INFLUENCE OF AIR ENVIRONMENT CHEMICAL IMPUTITIES ON EXPRESSION OF TOLL-LIKE RECEPTORS AND CYTOKINE LEVELS OF ADOLESCENTS

Full Text

Окружающая среда Более 50 % населения России проживает в условиях умеренного и среднего уровня загрязнения атмосферного воздуха. Выбросы предприятий нефтеперерабатывающей, химической промышленности и теплоэнергетики, расположенных в Иркутской области, являются причиной высокого уровня загрязнения атмосферного воздуха на данных территориях. В настоящее время исследованиями российских и зарубежных ученых доказано влияние на иммунную систему таких поллютантов, как формальдегид, бенз(а)пирен, фенол, соединения хрома, цинка, никеля, диоксид азота, которые определяются в атмосферном воздухе промышленных центров [2, 6-11, 19]. Иммунная система является ключевой в формировании адаптационных реакций и наиболее чувствительной к воздействию факторов окружающей среды [1, 15]. Запуск иммунного ответа при воздействии бактерий, вирусов и других факторов осуществляют толл-подобные рецепторы (TLR), стимулирующие продукцию провоспалительных цитокинов (интерлейкины, интерфероны) [3, 4, 16]. Следовательно, при воздействии химических веществ, загрязняющих воздушную среду, происходит изменение показателей, участвующих в адаптационном процессе. Предполагаем, что персонифицированный подход к оценке риска и ответной реакции организма на внешнее воздействие позволит установить связи между уровнями химической ингаляционной нагрузки и ответными изменениями иммунологических показателей у населения в рамках одномоментного исследования на изучаемой территории. Цель исследования - оценить уровень экспрессии толл-подобных рецепторов и содержания цитокинов у детей подросткового возраста с различным риском формирования нарушений иммунной системы, обусловленным индивидуальной ингаляционной химической нагрузкой. Методы Индивидуальную ингаляционную химическую нагрузку на организм подростков оценивали с использованием информации о содержании примесей в атмосферном воздухе (данные Гидрометеослужбы за период 2003-2014 гг.) и в воздухе жилых и учебных помещений (данные лаборатории аналитической экотоксикологии и биомониторинга ФГБНУ «Восточно-Сибирский институт медико-экологических исследований» (ВСИМЭИ) за 2013-2014 гг., исследования выполнены к.б.н. Лисецкой Л. Г. и к.б.н. Тараненко Н. А.). Отбор проб воздуха в жилых и учебных помещениях осуществляли в весенний период, их количество составило 55 и 47 соответственно. При анализе качественного состава атмосферного воздуха установлено наличие среди химических соединений, присутствующих в воздушной среде изучаемых территорий, веществ, оказывающих влияние на иммунную систему: бенз(а)пирена, диоксида азота, формальдегида, соединений хрома, цинка и никеля [5, 9, 10, 12, 21]. Рассчитаны индексы опасности с уче том всех вышеперечисленных веществ. За основу для расчета суточных доз при ингаляционном воздействии веществ была использована формула, приведенная в Руководстве по оценке риска для здоровья населения при воздействии химических веществ, загрязняющих окружающую среду [10]. В связи с многомаршрутным воздействием токсикантов рассчитаны референтные дозы с использованием референтных концентраций [10] и факторов экспозиции с учетом возраста и маршрутов воздействия. Для расчета индекса опасности формирования патологии иммунной системы были использованы данные антропометрических и спирометрических исследований, проведенных при медицинском осмотре врачами ФГБНУ ВСИМЭИ, а также сведения об организации учебного процесса и отдыха учащихся (данные анкетирования, выполненного к.м.н. Мыльниковой И. В., ФГБНУ ВСИМЭИ). Проведено поперечное исследование. Обследованы 244 подростка (123 юноши и 121 девушка) в возрасте 11-17 лет (средний возраст (13,95 ± 0,11) года), постоянно проживающие в единых климатогеографических условиях юга Восточной Сибири, в зонах с умеренным и средним уровнем загрязнения атмосферного воздуха. Критериями включения в обследование являлись: отсутствие острых респираторных инфекций, обострения соматических заболеваний на момент обследования и в течение 2 недель до него, I - II группы здоровья. Для проверки на соответствие критериям в медицинском обследовании школьников, которое проводили в