Evaluation of ponceau 4R commercial food dye genotoxicity in human lymphocytes cultured with cytokinetic block using the additional metabolic activation system

Full Text

Введение. Понсо 4R – водорастворимый пищевой азокраситель (синонимы: пунцовый 4R, пищевой красный 7, кошенилевый красный, новый кокцин), зарегистрированный в качестве пищевой добавки Е124, обычно синтезируется из ароматических углеводородов, разрешен к применению в большинстве стран Евросоюза и РФ, запрещен в Финляндии, Норвегии и США [1]. Понсо 4R используется для придания привлекательного вида продуктам питания: свежей либо приготовленной рыбе, колбасным изделиям, сладостям (печенью, варенью, мороженому, декоративным компонентам тортов), мясных и фруктовых консервов; газированных напитков [2]. Иногда Понсо 4R комбинируют с иными красителями, заметно расширяя палитру для придания продуктам оранжевых, фиолетовых или даже зеленых оттенков.

В 1983 году JECFA и в 1984 году SCF рекомендовали дозу 4мг/кг понсо 4R как допустимую суточную дозу для человека сроком до 2009 года. В то же время в 1993 г авторы публикации [3] на основании анализа данных литературы и собственных исследований предложили исключить понсо 4R из списка разрешенных пищевых красителей. В 2009 году допустимая суточная была пересмотрена и установлена равной 0,7 мг/кг [4, 5].

Анализ имеющихся исследований генотоксичности красителя выявил ряд противоречивых результатов [6]. Так, в тесте Эймса с использованием E.coli и у дрожжей в тесте на индукцию конверсии генов понсо 4R генотоксической активностью не обладал в концентрациях от 0,3 до 10 мг/чашку [7-15]. Однако на культуре фибробластов китайского хомячка в концентрации 1 мг/мл повышал плоидность и вызывал структурные аберрации хромосом [7]. In vivo в микроядерном тесте на костном мозге мышей генотоксическое действие красителя обнаружено в дозах, начиная с 4мг/кг [3, 16, 17], а отсутствие эффекта в тех же тестах, начиная с 25 мг/кг [18, 19].

Тест ДНК-комет оказался одним из самых используемых для оценки генотоксичности понсо 4R: увеличение фрагментации ДНК обнаружено в нескольких органах мышей, начиная с дозы 10 мг/кг [20, 21], но отсутствие эффекта у трансгенных мышей от 250 мг/кг и крыс от 10 мг/кг [21-23], хотя эти противоречия могут объясняться цитотоксическими, токсическими свойствами красителя и особенностями метаболизма в организме хозяина.

Микроядерный тест на культуре лимфоцитов крови человека с применением цитокинетического блока – один из наиболее информативных индикаторов эффектов нестабильности генома, поскольку позволяет учесть не только повреждения ДНК, но и связанные с ними изменения пролиферации и клеточной гибели [24, 25]. В открытой печати нам удалось найти всего одно исследование эффектов понсо 4R в этом тесте [26]: дозовозависимое увеличение частоты клеток с микроядрами обнаружено при экспозиции к 0,1-0,5 мг/мл красителя, причем минимальная из использованных концентраций была выбрана как разрешенная к использованию в Индии и соответствовала приблизительно 100 кратному превышению скорректированной в 2009г. допустимой суточной дозы для человека [4, 5]. Важной особенностью всех исследований красителя на культуре крови является отсутствие дополнительной метаболической активации, которая может существенно модифицировать эффекты нестабильности генома.

В собственных исследованиях в микроядерном тесте на мышах in vivo найден генотоксический эффект трех коммерческих образцов понсо 4R при пероральном введении в диапазоне доз 125-2000 мг/кг. [17]. Представленный небольшой обзор, собравший, тем не менее, все доступные публикации по теме, свидетельствует о наличии у понсо 4R генотоксической активности, которая проявлялась как у химически чистого вещества, так и у образцов, приобретенных в розничной сети и экстрактах продуктов питания, то есть, заведомо содержащих разнообразные примеси. Изученные концентрации и дозы понсо 4R варьировали в относительно небольшом диапазоне высоких доз: in vitro, начиная с 0,1 мг/мл, и in vivo в дозах от 4 мг/кг массы тела животных (что соответствует 0,004 мг/мл культуральной среды).

