Assessment of metabolic activity and energy supply of peripheral blood lymphocytes

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Метаболическая активность с превалированием тех или иных путей наработки аденозинтрифосфата (АТФ) — аэробного гликолиза, глутаминолиза, окислительного фосфорилирования — определяет функционирование Т-клеток, обеспечивает развитие всех этапов Т-клеточного адаптивного ответа: от реагирования до формирования клеток памяти и исчерпания клеточного пула. В период дифференцировки и активной пролиферации Т-клеток для удовлетворения их возросших энергетических потребностей происходит так называемое метаболическое перепрограммирование [1], которое характеризуется повышенным поглощением нутриентов, высоким уровнем аэробного гликолиза, увеличением глутаминолиза, делением и слиянием митохондрий [2–4]. В процессе Т-клеточной экспансии наблюдается перераспределение митохондрий в иммунные синапсы и локальное увеличение концентрации АТФ [5]. Известно, что находящиеся в метаболическом покое наивные Т-клетки для поддержания своего функционального состояния при минимальном поглощении нутриентов преимущественно используют высокоэффективный по продукции АТФ путь окислительного фосфорилирования (ОХРНОS, oxidative phosphorylation) в митохондриях [3]. В противоположность этому антиген-активированные клетки переходят на максимальное поглощение нутриентов с активацией аэробного гликолиза [6], который является более быстрым, но менее эффективным по сравнению с ОХРНОS путём продукции АТФ. Несмотря на сокращение участия в производстве энергии, роль митохондрий в активированных Т-клетках остаётся значимой для обеспечения критически важных в период роста и пролиферации процессов синтеза липидов, белков, формирования одноуглеродных группировок, поддержания внутриклеточного гомеостаза кальция и других [7, 8]. Кроме того, митохондрии вовлечены в метаболическую перестройку и координируют дифференцировку Т-клеток посредством ключевых метаболитов и побочных продуктов обмена. Так, пролиферативная активность Т-клеток стимулируется активными формами кислорода (ROS, reactive oxygen species), образующимися в процессе тканевого дыхания [9]. Нарастание митохондриального пула характерно для Т-клеток памяти, которым для функционирования требуется высокая активность митохондрий [10, 11].

Контроль метаболической активности Т-клеток осуществляется с помощью механизмов внутриклеточного сигналинга. К ним относятся регуляция гликолиза с помощью гипоксией индуцируемого фактора 1 (HIF-1, hypoxia inducible factor 1) и контроль работы митохондрий с участием белка с деацетилазной активностью сиртуина 3 (sirtuin 3, SIRT3). Так, SIRT3 влияет на проницаемость митохондриальной мембраны, стимулирует работу цикла трикарбоновых кислот и цепи переноса электронов (ЕТС, electron transport chain), повышает эффективность ОХРНОS [12]. Путь HIF-1-сигналинга способствует повышению экспрессии генов белков-участников гликолиза: мембранных транспортёров глюкозы (Glut1, 4) [13], многих гликолитических ферментов [14], монокарбоксилатного переносчика 4 [15], что ведёт к повышению интенсивности гликолитического потока за счёт увеличения поступления глюкозы в клетку, скорости её окисления до пирувата, превращения пирувата в лактат и, наконец, выхода лактата из клетки. Интересно, что при негативном влиянии на митохондриальную продукцию АТФ в процессе ОХРНОS HIF-1 оказывает позитивный эффект в отношении пластической роли митохондрий в период пролиферативной активности Т-клеток [16, 17]. Механизмы регулирования и варианты взаимодействия путей внутриклеточного сигналинга, роль ключевых метаболитов и молекулярных сенсоров в функционировании лимфоцитов периферической крови в настоящее время активно изучаются.

Целью исследования стало определение метаболической активности и энергообеспеченности лимфоцитов периферической крови у практически здоровых северян путем установления внутриклеточного содержания HIF-1α, SIRT3 и АТФ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Участниками исследования стали 39 волонтёров — практически здоровых жителей Архангельска и области, среди которых было 16 мужчин и 23 женщины (возраст — от 23 до 62 лет). Все волонтёры дали добровольное информированное согласие на участие в обследовании, которое проводилось в соответствии с требованиями Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации об этических принципах проведения медицинских исследований (2013). У волонтёров утром натощак забирали венозную кровь, далее выделяли лимфоцитарную фракцию крови, в которой определяли исследуемые параметры.