ранневесенний период, принимали участие аллерголог, педиатр, оториноларинголог, были использованы данные анкетирования родителей о состоянии здоровья детей и информация из их медицинских карт, а также изучены показатели общего анализа крови и мочи, определены уровни антистрептолизина О и альфа-1-антитрипсина в сыворотке крови. Исследование проведено после подписания родителями или законными представителями школьников информированного согласия. Забор крови у подростков производился натощак. Методом полуколичественного иммуноферментного анализа в сыворотке крови было определено содержание интерлейкинов-2 и -10 (IL-2, IL-10), альфа-, гамма-интерферонов (a-INF, ү-INF) соответствующими тест-системами («Вектор-Бест», Россия). Уровень экспрессии толл-подобных рецепторов-2 и -4 (TLR-2, TLR-4) лейкоцитов крови определяли методом полимеразной цепной реакции с детекцией накопления продуктов реакции в режиме реального времени (Real-Time BioRad CFX-96, USA) с использованием специфических праймеров. В качестве эндогенного внутреннего контроля был выбран ген «домашнего хозяйства» GAPDH. Стандартизация уровня экспрессии мРНК TLR осуществлялась посредством нормализации количества изучаемых транскриптов к общему количеству кДНК в пробе с помощью отношений TLR-2/GAPDH и TLR-4/ GAPDH. Экспрессию генов оценивали в относительных единицах (ОЕ). 11 Окружающая среда Экология человека 2018.03 Для обработки результатов использовали пакет прикладных программ Statistica 6.0. Результаты исследования представлены в виде медианы (Me) и ин-терквартильного диапазона (LQ-UQ) для показателей иммунного статуса, среднего арифметического и его ошибки (M ± m) - для характеристики загрязнения воздушной среды. Нулевую гипотезу об отсутствии различий между тремя независимыми группами проверяли методом Kruskel-Wallis ANOVA. Последующие попарные сравнения групп осуществляли непараметрическим U-критерием Mann-Whitey с учетом поправки Бонферрони. Корреляционный анализ выполняли с использованием ранговой корреляции Sperman (r). Результаты Установлено, что содержание поллютантов в атмосферном воздухе изучаемых территорий и в помещениях значительно различалось (табл. 1). В атмосферном воздухе территорий среднегодовые концентрации формальдегида, превышающие среднесуточную ПДК в 3 раза, выявлены только в одном районе. Таблица 1 Среднегодовое содержание химических соединений в атмосферном воздухе и воздухе помещений, мг/м3 (M ± m) Вещество Атмосферный воздух Воздух помещений Диоксид серы 0,009±0,001 0,025±0,007 Оксид углерода 0,146±0,012 0,110±0,014 Взвешенные вещества 0,083±0,011 0,111±0,035 Диоксид азота 0,028±0,004 0,008±0,001 Формальдегид 0,002±0,001 0,005±0,001 В связи с особенностями загрязнения воздушной среды в зонах проживания, а также временем, которое школьники проводили в помещениях и на открытом воздухе, индивидуальная химическая нагрузка у обследуемых различалась. Это обусловило значительный разброс значений коэффициентов опасности (HQ) и индексов опасности (HI) нарушений в иммунной системе. Расчет HQ воздействия химических веществ, содержащихся в воздушной среде, позволил установить, что наибольшие значения были характерны для формальдегида (табл. 2.). Так, максимальное значение HQ формальдегида составило 2,95. Индивидуальные HQ, превышающие 1, были также выявлены для диоксидов азота и серы. Таблица 2 Коэффициенты опасности воздействия химических соединений на иммунную систему Вещество Me (LQ-UQ) Min Max Формальдегид 1,69 (1,57-1,79) 0,48 2,95 Диоксид азота 0,94 (0,82-1,69) 0,47 1,80 Диоксид серы 0,53 (0,35-0,58) 0,12 1,26 Цинк 0,00 (0,00-0,01) 0,00 0,02 Никель 0,00 (0,00-0,002) 0,00 0,004 Хром 0,00 (0,00-0,00) 0,00 0,00 Поскольку формальдегид, диоксид азота и серы, которые оказывают наибольшее влияние на формирование HI нарушений иммунной системы, присутствуют как в атмосферном воздухе, так и в помещениях, определенный интерес представляла оценка вклада загрязнителей воздуха помещений в HQ. Был установлен следующий вклад приоритетных поллютантов: диоксида серы 17 %, диоксида азота 30 %, формальдегида 50 %. Для изучения влияния химической нагрузки, обусловленной загрязнением воздушной среды, все обследованные были сгруппированы в соответствии с HI формирования патологии иммунной