С учетом сказанного выше целью настоящей работы стало определение эффектов нестабильности генома, индуцированных приобретенным в розничной торговой сети ПК понсо 4R. Исследования проведены с использованием широкого диапазона концентраций красителя на клетках цельной крови человека, культивированных в условиях цитокинетического блока в присутствии системы метаболической активации гепатоцитов крыс S9 и без нее.

Материалы и Методы

Образец понсо 4R, использованный в работе, приобретен в розничной торговой сети г.Москвы. Краситель произведен на заводе Roha Dyechem PVT. LTD (Индия) в 2019 г. со сроком годности до 2024 г. Российский дистрибьютер предоставил также Декларацию от 21.09.2018 г. (действительна в течение 3 лет) о соответствии красителя Техническому Регламенту Евразийского экономического Союза (табл.1), выданную на основании результатов анализов, выполненных в независимой испытательной лаборатории по заказу дистрибьютера.

Таблица 1 – Сертификат анализа о соответствии красителя Техническому Регламенту Евразийского экономического Союза

Компонент продукта	Понсо 4R, серия 1007284496-100728554
Содержание красящих веществ %	83.110
Вещества нерастворимые в воде %	0.042
Вспомогательные красящие вещества %	< 1.00
Экстрагируемые эфиром вещества %	< 0.200
Органические компоненты, исключая окрашивающие вещества %	< 0.500
Несульфированные основные ароматические амины (в расчетах анилин) %	< 0.010
Свинец (as Pb)  мг/кг	< 2.00
Мышьяк (as As) мг/кг	< 1.00
Ртуть (as Hg) мг/кг	< 1.00
Кадмий (as Cd) мг/кг	< 1.00

Постановка эксперимента

Для оценки генотоксической активности понсо 4R без и в присутствии системы метаболической активации S9 гепатоцитов крыс при выборе концентраций понсо 4R руководствовались допустимыми дозами для животных в токсикологических экспериментах. В качестве контроля использовали дистиллированную воду.

400 мкл цельной крови культивировали в 3,6 мл среды F-10, содержавшей 20% инактивированной сыворотки крови крупного рогатого скота и 7,5 мкл/мл фитогемагглютинина (ФГА, ПанЭко, РФ) при 37 С⁰ в течение 72 часов. На 24 часу в культуру вводили отфильтрованные через мембранный фильтр (GVS SpA, RC, 0,22 мкм 47 мм) водный растворы понсо 4R, балансируя общий объем культуры стерильной дистиллированной водой. Цитохалазин В (ЦХВ, ПанЭко, РФ) до конечной концентрации 6 мкг/мл вводили в культуру на 44 часу. При использовании метаболической активации на 48 часу в культуры вводили 200 мкл фракции S9 печени крыс Wistar с коферментами [27]. Через 3 часа инкубации при 37 С⁰ клетки во всех культурах стерильно отмывали средой F10, которую после этого заменяли на свежую, содержащую ФГА, L-глутамин и цитохалазин В, после чего культивирование при 37 С⁰продолжали еще 21 час.

Предварительно гипотонизированные клетки фиксировали [24], раскапывали на замороженные предметные стекла и окрашивали азур-эозином по Романовскому. Цитомный анализ шифрованных препаратов по расширенному протоколу микроядерного теста проводили как описано в [24, 25]. При анализе данных применяли непараметрический метод сравнения эффектов с контролем и между отдельными культурами, экспонированными к равным концентрациям красителя, но в присутствии S9 и без нее, использовали критерий χ2, а для выявления групповых различий применяли непараметрический критерий Манна-Уитни.

Результаты

Уровни генотоксических эффектов цитогенетических показателей в культуре лимфоцитов человека показаны в табл.2.

Хорошо видно, что в культурах без S9 и в присутствии системы метаболической активации генотоксические эффекты понсо 4R проявлялись качественно по-разному. Так, без дополнительной метаболической активации действие самых низких из использованных концентраций (0,0000256 - 0,00064) сопровождалось дозозависимым снижением частоты 2-ядерных клеток с нуклеоплазменными мостиками (НПМ) и в одном случае – снижением частоты 4-ядерных клеток с микроядрами (МЯ), что можно объяснить гибелью клеток, несущих эти повреждения. Повышение уровней генотоксического действия красителя по сравнению с контролем обнаружено, начиная с концентрации понсо 4R 0,0032 мг/мл по повышению частот 2-ядерных и 4-ядерных клеток с НПМ, а также по повышению частоты двуядерных клеток с МЯ и НПМ. Дальнейшее повышение концентрации красителя индуцировало эффекты нестабильности генома только в полиядерных клетках.

