Формирование микробиоценоза ротоглотки у недоношенных детей с низкой и экстремально низкой массой тела при рождении в условиях детского стационара

Полный текст

Из изучаемых биотопов человека наиболее сложными являются микробные сообщества верхних дыхательных путей. Они характеризуются разнообразием микробного пейзажа [1]. Приобретение микрофлоры родовых путей матери и колонизация вагинальной флорой кожи, дыхательной и пищеварительной систем ребенка происходит во время родов. Своевременное и правильное формирование микробиоценоза во многом определяет состояние здоровья новорожденного и влияет на его развитие [2]. Особую группу новорожденных детей составляют недоношенные дети с очень низкой (ОНМТ) и экстремально низкой (ЭНМТ) массой тела при рождении. Отсутствие естественного процесса приобретения нормальной микрофлоры (от матери), массивная антибактериальная терапия, частые инвазивные манипуляции и длительное пребывание в стационаре приводят к неправильному формированию микрофлоры [4, 5]. В литературе [8] имеются немногочисленные сведения о формировании микробиоценоза ротоглотки у новорожденных в условиях акушерского стационара. Изучена роль условно-патогенных микроорганизмов в развитии инфекций у новорожденных детей с ОНМТ и ЭНМТ [5], при наличии вентилятор-ассоциированных осложнений и на фоне внутриутробного инфицирования [7]. Однако в литературе отсутствуют сведения о формировании микробиоценоза ротоглотки в условиях пребывания в стационаре на этапе выхаживания. В связи с этим целью исследования явилось изучение формирования микрофлоры ротоглотки у недоношенных детей с массой тела менее 1 500 г на этапах выхаживания в условиях детского стационара. Методы Проведено бактериологическое исследование отделяемого верхних дыхательных путей у 58 недоношенных детей с массой тела менее 1 500 г при поступлении и при выписке из отделения патологии новорожденных и недоношенных детей Архангельской детской клинической больницы имени П. Г. Выжлецова с октября 2009 по июнь 2011 года. При поступлении в отделение у всех детей микробный пейзаж ротоглотки был скудным и представлен кокковой флорой. За период госпитализации в стационаре микроэкология ротоглотки формировалась за счет облигатных представителей, но отмечалась и колонизация патогенными и условно-патогенными микроорганизмами. На формирование микрофлоры верхних дыхательных путей оказывают влияние такие факторы, как искусственная вентиляция легких, вид вскармливания, коррекция пробиотиками и внутриутробное инфицирование. У недоношенных детей с низкой и экстремально низкой массой тела при рождении в условиях длительного пребывания в стационаре адекватного формирования микробиоценоза слизистой ротоглотки не происходит. Ключевые слова: ротоглотка, микроорганизм, микробиоценоз, недоношенный ребенок Обследованы 58 недоношенных детей, находящихся на этапе выхаживания в отделении патологии новорожденных и недоношенных детей Государственного бюджетного учреждения здравоохранения Архангельской области «Архангельская детская клиническая больница имени П. Г. Выжлецова» (АДКБ) с октября 2009 по июнь 2011 года. Срок гестации составил 30 недель (Ме = 30,00; Р 28,00-31,00). Масса тела при рождении колебалась от 750 до 1 500 г. Из родильных домов города и области в отделение патологии новорожденных и недоношенных детей переведены 25 детей, из отделения реанимации новорожденных детей (ОРН) АДКБ - 33 ребенка. В отделении пробиотик (бифидумбактерин) назначался 21 ребенку (36,2 %), соответственно 37 детям (63,8 %) пробиотик не назначался. На грудном вскармливании при поступлении в отделение находились 17 детей (29,3 %), на искусственном - 41 ребенок (70,7 %). К выписке из стационара 26 детей (44,8 %) находились на грудном молоке, а 32 ребенка (55,2 %) - на искусственном вскармливании. Средний возраст детей при выписке составил 56 дней. Данное исследование является открытым когортным проспективным. Для проведения микробиологических исследований использовались критерии: включения - дети, родившиеся раньше предполагаемого срока, с массой тела 1 500 г и менее, находившиеся на лечении в отделении патологии новорожденных и недоношенных детей АДКБ; исключения - масса тела ребенка при рождении более 1 500 г, срок гестации 37 недель и более; выбывания - отсутствие проведенного микробиологического обследования или при поступлении, или при выписке из стационара. Микробиологическое обследование отделяемого ротоглотки осуществлялось при поступлении и при выписке из отделения. Проводился количественный и качественный учет микробной флоры верхних дыхательных путей (ВДП) общепринятыми методами. Материал засевали на 5 % кровяной агар, среду Сабуро, агар Эндо, маннит-солевой агар, шоколадный агар и тиогликолевую среду. Внутриутробное инфицирование устанавливали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) in real time, используя тестсистемы производства НПФ «ДНК-Технология», с определением Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Chlamydia trachomatis, Cytomegalovirus в отделяемом ротоглотки или трахеобронхиолярном аспирате. Все исследования проводились на базе лаборатории клинической микробиологии и ПЦР- диагностики ЦНИЛ Северного государственного медицинского университета г. Архангельска. Статистическая обработка результатов осуществлялась с помощью программы SPSS (v. 18.0). Проверка на нормальность распределения данных проводилась с использованием статистического критерия Шапиро - Уилка. Для описания данных, имеющих ненормальное распределение, применяли медиану (Ме) и процентили (Р 25-75). Для сравнения количественных данных в двух связанных выборках использовался непараметрический критерий Вилкок- сона. При сравнении количественных данных в двух независимых группах применялся непараметрический критерий Манна - Уитни, при сравнении качественных данных в двух связанных выборках - критерий Мак-Нимара, в двух несвязанных выборках - точный критерий Фишера, хи-квадрат Пирсона. Критический уровень значимости p при проверке статистических гипотез - менее 0,05. Результаты При исследовании микрофлоры ротоглотки отмечено, что микробный пейзаж ВДП детей при поступлении в отделение был скудным и представлен в основном кокковой флорой (табл. 1). У 5 детей (8,6 %) в отделяемом ротоглотки микробная флора не выделялась. Среди облигатных представителей преобладали коагулазоотрицательные стафилококки (КОС - S. еpidermidis; S. haemolyticus, S. cochnii), выделенные у 74,1 % обследованных. Частота встречаемости стрептококков ротовой полости была низкая (8,6 %). Еще ниже (1,7 %) она отмечалась в отношении непатогенных представителей семейств Neisseriaсeaе (N. elongata) и рода Сorynebacterium. Таблица 1 Характер микробиоценоза ротоглотки у недоношенных детей во время госпитализации в отделении новорожденных и недоношенных детей АДКБ (n = 58) При поступлении При выписке Микроорганиз- Частота Численность, Частота Численность, мы встречае- Lg КОЕ/т встречае- Lg КОЕ/т мости, % Ме (Р25-75) мости, % Ме (Р25-75) Облигатные Общее количество стафилококков 74,1 