PERIPHERAL BLOOD LYMPHOCYTES ADENOSINE TRIPHOSPHATE AVAILABILITY AMONG THE RESIDENTS OF THE NORTHERN EUROPEAN RUSSIA

Full Text

Известно, что переход наивных Т-клеток от покоя к высокой активности обусловлен метаболическим перепрограммированием, тесно связанным с энергетическим статусом Т-клеток [9]. Наивные Т-клетки имеют определенный уровень метаболизма, поддерживаемый в той степени активности, которая необходима для выполнения ими своей функции иммунологического надзора [11]. Метаболические запросы Т-клеток после активации растут, чтобы покрыть энергетические нужды и удовлетворить необходимые биосинтезы на уровне, позволяющем Т-клеткам выполнять соответствующие физиологические функции [20]. Обеспечение потребностей наивных и активированных Т-клеток происходит через механизмы регуляции различных метаболических путей (окисление жирных кислот, цикл трикарбоновых кислот, гликолиз, глу-таминолиз), которые, участвуя в продукции многих ключевых интермедиатов и в генерации АТФ, влияют на дальнейшую судьбу Т-клеточных популяций [20, 22, 28]. Митохондрия выступает как основной генератор энергии в клетке и интегрирует сеть путей метаболизма углеводов, липидов и аминокислот. Сиртуин 3 (SIRT3) играет важную роль в функционировании митохондрий [12], влияет на многие процессы: проницаемость митохондриальной мембраны, защиту от повреждающего действия активных форм кислорода, работу цепи переноса электронов, катаболизм аце-тил-коэнзима А, окисление липидов и аминокислот. SIRT3 относится к NAD+-зависимым деацетилазным ферментам семейства сиртуинов [4], которые наряду с АМФ-зависимой протеин киназой (АМРК) и mTOR-комплексом 1 (mTORC1) являются метаболическими сенсорами клетки и активно изучаются в настоящее время, особенно в отношении их роли в адаптивном ответе. Целью исследования было определить обеспеченность лимфоцитов периферической крови АТФ и уровень регулятора митохондриального метаболизма SIRT3 у практически здоровых северян. Методы Определялись иммунологические показатели и содержание АТФ в лимфоцитах периферической крови у 106 волонтеров, жителей города Архангельска (76 женщин и 30 мужчин в возрасте от 21 до 63 лет), у 23 волонтеров дополнительно определялся митохондриальный SIRT3. Все исследования проводились с согласия волонтеров и в соответствии с требованиями Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации об этических принципах проведения медицинских исследований (2000). На анализ бралась венозная кровь утром натощак. Комплекс иммунологического исследования включал выделение лимфоцитарной фракции крови и определение фенотипов лимфоцитов периферической крови (CD3+, CD4+, CD8+, CD10+, CD16+, CD71 + , CD23+, CD25+, CD95+, HLADR) методом непрямой иммунопероксидазной реакции (реактивы ООО «Сорбент», Россия). В клеточном лизате лимфоцитов методом им-муноферментного анализа на автоматическом анализаторе «Evolis» фирмы «Bio-RAD» (Германия) определяли содержание SIRT3. Концентрацию АТФ в лимфоцитах измеряли с помощью люминометра и набора реагентов «Люмтек» (Россия) с использованием люциферин-люциферазной реакции. Статистическая обработка результатов исследования проводилась в программе «Statistica 10.0» («StatSoft», США). Вычислялись средние значения (M), стандартное отклонение (SD), проводился кластерный анализ с использованием метода «К средних», исследовались корреляционные связи. Результаты По результатам кластерного анализа методом «К средних» были выделены две группы из числа обследуемых, статистически значимо различающиеся по всем определяемым показателям (таблица). Результаты кластерного анализа Показатель, х 106кл/мл Кластер 1 (n = 83) M (SD) Кластер 2 (n = 23) M (SD) Уровень значимости различий (р) Лимфоциты 2,04 (0,769) 1,21 (0,470) <0,0001 CD3 0,60 (0,308) 0,33 (0,152) 0,0011 CD4 0,44 (0,259) 0,28 (0,152) 0,0063 CD8 0,41 (0,226) 0,28 (0,156) 0,0076 CD10 0,38 (0,173) 0,23 (0,106) 0,0002 CD16 0,36 (0,169) 0,21 (0,094) <0,0001 CD71 0,43 (0,252) 0,28 (0,157) 0,0005 CD95 0,32 (0,154) 0,17 (0,084) <0,0001 CD25 0,42 (0,230) 0,24 (0,111) 0,0006 CD23 0,43 (0,230) 0,21 (0,082) <0,0001 HLADR 0,46 (0,250) 0,23 (0,094) <0,0001 АТФ, мкмоль/106кл 0,95 (0,487) 3,71 (1,319) <0,0001 Характерно, что уровень внутриклеточного АТФ снижен в группе с наибольшими абсолютными значениями