В присутствии S9 и высоких концентраций красителя (начиная с 0,08 мг/мл), наблюдали значительную гибель клеток - такие препараты не анализировали.

В культурах с дополнительной метаболической активацией (содержащих S9), наблюдали достоверное (по сравнению с соответствующим контролем) повышение частот 2-ядерных клеток с МЯ при экспозиции к двум самым низким, а также к самой высокой из исследуемых концентраций (табл.2). При этом частота 2-ядерных клеток с НПМ в присутствии S9 ни при одной из использованных концентраций красителя от контроля не отличалось (табл.2). Кроме того, статистически значимое снижение частоты 4-ядерных клеток с НПМ по сравнению с действием только красителя выявлено при экспозиции ко всем соотносимым концентрациям. Достоверные различия той же направленности обнаружены в суммарных частотах клеток с генетическими повреждениями (МЯ+НПМ) во всех делящихся (Р<0,000) и всех ускоренно делящихся (прошедших 2 и более циклов в присутствии ЦХВ) клетках (Р<0,000), начиная с концентрации 0,00064 мг/мл.

 

Таблица 2

Эффекты нестабильности генома в первичных культурах клеток цельной крови человека, экспонированных к понсо 4R в условиях без и в присутствии фракции S9 гепатоцитов крыс

Концентрация понсо 4R (мг/мл культуры)	Цитогенетические показатели
	Неделящиеся клетки			Прошли 1 митотический цикл				Прошли 2 митотических цикла								Прошли более 2 митотических циклов
	1-ядерные клетки с			2-ядерные клетки				3-ядерные клетки					4-ядерные клетки			Полиядерные клетки
	МЯ	Ядерными протруз-ями	НПМ	МЯ	Ядерными протруз-ями		НПМ	МЯ		Ядерными протруз-ями		НПМ	МЯ	Ядерными протруз-ями	НПМ	МЯ	Ядерными протрузи-ями	НПМ
без S9
0	0,6	0	0	1,30	1,9		1,10	7,69		7,69		15,38	18,02	6,31	20,72	6,41	2,56	19,23
0,0000256	0,00	0	0	1,50	0,80		0,40*	26,67		0,00		13,33	10,00	1,11	28,89	6,67	6,67	13,33
0,000128	0,00	0	0	0,90	1,10		0,30*	16,67		16,67		0,00	13,79	8,62	29,31	7,02	1,75	14,04
0,00064	0,20	0	0	0,70	0,50		0,10*	3,13		3,13		6,25	5,74*	1,64	18,03	10,98	7,32	21,95
0,0032	0,00	0	0	1,70	1,80		3,40*	9,09		18,18		0,00	10,26	5,98	37,61*	13,73	17,65*	23,53
0,016	0,00	0	0	1,40	0,40		0,4	0,00		3,45		3,45	22,76	4,14	20,00	16,13	3,23	46,77*
0,08	0,40	0	0	0,70	0,80		0,8	6,25		3,13		9,38	11,11	6,11	10,56	16,67	7,14	33,33
0,4	0,20	0	0	1,50	1,40		1,5	20,00		0,00		20,00	12,77	5,32	23,40	21,28*	4,26	51,06*
2,0	0,00	0	0	1,50	0,60		1,7	7,41		7,41		18,52	19,30	3,51	21,93	18,18	4,55	4,55
в присутствии S9
0	0,40	0,2	0	0,90		2,7	0,8		0		0	5	0	0	0	0	0	0
0,0000256	0,00	0,00	0,4	2,10*		3,06	0,2		7,69		0,00	3,08	11,11	5,13	5,13	15,79	0	0,00
0,000128	0,00	0,00	0,2	2,10*		5,60*	0,5		6,90		0,00	8,62	7,44	9,09	14,88	9,38	0	9,38
0,00064	0,4	0	0	1,8		3,5	0,4		6,76		0,00	5,41	3,25	5,69	5,69	7,50	0	5,00
0,0032	0	0	0	0,4*		0,3*	0		10,87		2,17	2,17	0,69	0,00	5,52	7,32	0	2,44
0,016	0	0	0,2	2,5*		3,7	0,3		12,00		0,00	4,00	7,69	1,92	3,85	5,77	0	9,62
0,08	Токсический эффект

* различия с собственным контролем значимы при р≤ 0,5).

