THE UTERUS SMOOTH MUSCULAR TISSUE IN EARLY PUERPERIUM: INVOLUTION MECHANISMS

Full Text

Гладкая мышечная ткань (ГМТ) в процессе беременности и родов претерпевает существенные изменения. Основными тенденциями во время беременности является процесс пролиферации гладкомышечных клеток (ГМК) на ранней стадии и процесс гипертрофии клеток в поздний период [9, 11, 13, 16]. Послеродовой период (пуэрперий) - процесс структурной инволюции миометрия, сопровождающийся изменением структурных параметров матки к исходным величинам (до беременности). В настоящее время рассматривают следующие внутриклеточные механизмы послеродовой инволюции миометрия: апоптоз, завершающийся элиминацией клеток; клазмацитоз, приводящий к уменьшению размеров клеток, и аутофагоцитоз, который происходит в основном в фибробластах [9, 10]. Однако особенности механизмов процесса инволюции разных отделов матки остаются недостаточно изученными. Целью данной работы являлось исследование структурных преобразований гладкой мышечной ткани рогов и шейки матки крыс в ранний послеродовой период. Методы Исследования проведены на 30 белых беспородных половозрелых крысах массой 200-250 г: первую (контрольную) группу составили небеременные крысы (n = 5), вторую группу - беременные самки (n = 25, по 5 особей на каждый период наблюдения). Экспериментальные исследования проводились в соответствии с «Руководством по содержанию и использованию лабораторных животных» [8], а также с соблюдением правил гуманного обращения с животными (Report of the AVMA Panel on Eutanasia IAVMA, 2001 [15]). Животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом. Образцы тканей рогов и шейки матки брали утром на 1, 2, 4, 7-е сутки после родов. Для морфометрического и цитофотометрического анализа ГМТ отобранные фрагменты фиксировали при +5 °С в растворе 10 % формалина на фосфатном буфере при рН = 7,4 в течение 14-20 дней. Для анализа мышечной ткани использован метод прицельной клеточной диссоциации (Патент на изобретение № 2104524 23.05.94) [7], позволяющий точно выделять фрагменты гладкой мускулатуры и осуществлять последующее разделение ГМК. Выявление ДНК в ядрах клеток проводили по методу Фельгена с последующей цитоспектро-фотометрией на сканирующем цитофотометре МФТХ-2М (ЛОМО, Россия), при длине волны 546 нм. Контролем служили мазки, не подвергшиеся гидролизу в растворе соляной кислоты. Анализ содержания суммарного белка в цитоплазме проводили при окраске амидочерным. Препараты сканировали при длине волны 580 нм. Окулярным микрометром измеряли длину и ширину клеток, малый и большой диаметры ядер. Объемы рассчитывали по формуле эллип- При использовании световой, электронной микроскопии и иммуногистохимических методов изучали трансформацию гладкой мышечной ткани (ГМТ) стенки матки крыс в послеродовой период. Исследования показали, что в процессе инволюции имеет место неодинаковый характер структурно-функциональной перестройки ГМТ разных отделов матки, что обусловлено различной скоростью инволютивных процессов и особенностями функциональной нагрузки. К седьмым суткам после родов происходила полноценная инволюция миометрия рогов матки крыс, а аналогичный процесс в шейке матки протекал значительно медленнее, что проявилось преобладанием в популяции малых клеток. Во время послеродовой инволюции ведущим фактором перестройки популяции ГМТ всех отделов матки становится элиминация больших миоцитов, так как они представляют собой терминальное звено гладкомышечного дифферона и характеризуются низким уровнем адаптации к изменяющимся факторам. Механизм гибели клеток и восстановления структуры популяции может быть обусловлен как апоптозом, так и пролиферацией гладкомышечных клеток. Ключевые слова: послеродовой период (пуэрперий), гладкая мышечная ткань, иммуногистохимия, электронная микроскопия 31 Экологическая физиология Экология человека 2012.12 соида. Цифровой материал обрабатывали методом вариационной статистики с вычислением среднего арифметического и его стандартной ошибки, коэффициента вариации, асимметрии и эксцесса. Степень вероятности отличий (р) измеряемых величин определяли с помощью t-критерия Стьюдента при р < 0,05.