CD-типирование лимфоцитов (CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺, CD71⁺) проводили методом непрямой иммунопероксидазной реакции (реактивы производства ООО «Сорбент», Россия). В лизате лимфоцитов определяли содержание HIF-1α и SIRT3 методом твёрдофазного иммуноферментного анализа на автоматическом иммуноферментном анализаторе Evolis (BioRad, Германия) с использованием реагентов фирмы Cloud-Clone (США). Перед лизированием предварительно определяли концентрацию лимфоцитов во взвеси на автоматическом анализаторе XS 500i (Sysmex Corporation, Япония). Лизис проводили с помощью лизирующего раствора производства Cloud-Clone (США) согласно прилагаемой к набору инструкции. Концентрацию АТФ измеряли на люминометре с использованием люциферин-люциферазной реакции (набор реагентов производства «Люмтек», Россия).

Статистическую обработку результатов исследования выполняли в программе Statistica 10.0 (StatSoft Inc., США). В модуле «многомерный разведочный анализ» выделяли кластерные группы с использованием метода k-средних. В модуле «описательные статистики» вычисляли средние значения (M), стандартное отклонение (SD), для проверки данных на нормальность распределения использовали критерий нормальности Колмогорова–Смирнова и Лиллиефорса. При распределении, близком к нормальному, для сравнения результатов вычисляли t-критерий Стьюдента, различия считали статистически значимыми при p <0,05. В модуле «графика» вычерчивали 3М-графики поверхностей (в осях XYZ) и последовательные 2М-графики для нескольких показателей.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Был установлен характер флуктуаций значений определяемых показателей с помощью построенных последовательно и без перекрытия 2М-графиков, которые включали все определяемые случаи (рис. 1). Отображённый результат наложения графиков отражает однонаправленность колебаний содержания клеток CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺, CD71⁺ и концентраций внутриклеточных регуляторов (HIF-1α, SIRT3). Визуализация зависимости от уровня регуляторов метаболизма изменений количества лимфоцитов с рецепторами СD3, СD4, СD8, СD71 была получена с помощью статистических 3М-графиков поверхностей, построенных в осях XYZ, где Х — концентрация SIRT3, Y — концентрация HIF-1α и Z — содержание лимфоцитов (рис. 2). Как видно из графиков, наибольшие количества лимфоцитов с каждым из определяемых дифференцировочных антигенов наблюдаются на высоте концентраций регуляторов метаболизма, при этом график, отражающий содержание клеток СD4⁺ (рис. 2, b), имеет сдвиг высоты площади поверхности в сторону оси Y (HIF-1α), что указывает на выраженную зависимость от гликолитического пути метаболизма.

 

Рис. 1. Последовательные/наложенные графики переменных HIF-1α, SIRT3, CD3+, CD4+, CD8+, CD71+.

Fig. 1. Sequential/overlayed plots of variables HIF-1α, SIRT3, CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺, CD71⁺.

 

Рис. 2. XYZ-графики зависимости содержания лимфоцитов с рецепторами (CD) от уровня метаболических регуляторов, где X — SIRT3, Y — HIF-1α, Z — CD3+(a), CD4+(b), CD8+(c), CD71+(d).

Fig. 2. XYZ-graphs of the dependence of the lymphocytes with receptors (CD) content on the level of metabolic regulators, where X — SIRT3, Y — HIF-1α, Z — CD3⁺(a), CD4⁺(b), CD8⁺(c), CD71⁺(d).

 

Проведённый кластерный анализ с использованием метода k-средних позволил выделить две группы из числа обследуемых, которые имели статистически значимые различия по всем изучаемым иммунным показателям и HIF-1α, в то время как в отношении SIRT3 таких различий выявлено не было (табл. 1). Следует отметить, что в группе 1 (n=15) при статистически более низких по сравнению с группой 2 (n=24) количественных показателях лимфоцитарного пула рассчитанное отношение HIF-1α к SIRT3 было в 1,9 раза больше, как и концентрация внутриклеточного АТФ. Последняя в среднем составила 3,71 (1,319) и 1,25 (0,387) мкмоль/10⁶ клеток (р <0,0001) в группах 1 и 2 соответственно. Зависимость между соотношением HIF-1α/SIRT3 и АТФ отображена в виде пропорций на круговой диаграмме с выносом анализируемых значений на вторую диаграмму для акцентированной визуализации полученных между группами различий (рис. 3). Эта зависимость иллюстрирует, что с изменением соотношения HIF-1α/SIRT3 согласованно меняется количество АТФ (повышается или снижается).