Характеристикой процессов пролиферации при культивировании клеток в условиях блока цитокинеза является доля клеток с разным количеством ядер в спектре ядерных клеток: (рис.3). Влияние S9 на продолжительность клеточного цикла хорошо видно по значительному увеличению долей 1-ядерных и 2-ядерных клеток, а также существенному снижению численности фракций, прошедших в присутствии ЦХВ более одного цикла деления (рис.3). Все эти эффекты свидетельствуют о торможении пролиферации клеток в

присутствии S9 по сравнению культурами без дополнительной метаболической активации.

Рисунок 3. Влияние S9 на пролиферацию клеток в контрольных культурах.

Анализ спектра клеточных популяций в культурах без S9 (рис.4. А) показал, что при экспозиции клеток к минимальной концентрации понсо 4R наблюдали торможение пролиферации, проявившееся по сравнению с контролем в увеличении численности неделящихся клеток и клеток, прошедших 1 митотический цикл, а также в уменьшении доли клеток, прошедших в присутствии ЦХВ два и более циклов деления. Дальнейшее повышение концентрации красителя вплоть до 0,08 мг/мл вызывало ускорение пролиферации: снижение доли неделящихся клеток и увеличение представленности клеток, прошедших 1 и более циклов деления после введения ЦХВ. При этом особое внимание следует обратить на повышение численности анеуплоидных 3-ядерных клеток. В то же время, присутствие красителя в высоких концентрациях тормозило процессы пролиферации. В сочетании с обнаруженным на высоких концентрациях красителя увеличением частоты полиядерных клеток с МЯ и НПМ это торможение можно отнести за счет активации процессов репарации.

Рисунок 4. Влияние понсо 4R на пролиферацию клеток.

А – экспозиция к понсо 4R;

Б - экспозиция к понсо 4R в присутствии S9

В спектре клеточных популяций культур, содержащих S9 и разные концентрации красителя (рис.4, Б), доли фракций 1-ядерных и 2-ядерных клеток были ниже уровня контроля S9 (P<0,02), причем для фракции 1-ядерных клеток дозовая зависимость носила четкий U-образный характер, свидетельствуя о об ускорении пролиферации при экспозиции к 0,0000256 – 0,00064 мг/мл понсо 4 R, а затем о ее торможении в присутствии более высоких концентраций. Важно, что представленность ускоренно делящихся 3-ядерных, 4-ядерных и полиядерных клеток была достоверно выше уровня контроля с S9, а также при экспозиции ко всем концентрациям красителя, не тормозящим пролиферацию (P<0,0001). Особое внимание следует обратить на численность фракции анеуплоидных 3-ядерных клеток – феномен, возникающий in vitro и обнаруживаемый в обследованиях людей, экспонированных к генотоксикантам [28, 29].

Таблица 3

Митотическая активность и апоптоз в культурах, экспонированных к понсо 4R без и в присутствии S9.

Концентрация понсо 4 R мг/мл	Частота апоптоза,%		Частота митоза,%
	без S9	с S9	без S9	с S9
0	0,80	13,20	3,40	0,40
2,56E-05	2,60*	0,40*	1,80	4,00*
0,000128	1,20	0,60*	0,80*	4,40*
0,00064	0,20	1,20*	2,00	2,80*
0,0032	1,80	1,00*	1,40*	2,20*
0,016	3,80*	1,40*	4,20	4,80*
0,08	0,00	Токсический эффект	5,20	Токсический эффект
0,4	0,20		0,60*
2	0,00		1,00*

* различия с собственным контролем значимы при р≤ 0,5).