йбработка результатов проводилась с помощью программы Statistica 6.0. Для выявления существования взаимосвязей между некоторыми параметрами гладких миоцитов использовали регрессионный анализ. Для идентификации процесса пролиферации в миоцитах проводили иммуногистохимическое окрашивание срезов с использованием моноклональных антител PCNA (фирма Santa Cruz, США). Перед инкубацией в растворе первичных антител парафиновые срезы на стеклах подвергали депарафинизации в ксилоле, спиртах возрастающей концентрации. Затем обрабатывали 3 % водным раствором перекиси водорода в течение 10 минут и преадсорбировали с 5 % лошадиной сывороткой (фирма Dako, Дания) 30 минут при комнатной температуре. После каждой операции срезы отмывали стандартным раствором фосфатносолевого буфера (фирма Sigma Immunochemicals, США). В качестве первичных антител использовали ядерный антиген пролиферирующих клеток PCNA. Экспозицию в растворах первичных антител проводили в течение 1 часа при комнатной температуре. Визуализация реакции осуществлялась с помощью вторичных биотинилированных антител с применением диаминобензидина для выявления пролиферации. Препарты подкрашивали квасцовым гематоксилином (с подсинением в щелочной воде). Для электронно-микроскопического исследования материал фиксировали в 2,5 % растворе глютарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,2-7,4 в течение 2 часов и последующей фиксацией в течение 1 часа в растворе 1 % тетраокиси осмия при температуре 5 °С. Кусочки промывали в буфере, обезвоживали в спиртах с контрастированием в 70° спирте и 1 % уранилацетате в течение 12 часов. Заливали в смесь эпон-аралдита. Для обеспечения прицельного электронно-микроскопического анализа со всех блоков получали серийные полутонкие срезы толщиной 1-2 мкм, которые окрашивали 1 % раствором метиленового синего. После идентификации необходимых объектов блоки затачивали и прицельные ультратонкие срезы готовили на ультратоме LKB-5 (Bromma, Швеция), контрастировали в 2,5 % растворе уранилацетата и 0,3 % растворе цитрата свинца по Рейнольдсу. Просматривали в электронных микроскопах JEM-100 CX (Япония). Результаты Анализ характера распределения гладких миоцитов по показателю их объема показал, что в контрольной группе (небеременные крысы) ГМТ представлена тремя типами клеток: малыми, средними и большими, различающимися по морфометрическим показателям. При беременности было выявлено значимое увеличение средних показателей объемов ГМК в рогах (5 336 ± 240) мкм3 и уменьшение данного показателя в шейке матки (2 525 ± 96) мкм3 по сравнению с таковыми в контрольной группе рогов и шейки (2 722 ± 138) и (4 193 ± 252) мкм3 соответственно (р < 0,001). В послеродовом периоде Рис. 1. Изменение структуры плоидности ядер гладких миоцитов рогов и шейки матки крыс после родов (3 н. - 3-я неделя беременности, 1 с., 2 с., 4 с., 7 с. - срок после родов, сутки). 32 Экология человека 2012.12 Экологическая физиология ■ ï *F i4 * * 4 fr* ρ ί- ' νί- * , 3 ■ Λ Рис. 2. Позитивная иммуногистохимическая реакция в гладкой мышечной ткани матки крысы: А - реакция на PCNA в рогах матки; В - реакция на PCNA в шейке матки (об. 40, ок. 10) в миометрии рогов средний показатель объемов миоцитов уменьшается (2 777 ± 1 18) мкм3, в миометрии шейки в 1-е сутки после родов данный показатель составляет (6 067 ± 269) мкм3, а на 7-е сутки он значительно уменьшается (3 627 ± 274) мкм3 (р = 0,029). Изменение среднего показателя объема ГМК в процессе послеродовой инволюции