 

Таблица 1. Значения определяемых показателей в выделенных кластерным анализом группах

Table 1. Values of determined indicators in groups identified by cluster analysis

Показатель Parameter	Группа 1 (n=15), M (SD) Group 1 (n=15), M (SD)	Группа 2 (n=24), M (SD) Group 2 (n=24), M (SD)	p
Лимфоциты, ×109 кл./л | Lymphocytes, ×109 cells/L	1,45 (0,228)	2,26 (0,367)	<0,0001
CD3, ×109 кл./л | cells/L	0,93 (0,121)	1,54 (0,293)	<0,0001
CD4, ×109 кл./л | cells/L	0,48 (0,129)	0,81 (0,234)	<0,0001
CD8, ×109 кл./л | cells/L	0,49 (0,087)	0,85 (0,221)	<0,0001
CD71, ×109 кл./л | cells/L	0,49 (0,123)	0,87 (0,241)	<0,0001
HIF-1α, нг/106 кл. | cells/L	1,64 (0,714)	1,13 (0,221)	0,0046
SIRT3, нг/106 кл. | cells/L	0,22 (0,169)	0,28 (0,314)	0,5234

 

Рис. 3. Количественные изменения АТФ (%) в зависимости от соотношения HIF-1α/SIRT3.

Fig. 3. Quantitative changes in ATP (%) depending on the ratio of HIF-1α/SIRT3.

 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Транскрипционный фактор HIF-1 — центральный регулятор метаболической перестройки, лежащей в основе программы формирования Т-клеточных субпопуляций [18]. HIF-1α является зависящей от кислорода субъединицей HIF-1, которая активно экспрессируется и остаётся стабильной при гипоксии. В условиях нормоксии происходит разрушение HIF-1α в протеасомах, так как при достаточности кислорода аминокислотные остатки пролина в полипептидной цепи HIF-1α гидроксилируются под действием кислород-чувствительной пролил-4-гидроксилазы (PHD, prolyl-4-hydroxylase domain) и это способствует убиквитин-опосредованной протеасомной деградации HIF-1α [19]. Однако для иммунных клеток из-за специфики их метаболизма возможна гипоксия-независимая наработка и стабилизация HIF-1α, или так называемая псевдогипоксия [16]. В разной степени экспрессии HIF-1α способствуют стимуляция Т-клеточного рецептора (T-cell receptor, TCR), активация киназного каскада PI-3K/Akt/mTOR, STAT3-сигналинга, транскрипционных факторов NF-kB, AP-4, с-Myc [20–22]. Так, mTOR, например, регулирует трансляцию HIF-1α mRNA [23]. Стабилизация HIF-1α в активированных Т-клетках может осуществляться через метаболическую регуляцию PHD с помощью сукцината [24] и ROS [25]. В частности, в ответ на TCR-стимуляцию повышается активность анаплеротического пути образования сукцината, который служит ингибитором PHD. Сукцинат также может продуцироваться в катализируемой PHD реакции с использованием α-кетоглутарата и по принципу отрицательной обратной связи ингибировать PHD [19]. ROS могут приводить к инактивации PHD, окисляя атом железа в его активном центре [26]. Кроме того, ROS весьма значимы для перепрограммирования активированных Т-клеток. Снижение ROS или нарушение передачи ROS-сигналинга ослабляет активацию и клональную экспансию Т-клеток [27], в то время как продукция ROS стимулирует Т-клеточную пролиферацию [9]. Установлено, что согласованно с увеличением уровня ROS повышается экспрессия HIF-1α, который крайне важен для метаболически активных эффекторных Т-клеток, интенсивно использующих аэробный гликолиз [18, 28].

Ферментативное ацетилирование/деацетилирование белков является одним из общих путей посттрансляционной модификации и влияния на клеточный метаболизм. Деацетилазы семейства сиртуинов (SIRTs) участвуют в регуляции метаболизма, способствуют функционированию и выживаемости клеток [29]. SIRT3 положительно регулирует митохондриальный биогенез через активацию факторов пролиферации PPAR-α и PGC-1α; стимулирует цикл трикарбоновых кислот, повышая ферментативную активность ацетил-СоА синтетазы 2 и изоцитратдегидрогеназы; увеличивает OXPHOS, активируя работу комплексов I, II, III ЕТС; способствует глутаминолизу, позитивно влияя на глутаматдегидрогеназу [12, 29]. В то же время SIRT3 действует как супрессор фактора транскрипции HIF-1α, подавляя ROS-опосредованную стабилизацию HIF-1α [12].