показателей лимфоцитарного пула (кластер 1) и наоборот. Чтобы оценить вклад определяемых клеточных фенотипов, было рассчитано их относительное содержание внутри каждой из групп. Так, в первой группе удельный вес клеток с рецепторами CD95, CD23 и HLADR был выше по сравнению с их содержанием во второй группе на 1,7 % (CD95), 3,7 % (CD23) и 3,5 % (HLADR). В то же время во второй группе выше был удельный вес клеток с рецепторами CD3, CD4, CD8 и CD71 относительно первой на 3,7, 1,5, 3,0 и 2,0 % соответственно (рис. 1). Кроме того, представляется важным для оценки клеточного звена иммунитета учитывать баланс отдельных фенотипов клеток, например, готовых к пролиферации клеток CD10+, и меченных к апоптозу клеток CD95+, Т-хелперов CD4+ и активированных клеток CD23+ с Fc-рецептором к IgE. Их соотношение в группах различалось: для группы первого кластера CD10/CD95 составило 1,19, а CD4/CD23 равнялось 1,02, в то время как для группы второго кластера эти соотношения были выше и составили 1,35 и 1,33 соответственно. Для визуальной оценки реагирования клеточного звена иммунитета у групп обследуемых была построена объемная диаграмма с осями: Х - клеточные маркеры; Y - значения обратного логарифма (1 /1n) соотношений клеток с рецептором CD3 и рецепторами CD8, CD4, CD71, C25, CD10, CD23, HLA DR, CD95; Z - группы кластеров 1 и 2. Как видно из диаграммы (рис. 2), у группы кластера 2 с более высоким, чем в группе 1, содержанием АТФ выше уровень дифференцировочных (CD4, CD8) и активационных (CD25, CD71) маркеров, отражающий степень их экспрессии и способность Т-клеток к реагированию. Результаты обследования волонтеров, у которых определялось содержание SIRT3 в лизате лимфоцитов, были разделены с помощью метода кластеризации «К средних» на две статистически отличимые группы. В группе первого кластера средняя концентрация SIRT3 в клеточном лизате составила 0,15 (0,039) пг/106 кл при среднем количестве лимфоцитов 3,1 (0,599) *106 кл/мл, в то время как для группы второго кластера среднее содержание SIRT3 было 0,39 (0,198) пг/106 кл (р = 0,0097) и число лимфоцитов 1,43 ( 0,508) *106 кл/мл (р < 0,0001). Полученные различия в уровне SIRT3 соответствуют количественным изменениям АТФ в аналогичных по содержанию лимфоцитов группах кластеров, что отображено на комбинированной диаграмме (рис. 3). Обсуждение результатов кластер 1 кластер 2 3SIRT3 АТР Рис. 3. Содержание сиртуина 3 и аденозинтрифосфата в лимфоцитах периферической крови Как известно, основными путями наработки АТФ в лимфоцитах служат окислительное фосфорилирование (OXPHOS), гликолиз и глутаминолиз [11, 28]. Скорость и эффективность в отношении продукции АТФ этих путей не равнозначны: гликолиз по сравнению с OXPHOS намного быстрее, но менее эффективен. В зависимости от функционального состояния различаются и потребность клеток в нутриентах, необходимых для генерации энергии, и расход наработанной АТФ. Так, наивные Т-клетки преимущественно используют Р-окисление жирных кислот и OXPHOS и тратят значительную долю продуцируемой АТФ на поддержание состояния покоя [5]. Сохранение этого состояния обеспечивается в том числе регуляцией оборота белков, ответственных за активацию наивных клеток. Например, IL-7, необходимый для выживания наивной Т-клетки, индуцирует экспрессию транскрипционных факторов (LKLF, TOB1, FOXO3A, FOXJ1), которые активируют транскрипцию генов ингибиторов клеточной активности [16]. Один из них, ингибитор ядерного фактора каппа B (ингибитор NF-kB), постоянно экспрессирующийся в наивных Т-клетках, предотвращает переход NF-kB из цитоплазмы в ядро, блокируя тем самым его транскрипционную активность, что делает клетку не восприимчивой к активирующему сигналу [18]. Также АТФ используется на функционирование убиквитин-лигазной системы, обеспечивающей деградацию некоторых протеинкиназ, участвующих в сигнальных путях стимуляции наивных Т-клеток [7]. Активированные клетки многократно повышают поглощение глюкозы и её утилизацию для увеличения продукции АТФ, расходуя данный макроэрг на обеспечение дифференциации, быстрого роста, пролиферации, синтеза эффекторных молекул [22]. Более того, метаболический профиль каждого из специализированных субтипов Т-лимфоцитов оптимизирован для обеспечения их уникальных функций [2]. Так, активированные