5,0 (4,0-5,7) 48,3** 4,0 (4,0-5,0)** S. epidermidis 46,5 5,0 (4,0-6,0) 44,8 4,0 (4,0-5,0) S. haemolyticus 25,9 5,0 (5,0-5,0) 3,4*** 3,5 (3,0) S. cochnii 1,7 5,0 - - Микрококки 3,4 2,5 (2,0) 12,1 5,0 (4,0-5,0) Общее количество «ротовых» стрептококков 8,6 5,0 (3,7-5,7) 41,4*** 4,7 (4,0-5,0)* Neisseria непатогенные 1,7 4,0 3,4 4,0 Corynebacterium непатогенные 1,7 3,0 1,7 4,0 Факультативные Общее количество энтерококков 6,9 4,5 (3,3-5,0) 24,1** 4,0 (3,9-5,0)* E. faecium 3,4 4,5 (4,0) 19,0* 4,0 (3,7-5,0) E. faecalis 3,4 4,0 (3,0) 5,2 4,7 (4,0) Общее количество грибов Candida 8,6 3,56 (3,2-4,0) 20,7 3,59 (3,1 -4,1) C. albicans 3,4 3,9 (3,5) 5,2 3,5 (3,2) C. tropicalis 5,2 3,6 (3,0) 15,5 3,7 (2,3-4,1) Транзиторные S. рneumoniae 5,2 5,0 (4,0) 6,9 5,5 (5,0-6,0) S. pyogenes 1,7 6,7 5,2 6,7 (6,0) S. “miller!” - - 5,2 5,0 (4,0) Haemophilus - - 1,7 3,48 Общее количество ГОБ 5,2 3,48 (2,0) 50,0*** 3,7 (3,0- 5,0)*** E. coli - - 19,0 3,0 (2,0-5,0) Klebsiella 3,4 2,7 (2,0) 20,7** 3,4 (2,3-4,0) Serratia - - 6,9 4,3 (3,5-5,0) Hafnia - - 1,7 5,7 Citrobacter - - 1,7 4,7 Enterobacter 1,7 3,75 - - Общее количество НГОБ 13,8 5,0 (3,5-5,7) 5,1 4,0 (3,0) P. aeruginosа 12,1 5,0 (3,0-5,7) 1,7 5,0 Moraxella - - 3,4 3,5 (3,0) Kingella 1,7 5,0 - - Примечание. Уровень значимости различий: * - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 За период госпитализации в стационаре постепенно формировалась микроэкология данного биотопа облигатными представителями за счет уменьшения частоты встречаемости КОС (S. haemolyticus, S. cochnii) в 1,5 раза до 48,3 % (р = 0,003) и увеличения «ротовых» стрептококков в 4,5 раза до 41,4 % (р = 0,001). Численность КОС и «ротовых» стрептококков стала меньше, различия были статистически значимы (Т = 168,5, Z = -3,40, p = 0,001; T = 61,5, Z = -2,92, p = 0,004). Частота встречаемости непатогенных нейссерий увеличилась в 2 раза до 3,4 % без изменения количества; Corynebacterium остались к выписке без изменений. Факультативные микроорганизмы представлены двумя группами: энтерококками и грибами рода Candida. Уровень энтерококков при поступлении в отделение был незначительным (6,9 %) и представлен E. faecium и E. faecalis с одинаковой частотой (50 %). Грибы рода Candida выделялись у 8,6 % детей, представлены C. albicans и C. tropicalis с преобладанием (5,2 %) последнего. За время госпитализации в стационаре отмечено увеличение частоты выявления энтерококков в 3 раза до 24,1 % (р = 0,013) с уменьшением численности до 4,0 lg КОЕ/т (Т = 20,50, Z = -2,27, p = 0,023), преобладали E. faecium. Также в 2,5 раза увеличилась контаминация слизистой ротоглотки грибами рода Candida до 20,7 % без изменения их численности. Видовой пейзаж изучаемых представителей не изменился. Среди транзиторных микроорганизмов при поступлении отмечен более высокий уровень колонизации ВДП неферментирующими грамотри- цательными бактериями (НГОБ), преимущественно Pseudomonas aeruginosа, Kingella, у 13,8 % обследованных. Контаминация ВДП грамотрицательными энтеробактериями (ГОБ) была невысокая (5,2 %) с узким видовым пейзажем (Klebsiella, Enterobacter). Носительство S. рneumoniae отмечено у 5,2 % детей; S. pyogenes у 1,7 %. Следует отметить, что к выписке из стационара увеличивалось число детей с патологической колонизацией зева за счет ГОБ (50,0 %; р = 0,001) с расширением спектра до четырех видов (Klebsiella, E. coli, Citrobacter, Hafnia) и увеличением их численности (Т = 31,5, Z = -4,14, p = 0,001); регистрировали возрастание контаминации стрептококками: S. рneumoniae (6,9 %); S. pyogenes (5,2 %). Пребывание детей в отделении новорожденных и недоношенных детей АДКБ приводило к формированию носительства условнопатогенных стрептококков группы “milleri” у 5,2 % обследованных и Haemophilus spp. у 1,7 %. На фоне этого происходила смена видов НГОБ: при снижении выявления синегнойной палочки отмечено появление Moraxella в 3,4 % случаев. Нами был изучен характер микробного пейзажа ротоглотки в зависимости от госпитализации детей в отделение реанимации (искусственная вентиляция легких, массивная антибиотикотерапия). Установлено, что госпитализация в ОРН способствует контаминации ВДП условно-патогенными микроорганизмами. Только у данной группы детей выявляли НГОБ (синегнойная палочка, кингелла) в 24,2 % случаев (р = 0,008) в численности 5,0 lg КОЕ/т (U = 312, Z = -2,6, p = 0,009); S. pyogenes (3,0 %) в большом количестве (6,7 lg КОЕ/т); S. рneumoniae (6,1 %; 5,8 lg КОЕ/т). Факультативные микроорганизмы (энтерококки и грибы рода Candida) в три раза чаще выявляли у детей после лечения в ОРН. Уровень облигатных представителей был выше у детей, не прошедших отделение реанимации, так, КОС регистрировались в 84 % случаев c большей численностью 5,0 lg КОЕ/т (U = 274, Z = -2,2, p = 0,026), непатогенные нейссерии выявляли в 4 % случаев. У детей после реанимации регистрировали «ротовые» стрептококки, представленные тремя видами (S. mitis, S. oralis, S, sanguis), с частотой 9,1 %. У детей без лечения в реанимационном отделении «ротовые» стрептококки выявляли в 8 % случаев, и они представлены одним видом (S. mutans) (табл. 2). Таблица 2 Характер микробиоценоза ротоглотки у недоношенных детей при поступлении в отделение новорожденных и недоношенных детей АДКБ в зависимости от госпитализации в ОРН Микроорганиз мы Госпитализация в ОРН n=33 Без госпитализации в ОРН n=25 Частота встречаемости, % Численность, Lg КОЕ/т Ме (Р25-75) Частота встречаемости, % Численность, Lg КОЕ/т Ме (Р25-75) Облигатные Общее количество стафилококков 66,7 4,9 (4,0-5,1) 84,0 5,0 (5,0-5,9)* S. epidermidis 39,4 4,0 (3,5-5,9) 56,0 5,0 (4,7-6,1) S. haemolyticus 24,2 5,0 (4,8-5,0) 28,0 5,0 (5,0-5,7) S. cochnii 3,0 5,0 - - Общее количество «ротовых» стрептококков 9,1 5,7 (4,0) 8,0 4,2 (3,5) Neisseria непатогенные - - 4,0 4,0 Corynebacterium непатогенные 3,0 3,0 - - Факультативные Общее количество энтерококков 9,1 4,0 (3,0) 4,0 5,0 Общее коли- чество грибов Candida 9,1 3,8 (3,6) 4,0 3,49 Транзиторные S. рneumoniae 6,1 5,8 (4,0) - - S. pyogenes 3,0 6,7 - - Общее количество ГОБ 6,1 2,7 (2,0) 4,0 3,7 Общее количество НГОБ 24,2** 5,0 (3,5- 5,7)* - - Примечание. Уровень значимости различий: * - р < 0,05; ** - р < 0,01. К моменту выписки из стационара более половины детей (32 человека) находились на искусственном вскармливании. Вид вскармливания существенно влиял на формирование микрофлоры ротоглотки, особенно это отражалось на заселении ВДП факультативными и транзиторными представителями. У детей на грудном вскармливании отмечали выше уровень энтерококков, ниже содержание грибов рода Candida и ГОБ; чаще регистрировали формирование носительства S. pyogenes и колонизацию НГОБ (Ме = 4,0 lg КОЕ/т; U = 368,0, Z = -1,95, p = 0,050). Искусственное вскармливание способствовало формированию но- сительства S. рпеитопіае, S. “milleri”, Haemophilus и контаминации указанного биотопа ГОБ (табл. 3). Таблица 3 Характер микробиоценоза ротоглотки у недоношенных детей при выписке из отделения новорожденных и недоношенных детей АДКБ в зависимости от вида вскармливания