ГМТ отражают изменения структуры клеточной популяции. В ГМТ рогов матки на 2-е сутки выявлено значимое (р < 0,001) увеличение доли малых клеток до 56 %, к 7-м суткам структура популяции имеет параметры, близкие к параметрам контрольной группы. В ГМТ шейки на 2-е сутки 50 % популяции составляют большие клетки, к 7-м суткам увеличивается доля малых ГМК до 53 % (р < 0,001). Показатель содержания ДНК в ядрах и доля ги-перплоидных клеток достигали наибольшего значения в рогах матки на 2-е сутки пуэрперия (р = 0,047), а в шейке - на 7-е сутки (р < 0,001) (рис. 1), что подтверждает положительная иммуногистохимическая реакция на ядерный антиген пролиферирующих клеток PCNA (рис. 2). В период пуэрперия в миометрии рогов матки отмечаются наиболее выраженные изменения ультра-структурной организации ГМК. В ряде клеток были зафиксированы деструкция филаментов, изменение структуры митохондрий, образование крупных перину- Рис. 3. Ультраструктура гладкой мышечной ткани рогов матки крысы в период ранней послеродовой инволюции: ГМК - гладкие миоциты; Я - ядро; МВ - межклеточное вещество; Мфл - миофиламенты; В - крупная перинуклеарная вакуоль. Ув. χ 20 000. 33 Экологическая физиология Экология человека 2012.12 клеарных вакуолей (рис. 3). В послеродовом периоде в составе гладкомышечных пучков наблюдается разобщение ГМК, нарушение их контактов. Обсуждение результатов В процессе послеродовой инволюции характер структурной и функциональной перестройки ГМТ существенно различается в разных отделах матки, что обусловлено различным уровнем функциональной нагрузки [13, 14]. Во время послеродовой инволюции в миометрии рогов на 2-е сутки наблюдается повышение уровня синтеза ДНК, увеличение доли малых миоцитов в структуре популяции ГМТ. Ведущим фактором перестройки популяции ГМТ рогов матки крыс становится элиминация больших миоцитов, так как они представляют собой терминальное звено гладкомышечного дифферона [1-3, 12]. Механизм их исчезновения из популяции связан как с апоптозом, так и с клазмацитозом ГМК [9, 11]. Полученные нами результаты подтверждают литературные данные, свидетельствующие о том, что основным механизмом послеродовой инволюции является апоптоз [9-11, 12]. Факторами, инициирующими механизмы инволюции, являются ухудшающиеся условия трофики и гипоксия миометрия. Под действием повреждающих факторов своеобразной формой реакции является дедифференцировка клеток - упрощение их внутренней структуры, связанное с временной потерей их специализации. Существенным признаком дедифференцировки является приобретение клеткой способности к пролиферации [4]. Полученные нами результаты подтверждают литературные данные, свидетельствующие о том, что в послеродовой период активируются процессы пролиферации, которые имеют адаптивный (резервирующий) характер [10]. Гипоксия является повреждающим фактором, пусковым моментом, в результате действия которого происходит дедифференцировка зрелых ГМК в камбиальные клетки ГМТ миометрия с приобретением способности к пролиферации [6]. К 7-м суткам послеродовой инволюции миометрий рогов имеет популяционные показатели, близкие к параметрам контрольной группы (небеременные животные), что свидетельствует о завершении в ней инволютивных преобразований. В то же время в ГМК шейки матки наблюдается повышение уровня синтеза ДНК, усиление пролиферации, что сопровождается увеличением представительства малых миоцитов в структуре популяции. Результаты настоящего исследования подтверждают данные литературы о том, что инволюция шейки матки после родов происходит значительно медленнее, чем инволюция рогов матки [5].

About the authors

O V Dolgikh

Northern State Medical University

Email: olvado@mail.ru

Yu V Agafonov

Northern State Medical University

A L Zashikhin

Northern State Medical University

References

Supplementary files