В культурах без дополнительной метаболической активации, экспонированных к 2,56E-05 и 0,016 мг/мл красителя частота апоптоза достоверно превышала уровень контроля, что не наблюдалось при действии самых высоких концентраций (табл.3). Без добавления S9 частота клеток в состоянии митоза понижалась на концентрациях понсо 0,000128; 0,0032; 0,4 и 2 мг/мл. Интересно, что при исследовании меристемы корешков лука наблюдали снижение митотической активности под действием понсо 4 R в концентрациях 0,25-0,75 г/л через 24 и 48 часов после воздействия [30].

Введение S9 в контрольную культуру многократно повышало частоту апоптоза по сравнению со спонтанными эффектами, но снижало во всех культурах, содержавших понсо 4R. В этих условиях митотическая активность клеток во всех в культурах, кроме контрольной, была выше, чем без метаболической активации.

Таким образом, активизация митотической активности в присутствии S9 сопровождалась существенным снижением частоты апоптоза и эти процессы происходили в условиях индукции повреждений ДНК (табл.2). Следствием этого является закрепление повреждений в поколениях делящихся клеток с тенденцией к опухолевой трансформации клеток.

Обсуждение

В настоящей работе проведен цитомный анализ эффектов нестабильности генома человека при экспозиции in vitro к широкому диапазону концентраций понсо 4R. В задачи работы входило не только культивирование цельной венозной крови человека при экспозиции к большому диапазону концентраций красителя в условиях цитокинетического блока, но и оценка влияния на выход эффектов системы метаболической активации гепатоцитов крыс S9.

В результате проведенных исследований получены две группы данных, демонстрирующих влияние понсо 4R (с учетом способа культивирования) на: 1) индукцию повреждений ДНК в разных популяциях делящихся клеток; 2) пролиферативную активность и спектр клеточных популяций; 3) митотическую активность и апоптоз.

Учет генетических повреждений в клетках во всем диапазоне изученных концентраций понсо 4R показал, что значимое превышение над контролем проявляли преимущественно клетки с НПМ, в то время как при экспозиции к красителю в присутствии S9 – клетки с МЯ (табл.2). При этом проявление генотоксических эффектов (МЯ, НПМ) в культурах, содержавших S9, было менее выражено, чем в культурах без метаболической активации. Достоверные различия в эффектах обнаружены для 4-ядерных и полиядерных клеток (Р=0,003 и 0,001 соответственно), а также по суммарным частотам всех делящихся (Р<0,000) и всех ускоренно делящихся (прошедших 2 и более циклов в присутствии ЦХВ) клеток (Р<0,000) начиная с концентрации 0,00064 мг/мл.

Совокупность клеточных популяций в каждой культуре в условиях цитокинетического блока (без учета цитотоксического действия) можно представить как аналог сообщающихся сосудов: чем меньше доля неделящихся 1-ядерных клеток, тем больше клеток вступает в митоз, в результате чего в условиях цитокинетического блока образуются клетки с двумя и большим числом ядер. При этом каждое деление клетки делает явными скрытые повреждения, в нашей работе связанные с образованием МЯ и НПМ, причем чем больше циклов деления прошли клетки в присутствии ЦХВ, тем больше скрытых повреждений может проявиться. Поэтому с учетом всех клеточных популяций в каждой культуре без S9 мы подсчитали количество всех клеток, несущих МЯ и НПМ и сравнили эти значения с обнаруженными в культурах с метаболической активацией. Статистический анализ по критерию Манна-Уитни показал достоверные различия между соответствующими дозовыми кривыми (Р=0,008).

Анализ эффектов пролиферации в культурах, экспонированных к одним и тем же концентрациям понсо 4R в присутствии S9 и без нее (рис.5, попарное сравнение), показали, что S9 в отсутствии красителя существенно снижала пролиферативную активность клеток. Торможением пролиферации (по сравнению с контролем) проявилось и действие минимальной из изученных концентраций красителя (увеличении частоты неделящихся клеток и уменьшении клеточности фракции ускоренно делящихся клеток). Однако совместное ведение в культуру S9 и минимальной концентрации понсо 4R пролиферацию ускоряло, о чем свидетельствует значимое уменьшение численности фракции неделящихся клеток и увеличение объема всей фракции ускоренно делящихся клеток (P=0,000), в то время как без S9 этот эффект проявился при экспозиции культур к понсо 4R 0,00064 мг/мл (Р=0,025). При дальнейшем увеличении концентрации красителя спектр клеточных популяций изменился (причем точкой перелома тенденции в культурах без S9 стала концентрация понсо 4R 0,08 мг/мл, а с S9 - 0,00064 мг/мл) – спектр клеточных популяций в культурах без и в присутствии S9 различался только достоверно увеличенной долей 3-ядерных клеток (P=0,002), что можно рассматривать и как индукцию анеуплоидии.

