воздуха в высокогорье на территории Колорадо (США) на высоте 3 220 м над уровнем океана была зафиксирована высокая концентрация бацилл (в 5 раз превышающая свою численность по сравнению с другими сезонами года), преобладающая над другими группами бактерий, не наблюдавшаяся в другие сезоны года, объясняемая авторами высокой влажностью воздуха, разложением листьев и другой наземной фитомассы, а также переносом из южных регионов с пылью (Bowers et al. 2012). Переносимые на большие расстояния с пылью микроорганизмы постепенно осаждаются на поверхность земли под действием осадков и силы тяжести. Ранее, в конце января 2007 г., нами также был зафиксирован перенос песчаной пыли с Казахстана на территорию Омской области, в результате чего цвет снега оказался желтым (Буряк и др. 2007). Пробы снега из населенных пунктов Омской области Строкино и Тара содержали, преимущественно, спорообразу-ющие бактерии, в том числе Bacillus thuringiensis. Из 66 выделенных из поверхностного снега штаммов 9 обладали альфа-гемолизом, 7 - бета-гемолизом. Анализ подвидовой принадлежности показал, что четыре штамма Bacillus thuringiensis (Sn-50, Sn-56, Sn-60 Sn-66) обладали уреазой и были отрицательны по лецитиназе, что позволяет идентифицировать их как Bacillus thuringiensis spp. galleriae. Исследуемые штаммы Bacillus thuringiensis Sn50, Sn56, Sn60, Sn66 были тестированы на наличие генов cry 1, cry 2, cry 3, cry 4, cry 7/8, cry 9, cry 11A с помощью ПЦР с использованием универсальных праймеров на консервативные участки генов δ-эндотоксинов (Мокеева 2009). Показано, что все исследуемые штаммы несут гены cry 1, cry 2, cry 7/8, cry 9. Внутриконтинентальные, трансконтинентальные и трансокеанические переносы пыли пустынь, содержащих микроорганизмы, позволяют им мигрировать на огромные расстояния и осваивать новые экологические ниши. Во время переноса с пылевыми частицами часть микроорганизмов погибает от УФ-излучения, высокой температуры, обезвоживания и недостатка питательных веществ. Однако спорооборазующие микроорганизмы, например, способны преодолевать значительные расстояния благодаря стадии споруляции, что, возможно, делает их доминантой по численности в пробах воздуха во время пыльных бурь, даже вдали от источника на расстоянии 5 000 км (Prospero et al. 2005; Griffin et al. 2003; Kellogg et al. 2004). Таким образом, резкое внезапное преобладание спорообразующих бактерий в высотных и наземных пробах воздуха юга Западной Сибири можно объяснить горизонтальным переносом с южным и юго-западным ветром из степей и пустынь Средней Азии, который был зафиксирован в дни полета самолета и отбора наземных образцов. Выделенные из проб аэрозолей воздуха в течение октября-декабря 2016 г. спорообразующие культуры преимущественно являлись мезофилами, причем треть из них были способны к росту при широких значениях рН среды (5,0-9,0). Термофильных бактерий обнаружено не было. Протеолитическую активность показали 31% изучаемых спорообразующих культур, амилолитическую - 20%, фосфатазную - 32%, липазную - 14%, фосфолипазную - 3%, нуклеазную - 4%, наличие плазмид обнаружено у 21% культур. При скрининге штаммов на способность секретировать липолитические ферменты в среду культивирования, утилизировать эфиры жирных кислот, твердые жиры, масла, нефтепродукты выделены эффективные штаммы, среди которых наиболее продуктивными были бактерии рода Lysinibacillus, способные к ферментации при рН среды 5,0-9,0. Штаммы, обладающие высокой секрецией тестируемых ферментов, могут быть перспективны для биотехнологического применения. У всех штаммов, обладающих липолитической активностью, была обнаружена также и способность к деструкции нефтепродуктов, что согласуется с данными (Margesin et al. 1999) об участии в деструкции липидов и компонентов нефтепродуктов схожих ферментных систем биодеградации. Заключение В исследовании представлено разнообразие и ферментативная активность спорообразующих бактерий, выделенных осенью 2016 г. из высотных и приземных проб аэрозолей атмосферного воздуха юга Западной Сибири. Среди изолированных из аэрозолей спорообразующих бактерий выделены штаммы с заметной продукцией внеклеточных ферментов, пригодные для их рассмотрения в качестве потенциальных объектов для биотехнологических разработок, а также штаммы, имеющие значение для фундаментальных исследований. Особый интерес представляют культуры Lysinibacillus sphaericus Сb 968, Сb 977, Сb 978, а также Lysinibacillus sp. Сb 964, выделенные из приземных слоев атмосферы, растущие при значениях рН 5-9, являющиеся активными продуцентами липаз, протеаз, способные к деструкции нефти. Штаммы, обладающие высокой секрецией одного из тестируемых ферментов, могут быть перспективны для получения препаратов узконаправленной специфичности.

About the authors

I. S. Andreeva

State Research Center of Virology and Biotechnology VECTOR

Candidate of Biological Sciences, Associate Professor, Head of Laboratory

A. S. Safatov

State Research Center of Virology and Biotechnology VECTOR

Doctor of Technical Sciences, Head of Department

L. I. Puchkova

State Research Center of Virology and Biotechnology VECTOR

Candidate of Biological Sciences, Leading Researcher

E. K. Emelyanova

Novosibirsk State Medical University

Candidate of Biological Sciences, Associate Professor at the Department of Hygiene and Ecology, Senior Researcher

G. A. Buryak

State Research Center of Virology and Biotechnology VECTOR

Researcher

V. A. Ternovoi

State Research Center of Virology and Biotechnology VECTOR

Candidate of Biological Sciences, Head of Laboratory

References

Supplementary files