Полученные нами данные показывают, что в выделенных с помощью кластерного анализа группах концентрация SIRT3 в лимфоцитах периферической крови не имела статистически значимых различий, в то время как содержание HIF-1α статистически значимо различалось. Это отражает различие в метаболической активности лимфоцитов, а именно в выраженности гликолиза. Интересен тот факт, что более высокий уровень HIF-1α наблюдался в группе с более низкими значениями показателей лимфоцитарного пула, в частности клеток с поверхностными антигенами CD3, CD4, CD8, CD71 (CD3 — общий Т-клеточный маркёр активации, связанный с антигенраспознающим рецептором, CD4 — маркёр клеток хелперов, CD8 — маркёр цитотоксических клеток, CD71 — маркёр активированных клеток, рецептор трансферрина, обеспечивающий поступление в клетку ионов железа, без которого невозможна пролиферация Т-клеток). Повышение уровня HIF-1α можно рассматривать как вариант ответа на снижение количества Т-клеток, для которых HIF-1 выступает основным модератором метаболического сдвига при их активации. О выраженности гликолитической активности можно судить по увеличению соотношения HIF-1α/SIRT3, что ведёт к росту количества АТФ, обеспечивая Т-клеткам необходимый энергетический уровень.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведённого исследования установлено, что в группе практически здоровых людей могут наблюдаться внутригрупповые статистически значимые различия в концентрации взаимосвязанных показателей лимфоцитарного пула и метаболической активности лимфоцитов. В частности, группа обследованных, имеющих более низкое общее количество лимфоцитов и содержание лимфоцитов с рецепторами CD3, CD4, CD8, CD71, характеризовалась статистически значимым более высоким уровнем регулятора гликолиза HIF-1α относительно группы сравнения и не имела статистически значимых различий по содержанию SIRT3, контролирующего работу митохондрий. Фактор транскрипции HIF-1 играет весьма значимую роль для отдельных субпопуляций Т-клеток, в особенности эффекторных, способствуя метаболизму с преобладанием гликолиза. Важным в оценке направленности метаболизма является изменение соотношения HIF-1α/SIRT3, по возрастанию которого можно судить о повышении гликолитической активности. Доминирование гликолиза в метаболизме лимфоцитов отражается на их энергообеспеченности, оказывая существенное влияние на функционирование и развитие субклеточных линий.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ / ADDITIONAL INFORMATION

Вклад авторов: О.В. Зубаткина — концепция, анализ и интерпретация данных, подготовка окончательного варианта статьи; Л.К. Добродеева — концепция и дизайн исследования, окончательное утверждение присланной в редакцию рукописи; А.В. Самодова — получение, анализ и интерпретация данных, подготовка первого варианта статьи; С.Д. Круглов — получение и анализ данных, статистическая обработка результатов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Authors’ contribution: O.V. Zubatkina — conception, analysis and interpretation of data, consolidation and final drafting of article; L.K. Dobrodeeva — the concept and design of the study, the final approval of the manuscript sanded to the editors; A.V. Samodova — obtaining, analyzing and interpretation of data preparation of the first version of the article; S.D. Kruglov — obtaining and analyzing of data, statistical processing of results. All authors confirm that their authorship meets the international ICMJE criteria (all authors have made a significant contribution to the development of the concept, research and preparation of the article, read and approved the final version before publication).

Финансирование. Исследование выполнено в рамках темы НИР лаборатории экологической иммунологии института физиологии природных адаптаций ФИЦКИА имени академика Н.П. Лавёрова Уро РАН, № гос. регистрации 122011300377-5.

Funding sources. The study was carried out under the theme of the scientific research of ecological immunology laboratory of Institute of Physiology of Natural Adaptations of N. Laverov Federal Center for Integrated Arctic Research of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences. State registration number 122011300377-5.

Конфликт интересов. Авторы подтверждают отсутствие конфликта интересов.

Competing interests. The authors declare no competing interests.

About the authors

Ol'ga V. Zubatkina

N. Laverov Federal Center for Integrated Arctic Research

Author for correspondence.
Email: ozbiochem@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-5039-2220
SPIN-code: 1581-5178

MD, Dr. Sci. (Biol.), professor

Russian Federation, Arkhangelsk

Lilija K. Dobrodeeva

N. Laverov Federal Center for Integrated Arctic Research

Email: dobrodeevalk@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5080-6502
SPIN-code: 4518-6925
Russian Federation, Arkhangelsk

Anna V. Samodova

N. Laverov Federal Center for Integrated Arctic Research

Email: annapoletaeva2008@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-9835-8083
SPIN-code: 6469-0408
Russian Federation, Arkhangelsk

Sergej D. Kruglov

N. Laverov Federal Center for Integrated Arctic Research

Email: stees67@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4085-409X
SPIN-code: 2532-9912
Russian Federation, Arkhangelsk

References

Supplementary files