Рисунок 5. Попарное сравнение спектров клеточных популяций в культурах крови человека, экспонированных к понсо 4R без и в присутствии S9.

Примечание:

   - Различия между способами культивирования по частоте 3-ядерных клеток в спектре клеточных популяций значимы (критерий χ²)

Стрелками показаны значимые различия (критерий χ²) между частотами клеток во фракциях, прошедших одинаковое количество циклов деления при разных способах культивирования: (стрелка показывает направление изменений, ее цвет – фракцию клеток, для которой эти изменения значимы)

 

Экспозиция клеток к 0,0032 мг/мл понсо 4R вызывала торможение пролиферации по сравнению с контролем, а введение S9 в эту культуру пролиферацию ускоряло (P<0,001), что видно на рис.5 по увеличению численности фракции ускоренно делящихся клеток и, в частности увеличению доли клеток, прошедших 2 цикла деления (3х- P<0,03 и 4-ядерных, Р<0,05). То есть, влияние минимальной концентрации красителя проявлялось как торможение пролиферации, а введение S9 совместно с красителем пролиферацию клеток ускоряло. Важно, что при повышении концентраций понсо 4R от 0,00064 мг/мл в большинстве фракций делящихся клеток такой эффект выявлен не был, а дальнейшее увеличение концентрации красителя в присутствии S9 тормозило пролиферацию клеток. То есть, анализ спектра клеточных популяций в зависимости от концентрации красителя выявил U-образное дозозависимое изменение пролиферативной активности клеток в культуре, что следует учитывать при нормировании красителя.

Ускорение пролиферации клеток, несущих генетические повреждения, связано с блоком апоптоза и сокращением продолжительности клеточного цикла. Это опасно, потому что феномен связан с закреплением имеющихся ранее или вновь образовавшихся повреждений в ряду поколений делящихся клеток, что, в свою очередь, ассоциировано с развитием новообразований и ускорением старения.

Следует обратить особое внимание на достоверное повышение частот анеуплоидных 3-ядерных клеток во всех культурах, содержащих S9, над уровнями, выявленными без дополнительной метаболической активации (P<0,03). Важно, что в культурах крови здоровых детей и взрослых 3-ядерные клетки всегда присутствуют в спектре клеточных популяций, но их доля обычно не превышает 10 % пула клеток второго митоза, а частота не зависит от возраста доноров, но – что особенно важно - уменьшается с увеличением уровня апоптоза. [28, 29]. Это доказывает, что причина образования 3-ядерных клеток в культуре крови - генотоксическое воздействие. Поэтому представляется логичным предположить возможность использования 3-ядерных клеток в качестве одного из индикаторов генотоксического эффекта и, вероятно, опухолевой трансформации клеток.

Не исключено, что метаболизирующая активность S9 в нашем эксперименте реализована не только за счет трансформации молекул красителя, но еще (и/или преимущественно) за счет химических превращений примесей, содержащихся в исследованном образце. С нашей точки зрения это означает, что для разрешения применения ПК, содержащих примеси, следует разработать и ввести специальный регламент, основой которого может стать экспериментальный подход, представленный в настоящем исследовании, а также в нашей работе, опубликованной ранее [31].

В настоящей работе, также как при оценке генотоксичности пищевого красителя тартразина [31], мы обнаружили снижение уровня апоптоза в присутствии S9 во всех использованных  концентрациях, причем контрольный уровень был приблизительно таким же высоким, как и при экспозиции к понсо 4R. Известно, что изменения нормального уровня апоптоза, также как сбои в работе отдельных его механизмов, могут вызывать рак, нейродегенеративные заболевания, воспаление, а также несколько типов аутоиммунных расстройств, что существенно повышает канцерогенный и другие ассоциированные риски [32-34], триггером которых является образование генетических повреждений. Поэтому следует считать резкое снижение частоты апоптоза в присутствии понсо 4 R и S9 одним из доказательств высокой вероятности индукции серьезных заболеваний.