CD4+-эффекторные клетки и CD8+-цитотоксические клетки повышают уровень аэробного гликолиза [21], кроме того, Т-эффекторные клетки полагаются на поступление и метаболизм глутамина, хотя интенсивность глутаминолиза различается у разных субтипов Th-клеток и наиболее выражена у Th17 [17]. Значимым для Т-эффекторных клеток является активация PI-3K/Akt/mTOR сигнального каскада, в результате чего клетки способны усиливать метаболизм глюкозы благодаря транслокации глюкозного транспортера 1 на клеточную поверхность и предупреждению его интернализации, позитивной регуляции гликолитических ферментов и повышению скорости гликолитического потока [25]. Кроме того, происходит индукция экспрессии транспортеров аминокислот и активация mTORC1 эукариотического фактора инициации транскрипции elF-4E и рибосомальной киназы p70S6K, что стимулирует белковые синтезы и клеточный рост [3, 27]. T-регуляторные клетки, как и Т-клетки памяти, используют преимущественно окисление жирных кислот и OXPHOS [19, 28]. Повышению OXPHOS способствует характерная для Т-регуляторных клеток активация протеин киназы АМРК - внутриклеточного сенсора дефицита энергии, благодаря которой стимулируются процессы окисления субстратов и генерации АТФ [8, 10]. Полученные нами результаты показали различие в долевом составе фенотипов клеток внутри групп, которые статистически отличались, в том числе и по уровню АТФ. Так, по сравнению с группой кластера 1 в группе кластера 2 (с высоким значением АТФ) более высокой была доля зрелых лимфоцитов (CD3+), Т-хелперов (CD4+), цитотоксических Т-клеток (CD8+) и клеток с рецептором к трансферрину (CD71 + ), то есть клеток с высокой активностью метаболизма, интенсивно использующих путь гликолиза и окислительное фосфорилирование. В то же время в группе кластера 1 была выше доля клеток, меченных к апоптозу (CD95+), активированных клеток с Fc-рецептором к IgE (CD23+) и клеток с антигенами главного комплекса гистосовместимости II класса (HLA DR), что предполагает повышенные энергетические траты на апоптозную деградацию, анти-телопродукцию, контроль иммунного реагирования. Данный факт отражают установленные отрицательные корреляции (р < 0,05) между уровнем АТФ и количеством клеток с рецепторами CD95 (г = -0,46), CD23 (г = -0,44), HLA DR (г = -0,42). Исходя из функциональной роли апоптоза как фактора сдерживания пролиферации, было рассчитано отношение клеток, готовых к пролиферации (CD10+), к клеткам, меченным к апоптозу (CD95+). Результат расчета CD10/CD95 показал, что для группы кластера 1 это отношение составило 1,19, в то время как в группе кластера 2 оно равнялось 1,35, что указывает на более выраженную пролиферативную активность. С позиций оценки развития альтернативного гуморального ответа с антителозависимым цитолизом является значимым отношение содержания CD4 к содержанию CD23, которое имело значения 1,02 и 1,35 у групп кластеров 1 и 2 соответственно. Это отражает более высокий уровень экспрессии Fc-рецепторов к IgE (CD23) в 1 группе, в то время как во 2 группе преобладало количество Т-хелперных клеток (CD4+). Таким образом, в группе кластера 2 по сравнению с группой кластера 1 высокий уровень АТФ может быть обусловлен как более высоким относительным содержанием фенотипов клеток CD4+, CD8+, CD71 + , так и смещением CD10/CD95 и CD4/CD23 в сторону содержания клеток с высокой метаболической активностью и генерацией энергии (CD10+ и CD4+). Наработка АТФ варьирует в зависимости от изменения микроокружения и потребности лимфоцитов в энергии через регуляцию метаболических путей с участием различных механизмов сигналинга. Так, активация CD28 сигналом PI-3K/Akt/mTOR пути приводит к стимуляции аэробного гликолиза, биосинтетических процессов [3, 15, 25]. При недостатке энергии (повышение АМФ/АТФ) активируется энергетический «страж» клетки АМРК, способствуя усилению процессов катаболизма глюкозы и жирных кислот и повышению OXPHOS пути продукции АТФ [10]. SIRT3 вместе с другими сиртуинами (SIRT1, SIRT4, SIRT5) регулирует многие аспекты функционирования митохондрий путем контроля транскрипции генов и посттрансляционной модификации белков, вовлеченных в энергетический метаболизм [23]. Оказывая деацетилирующее действие на целевые белки-мишени, SIRT3 активирует работу митохондриальных процессов, таких как цикл