системы. В группу I вошли 39 подростков (19 юношей и 20 девушек, средний возраст (13,53 ± 0,27) года) с HI < 2. Группу II составили 74 человека (31 юноша и 43 девушки, средний возраст (14,35 ± 0,22) года) с 2 < HI < 3. Группа III состояла из 131 школьника (63 юноши, 68 девушек, средний возраст (13,82 ± 0,16) года) с HI > 3. Среднегрупповые значения HI для I-III групп составили 1,56 ± 0,001, 2,51 ± 0,001 и 3,42 ± 0,011 соответственно. Следует отметить, что для группы с низким уровнем HI выше значимость воздействия диоксидов серы и азота, для группы с HI > 3 возрастает роль формальдегида, поступающего из воздуха закрытых помещений. На следующем этапе была проведена оценка уровня экспрессии TLR и содержания цитокинов в зависимости от HI формирования патологии иммунной системы. Изучение экспрессии TLR выявило более низкие значения TLR-4 в группе II по сравнению с группой III (р = 0,030) (табл. 3). Это обусловило различия в содержании цитокинов, секреция которых индуцируется с участием TLR. Установлено, что уровень IL-2 в крови подростков групп I и II был ниже, чем у их сверстников из группы III (p < 0,001 и p < 0,001 соответственно). Содержание IL-10 в крови Таблица 3 Уровень экспрессии толл-подобных рецепторов и содержание цитокинов у подростков с различным риском нарушений в иммунной системе, Med (LQ - UQ) Показатель Группа I 2<HI Группа II 2<HI<3 Іруппа III HI>3 Экспрессия TLR-2, ОЕ 1,23 (1,121,29) 1,15 (0,961,32) 1,21 (1,091,29) Экспрессия TLR-4, ОЕ 1,15 (0,731,27) 1,07 (0,86-1,17)#3 1,12 (0,971,24) IL-2, пг/мл 0,01 (0,01-1,43)*3 0,01 (0,01-1,23)*3 0,21 (0,013,07) IL-10, пг/мл 0,51 (0,00-1,35)*2 1,59 (0,012,70) 1,39 (0,01-3,60)*2 INF-a, пг/мл 0,01 (0,010,01) 0,01 (0,010,01) 0,01 (0,010,01) INF-ү, пг/мл 0,01 (0,010,84) 0,01 (0,01-0,68)*3 0,01 (0,012,95) Примечание. Различия статистически значимы: *3 - по сравнению с группой III, р < 0,017; *2 - по сравнению с группой II, р < 0,017, #3 - тенденция к различиям по сравнению с группой III, 0,017 < р < 0,033. 12 Экология человека 2018.03 Окружающая среда школьников группы II было выше, чем у подростков групп I и III (p < 0,001 и p = 0,003 соответственно). Уровень INF-ү у подростков группы III был статистически значимо выше, чем у их сверстников из группы II (р = 0,009), и незначительно превышал показатели группы I (р = 0,051). Для всех групп было установлено наличие связи между содержанием IL-2 и уровнем INF-a (r = 0,439, р = 0,011; r = 0,278, р = 0,026 и r = 0,344, р = 0,002 для групп I-III соответственно). В группах I-III изменение экспрессии TLR-2 сопровождалось однонаправленными изменениями экспрессии TLR-4 (r = 0,528, р = 0,001; r = 0,574, р < 0,001 и r = 0,268 р = 0,003 соответственно). Следует отметить, что с увеличением химической нагрузки сила указанных выше связей ослабевает. В группе подростков с HI менее 3 отмечена корреляционная связь между содержанием IL-10 и INF-ү (r = 0,310, р = 0,013), при увеличении индекса опасности она усиливается (r = 0,512, р < 0,001). В группе III также выявлена ассоциация между содержанием IL-2 и уровнем экспрессии TLR-4 (r = 0,221, р = 0,033). Обсуждение результатов В результате оценки содержания химических соединений в воздушной среде, оказывающих влияние на показатели иммунной системы, выявлено, что в воздухе помещений концентрации формальдегида были выше, а диоксида углерода ниже, чем в атмосферном. Источниками поступления могут служить предметы мебели, строительные материалы, горение бытового газа и др. Уровни диоксида серы были сопоставимы в атмосферном воздухе и воздухе помещений. Цинк, никель и хром были выявлены в атмосферном воздухе не на всех изучаемых территорий. Учитывая, что подростки проводят в помещениях от 20 до 23 часов в сутки (данные анкетирования), загрязнение воздуха жилых и учебных помещений оказывает значительное влияние на формирование химической нагрузки индивидов. В связи с этим выявленные в помещениях уровни загрязнителей, превышающие предельно допустимые значения, обусловили повышенные значения HQ и HI формирования патологии иммунной системы у обследованных школьников. Влияние на иммунную систему формальдегида, диоксидов азота и серы, которое ожидалось по расчетным данным HQ, подтверждается наличием корреляционных связей