Заключение

В настоящей работе выявлены генотоксические эффекты приобретенного в розничной сети образца понсо 4R (тринатрий (8Z)-7-оксо-8-[(4-сульфонатонафталин-1-ил) гидразинилиден] нафталин-1,3-дисульфоната), и содержащего - по спецификации - 83,1% красящих веществ. Прежде всего, поэтому нельзя сказать, с чем именно связаны обнаруженные эффекты - с понсо 4R, или с примесями.

Важно что, для понсо 4R на уровне допустимой суточной дозы ФАО/ВОЗ (в нашем случае это 0,00064 мг/кг) вне зависимости от присутствия системы дополнительной метаболической активации обнаружено достоверное увеличение уровня анеуплоидии (по частоте 3-ядерных клеток), а также - только в присутствии S9 - снижение уровней апоптоза на фоне увеличения митотической активности. Кроме того, в условиях дополнительной метаболической активации превышение уровня контроля по частоте 2-ядерных клеток с МЯ (золотой стандарт оценки генотоксичности в микроядерном тесте на культуре клеток крови млекопитающих) обнаружено уже на самых низких из использованных концентраций красителя, которые в 156 и 31 раз ниже норматива для человека, утвержденного ФАО/ВОЗ в 2009 г. В то же время, технический регламент изготовления продуктов питания на территории РФ (весовые нормы внесения красителя) остается без изменений, независимо от корректировки допустимой суточной дозы для человека [2]. Более того, генетическая безопасность в РФ оценивается только для пищевых продуктов и пищевых добавок, полученных с использованием генетически модифицированных микроорганизмов [35]. С нашей точки зрения, это существенный недостаток системы оценки генетической безопасности продуктов питания. Поэтому в план исследования мы внесли несколько изменений по сравнению с другими исследованиями: более чем на 2 порядка снизили минимальную из исследованных концентраций красителя по сравнению с допустимой суточной дозой, разрешенной ФАО/ВОЗ, использовали систему метаболической активации гепатоцитов крыс, а также, помимо повреждений в 2-ядерных клетках (МЯ, НПМ и ядерных протрузий), анализировали спектр клеточных популяций и повреждения в каждом типе клеток, присутствующих в культуре, а также митотическую активность и частоту апоптоза. Это позволило продемонстрировать высокую вероятность возникновения неучитываемых обычно генотоксических эффектов.

Проведенный эксперимент значительно сложнее в постановке и требует существенного увеличения времени анализа, но его результаты имеют серьезные преимущества, поскольку позволяют повысить чувствительность метода оценки генетической безопасности ПК и продуктов питания, в которых они используются.

About the authors

Tatyana A. Nikitina

Centre for Strategic Planning and Management of Biomedical Health Risks

Author for correspondence.
Email: TNikitina@cspmz.ru
ORCID iD: 0000-0003-0866-5990
SPIN-code: 9106-5076

biologist

Russian Federation, Moscow

Mariya A. Konyashkina

Centre for Strategic Planning and Management of Biomedical Health Risks

Email: MKonyashkina@cspmz.ru
ORCID iD: 0000-0002-8319-1329
SPIN-code: 7559-9045
Scopus Author ID: 8142882800

Cand. Sci. (Biol.), Research Associate

Russian Federation, Moscow

Faina I. Ingel

Centre for Strategic Planning and Management of Biomedical Health Risks

Email: FIngel@cspmz.ru
ORCID iD: 0000-0002-2262-6800
SPIN-code: 1013-7006
Scopus Author ID: 57205760994
ResearcherId: C-8899-2014

Dr. Sci. (Biol.), Main Researcher

Russian Federation, Moscow

Lyudmila V. Akhaltseva

Centre for Strategic Planning and Management of Biomedical Health Risks

Email: LAhalceva@cspmz.ru
ORCID iD: 0000-0002-3619-3858
SPIN-code: 7049-0003
Scopus Author ID: 57138478700
ResearcherId: I-8204-2018

Cand. Sci. (Biol.), Senior Researcher

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files