трикарбоновых кислот Кребса (изоцитратдегидрогеназа 2, суцинатдегидрогеназа) [6], окислительное фосфорилирование (белковые субъединицы комплексов цепи переноса электронов) [1], скорость продукции и нейтрализацию активных форм кислорода (супероксиддисмутаза 2) [24], р-окисление жирных кислот и наработку ацетил-СоА (ацил-СоА дегидрогеназа длинноцепочечных жирных кислот) [14], глутаминолиз (глутаматдегидрогеназа) [1]. Контроль функционирования митохондрий и экспрессия SIRT3 прямо связаны с уровнем транскрипционного ко-активатора PGC-1a и активностью АМРК, более того, они оказывают взаимное позитивное влияние друг на друга [26]. Так, индукция экспрессии PGC-1a может осуществляться через сАМР/РКА/CREB путь [29]. Повышение уровня PGC-1a стимулирует экспрессию SIRT3, регулируя один из транскрипционных факторов ERR-a, который взаимодействует с промотором SIRT3 [13], а сАМР способен напрямую взаимодействовать с SIRT3, повышая стабильность белка и его каталитическую активность [29]. В свою очередь АМРК может фосфорилировать CREB и PGC-1a и через многоступенчатый механизм регулировать экспрессию SIRT3, а SIRT3 в то же время положительно регулирует АМРК, фосфорилирование CREB и экспрессию PGC-1a [26]. Таким образом, SIRT3 совместно с АМРК, сенсором энергодефицита, и PGC-1a, регулятором транскрипционной активности вовлеченных в энергетический метаболизм генов участвует в контроле энергетического статуса клеток. Проведенный анализ полученных нами количественных значений SIRT3 и АТФ в лимфоцитах показал, что уровень SIRT3 прямо соотносится с содержанием АТФ. Заключение Решающую роль в развитии Т-клеток, поддержании внутриклеточного гомеостаза и функций, процессах дифференциации, пролиферации, клеточной памяти играет продукция АТФ с участием определенных метаболических путей: OXPHOS, гликолиза, глута-минолиза. Интенсивность субстратных потоков, количество и активность ферментов, вовлеченных в эти пути, контролируются различными сигналами через механизмы регуляции транскрипции генов, варианты посттрансляционной модификации белков. Результаты проведенного нами исследования показывают, что обеспеченность лимфоцитов периферической крови АТФ обуславливает активационную и реакционную способность Т-клеток. Представляется важным учитывать из подмножества лимфоцитов относительное количество фенотипов клеток с высокой метаболической активностью CD4+, CD8+, CD25+, CD71+, клеток с экспрессией функционального антигена CD23, клеток, готовых к пролиферации CD10+, клеток, меченных к апоптозу CD95+, отношения содержаний СD10 и CD95, CD4 и CD23. Дополнительное определение уровня SIRT3 позволяет отразить активность митохондриального метаболизма и путей, участвующих в продукции АТФ. Оценка энергетического статуса лимфоцитов является, на наш взгляд, весьма перспективной в исследовании их функционирования и для установления возможных причин нарушений иммунного реагирования. Авторство Зубаткина О. В. внесла существенный вклад в концепцию, анализ и интерпретацию данных, подготовила окончательный вариант статьи; Добродеева Л. К. внесла существенный вклад в концепцию и дизайн исследования, окончательно утвердила присланную в редакцию рукопись; Попов А. А. участвовал в получении, анализе и интерпретации данных, подготовил первый вариант статьи; Самодова А. В. участвовала в получении, анализе и интерпретации данных; Круглов С. Д. участвовал в получении и анализе данных, проводил статистическую обработку результатов. Авторы подтверждают отсутствие конфликта интересов.

About the authors

O. V. Zubatkina

Institute of Environmental Physiology of N. Laverov Federal Center for Integrated Arctic Research Russian Academy of Sciences

Email: ozbiochem@gmail.com
Arkhangelsk

L. K. Dobrodeeva

Institute of Environmental Physiology of N. Laverov Federal Center for Integrated Arctic Research Russian Academy of Sciences

Arkhangelsk

A. A. Popov

Northern State Medical University

Arkhangelsk

A. V. Samodova

Institute of Environmental Physiology of N. Laverov Federal Center for Integrated Arctic Research Russian Academy of Sciences

Arkhangelsk

S. D. Kruglov

Institute of Environmental Physiology of N. Laverov Federal Center for Integrated Arctic Research Russian Academy of Sciences

Arkhangelsk

References

Supplementary files