Естественное (n=26) Искусственное (n=32) Микроорганиз мы Частота встречаемости, % Численность, Lg КОЕ/т Ме (Р25-75) Частота встречаемости, % Численность, Lg КОЕ/т Ме (Р25-75) Облигатные Общее количество стафилококков 50,0 4,0 (3,5-4,0) 46,9 4,7 (4,0-5,0) Общее количество «ротовых» стрептококков 38,7 4,4 (4,0-5,3) 40,6 4,7 (4,0-5,0) Neisseria непатогенные 7,7 4,0 (4,0) - - Corynebacterium непатогенные - - 4,0 Факультативные Общее количество энтеро- 34,6 4,0 (3,7-4,9) 15,6 4,0 (4,0-5,0) кокков Общее количество грибов Candida 19,2 3,7 (3,2-4,1) 21,9 3,5 (1,5-4,4) Транзиторные S. рneumoniae - - 12,5 5,5 (5,0-6,0) S. pyogenes 7,7 6,4 (6,0) 3,1 6,7 S. “milleri” - - 9,4 5,0 (4,0) Haemophilus - - 3,1 3,48 Общее количество ГОБ 42,3 4,0 (3,0-5,0) 56,2 3,6 (2,8-4,8) Общее количество НГОБ 11,5 4,0 (3,0)* - - Примечание. Уровень значимости различий: * - р < 0,05. На фоне назначения пробиотиков (бифидумбакте- рин) не регистрировали формирования носительства S. pyogenes, Haemophilus; отмечали несколько ниже уровень стафилококков, ГОБ (особенно клебсиелл). Однако пробиотики не оказывали влияния на заселение слизистой ротоглотки «ротовыми» стрептококками, энтерококками, пневмококками. Частота встречаемости 38,1 % (р = 0,020) и количество грибов рода Candida (3,9 lg КОЕ/т) было выше у детей при проведении биокоррекции бифидумбакте- рином (U = 244, Z = -3,3, p = 0,001), при этом преобладали C. tropicalis (табл. 4). Таблица 4 Характер микробиоценоза ротоглотки у недоношенных детей при выписке из отделения новорожденных и недоношенных детей АДКБ в зависимости от приема пробиотика Биокоррекция Без коррекции пробиотиком пробиотиком Микроорга- n =21 n=37 низмы Частота Численность, Частота Численность, встречае- Lg КОЕ/т встречае- Lg КОЕ/т мости, % Ме (Р25-75) мости, % Ме (Р25-75) Облигатные Общее количество стафилококков 38,1 4,9 (4,0-5,0) 54,1 4,0 (4,0-4,7) Общее количество «ротовых» стрептококков 28,6 4,5 (4,0-5,0) 45,9 4,7 (4,0-5,4) Neisseria непатогенные - - 5,4 4,0 (4,0) Corynebacterium непатогенные - - 2,7 4,0 Факультативные Общее количество энтерококков 28,6 4,0 (3,9-4,3) 21,6 4,4 (3,8-5,0) Общее коли- чество грибов Candida 38,1 3,9 (3,3-4,4)** 10,8* 3,2 (1,9-3,9) Транзиторные S. рneumoniae 9,5 5,5 (5,0) 5,4 5,5 (5,0) S. pyogenes - - 8,1 6,7 (6,0) S. “milleri” 9,5 4,9 (4,0) 2,7 5,0 Haemophilus - - 2,7 3,48 Общее количество ГОБ 47,6 3,0 (2,0-4,0) 51,4 4,0 (3,0-5,0) Общее количество НГОБ 9,5 4,0 (3,0) 2,7 4,0 Примечание. Уровень значимости различий: * - р < 0,05; ** - р < 0,001. Проведен анализ микробного заселения ротоглотки у данной группы детей на фоне внутриутробного инфицирования представителями семейства Myraplasmataceae и Herpesviridae. Из 58 детей у 9 (15,5 %) при поступлении в отделение было выявлено методом ПЦР внутриутробное инфицирование. Чаще выявляли U. urealyticum (66,7 %), цитомегаловирус (33,3 %), M. hominis (11,1 %). У одного ребенка выявлена ассоциация U. urealyticum и M. hominis. Отмечено, что на фоне внутриутробного инфициро вания преимущественно формируется контаминация условно-патогенной флорой: очень высокий уровень грибов рода Candida 44,4 % (р = 0,001) одновременно с повышенным количеством данного представителя до 3,63 lg КОЕ/т (U = 127, Z = -4,1, p = 0,001); выше встречаемость НГОБ (22,2 %), энтерококков (22,2 %) и пневмококков (11,1 %). Основные облигатные представители ротоглотки («ротовые» стрептококки) на фоне инфицирования указанный биотоп не заселяют (табл. 5). Таблица 5 Характер микробиоценоза ротоглотки у недоношенных