между уровнями цитокинов и химической нагрузкой данными веществами. Так, при повышении химической нагрузки формальдегидом увеличивалось содержание IL-2 (r = 0,277, р = 0,026 и r = 0,597, р < 0,001 для групп II и III соответственно), что, возможно, обусловило более высокий уровень данного цитокина в группе III. Известно, что IL-2 определяет тип и длительность иммунного ответа, играет ключевую роль в его регуляции баланса лимфоцитов Т-хелперов I и II (ТҺ1 и ТҺ2) типов. Повышение уровня данного цитокина может привести к активации клеточного иммунитета (ТҺ1 типа) и повышению синтеза IFN-ү [10]. Подтверждением последнего является выявленное увеличение уровней IFN-ү в группе III по сравнению с группой II. Таким образом, при увеличении химической нагрузки отмечаются некоторые признаки активации клеточного иммунитета, что может быть обусловлено воздействием формальдегида [20]. Известно, что длительное воздействие оксидами азота и твердыми пылевыми частицами вызывает изменение уровней IL-2, IL-8, IL-6 и фактора некроза опухоли [14, 18]. Установленные корреляционные связи свидетельствуют о наличии ассоциаций между уровнем IL-2 у обследованных подростков и химической нагрузкой диоксидом азота (r = -0,281, р = 0,025 и r = -0,598, р < 0,001 для групп II и III соответственно). Изменение уровня цитокинов при воздействии поллютантов может быть обусловлено влиянием как на экспрессию самих генов интерлейкинов, так и на модуляторы их синтеза [13, 17]. При оценке суммарного влияния поллютантов на показатели иммунитета их эффекты могли как суммироваться, так и нивелироваться в зависимости от направленности воздействия. Так, в группах, сформированных по HI формирования патологии иммунной системы, содержание IL-10 было наибольшим, а концентрация IFN-ү и уровень экспрессии TLR-4 - наименьшим в группе II. При этом уровень IL-2 был наибольшим в группе с HI > 3. Возможно, это обусловлено значительным вкладом HQ воздействия формальдегида в HI нарушений иммунитета. Следует отметить, что при HI > 3 выявлено наибольшее число ассоциаций между экспрессией TLR и содержанием цитокинов, эти связи имеют наибольшую силу по сравнению с группами I и II. Выявленные нами изменения уровней цитокинов у обследованных подростков не выходили за пределы референтных значений (от 0 до 10 пг/мл для IL-2 и IL-10, 0-5 пг/мл для INF-a и менее 15 пг/мл для INF-ү). Известно, что запуск воспалительной реакции индуцируется TLR, опосредуется IL-2 и интерферонами и контролируется противовоспалительным цитокином (IL-10). Поэтому положительные связи между уровнями экспрессии TLR-2 и TLR-4, а также между концентрациями IL-2 и INF-a, INF-ү и IL-10 указывают на адекватную регуляцию механизмов секреции про- и противовоспалительных цитокинов толл-подобными рецепторами, несмотря на отмеченные нами изменения в уровнях изучаемых показателей. Наличие данных корреляций и увеличение их силы указывают на сопряженность механизмов про- и противовоспалительного процессов в развитии адаптационных реакций у подростков в условиях воздействия химических загрязнителей воздушной среды. Выводы 1. Среди поллютантов, загрязняющих воздушную среду изучаемых территорий, наибольший вклад в 13 Окружающая среда Экология человека 2018.03 формирование риска нарушений иммунитета у обследованных детей подросткового возраста вносит загрязнение воздуха помещений формальдегидом. 2. Установлены ассоциации между коэффициентами опасности воздействия формальдегида и диоксида азота и содержанием цитокинов. 3. При увеличении ингаляционной химической нагрузки содержание интерлейкина-2 и гамма-интерферона в сыворотке крови подростков повышается, а уровень интерлейкина-10 возрастает нелинейно. 4. Зависимости между уровнем экспрессии толл-подобных рецепторов 2 и 4, содержанием альфа-интерферона и риском нарушения иммунитета, обусловленного ингаляционной химической нагрузкой, не установлено.

About the authors

L B Masnavieva

East-Siberian Institute of Medical and Ecological Research

Email: Masnavieva_Luda@mail.ru
Angarsk, Russia

N V Efimova

East-Siberian Institute of Medical and Ecological Research

Angarsk, Russia

I V Kudaeva

East-Siberian Institute of Medical and Ecological Research

Angarsk, Russia

References

Supplementary files