детей при поступлении в отделение новорожденных и недоношенных детей АДКБ в зависимости от внутриутробного инфицирования Наличие Отсутствие инфицирования инфицирования Микроорга- n=9 n=49 низмы Частота Численность, Частота Численность, встречае- Lg КОЕ/т встречае- Lg КОЕ/т мости, % Ме (Р25-75) мости, % Ме (Р25-75) Облигатные Общее количество стафилококков 55,5 4,7 (3,5-5,7) 77,5 5,0 (4,0-5,7) Общее количество «ротовых» стрептококков - - 10,2 5,0 (3,74-5,7) Neisseria непатогенные 11,1 4,0* - - Corynebacterium непатогенные 11,1 4,0* - - Факультативные Общее количество энтерококков 22,2 3,5 (3,0) 4,1 5,0 (5,0) Общее количество грибов Candida 44,4 3,63 (3,124,15) 2,0** 3,56** Транзиторные S. рneumoniae 11,1 7,6 4,1 4,5 (4,0) S. pyogenes - - 2,0 6,7 Общее количество ГОБ - - 6,1 3,48 (2,0) Общее количество НГОБ 22,2 5,85 (5,7) 12,2 5,0 (3,0- 5,17) Примечание. Уровень значимости различий: * - р < 0,05; ** - р < 0,001. Обсуждение результатов У всех обследованных детей при поступлении в отделение на слизистой ротоглотки преобладала кокковая флора за счет КОС, отмечался дефицит «ротовых» стрептококков, в небольшой частоте выявлялись энтерококки и грибы рода Candida. Наблюдалась контаминация слизистой ротоглотки детей S. рпеитопіае, S. pyogenes и НГОБ. Достаточно скудное обсеменение ротоглотки облигатной микрофлорой можно объяснить назначением массивной антибактериальной терапии [6]. Длительное нахождение детей в стационаре способствовало смене представителей микрофлоры на слизистой ВДП. Снизился уровень КОС, отмечалось заселение ротоглотки «ротовыми» стрептококками, происходила контаминация гемофильной палочкой и S. “milleri”, колонизация ГОБ, энтерококками, грибами рода Candida. Отмечали носительство S. рneumoniae, S. pyogenes. Нахождение детей на лечении в ОРН способствовало контаминации ВДП патогенными и условнопатогенными микроорганизмами (НГОБ, S. рneumoniae, S. pyogenes) при высокой частоте встречаемости энтерококков и грибов рода Candida, что согласуется с данными других исследователей [3, 7-9]. Естественное вскармливание снижает контаминацию данного биотопа гемофильной палочкой, S. “milleri”, ГОБ. Так, Т М. Клименко и О. Ю. Карапетян [2] регистрировали на грудном и искусственном вскармливании ниже частоту выделения грибов рода Candida по сравнению с нашими данными. Подобная закономерность установлена и в отношении E. coli, K. pneumoniae, S. epidermidis. Внутриутробное инфицирование способствует контаминации ротоглотки НГОБ, пневмококками, энтерококками и грибами рода Candida, что соответствует данным литературы [7]. Высокий уровень выявления условно-патогенной микрофлоры расценивается как результат контаминации госпитальной микрофлорой при длительном пребывании в стационаре. Биокоррекция бифидумбактерином препятствует контаминации слизистой ротоглотки S. pyogenes и гемофильной палочкой. Таким образом, у недоношенных детей с низкой и экстремально низкой массой тела в условиях длительного пребывания в стационаре не происходит адекватного формирования микробиоценоза слизистой ротоглотки облигатными представителями ввиду высокой контаминации госпитальной микрофлорой.

Об авторах

Ольга Геннадьевна Малыгина

Северный государственный медицинский университет

Email: olgakasatcina@rambler.ru
старший преподаватель кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии

Т А Бажукова

Северный государственный медицинский университет

Г В Симонова

Северный государственный медицинский университет

Список литературы

Дополнительные файлы