POLYMORPHISM -786T>C ENDOTHELIAL NO-SYNTHASE AS A RISK FACTOR OF ARTERIAL HYPERTENSION

Full Text

Проживание в неблагоприятных для человека климатогеографических условиях Европейского Севера предъявляет повышенные требования практически ко всем системам организма человека, и прежде всего к сердечно-сосудистой [7, 11]. Функциональное состояние данной системы отражает «цену адаптации» к дискомфортным условиям проживания [11]. Нахож дение большей части года жителей Севера в условиях низких температур способствует поддержанию у них более высокого уровня артериального давления (АД) по сравнению с жителями комфортных климатических зон [2, 5], что является одним из факторов риска развития в дальнейшем артериальной гипертензии. Помимо исходно высокого нормального уровня АД 36 Экология человека 2018.04 Экологическая физиология существуют и другие гемодинамические и гуморальные (уровень продукции вазоактивных эндотелиальных факторов) факторы риска, указывающие на снижение адаптационных возможностей организма и риск возникновения сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе и артериальной гипертензии [12]. При этом изучение гемодинамических факторов риска развития артериальной гипертензии и развития её осложнений, как правило, проводится без учета генотипа организма. В то же время ряд исследований сосредоточены на определении роли молекулярно-генетических детерминант в синтезе эндотелием вазоактивных факторов. Эндотелиальная дисфункция, приводящая к росту периферического сосудистого тонуса (одно из патогенетических звеньев развития артериальной гипертензии), проявляется в дисбалансе продукции вазоконстрикторов и вазодилятаторов [3, 10], в первую очередь соответственно эндотелина-1 (ЭТ-1) и оксида азота (NO). За синтез NO в клетках эндотелия отвечает фермент эндотелиальная NO-синтаза ^NOS). В гене, кодирующем синтез eNOS, выявлено 11 полиморфизмов, одним из наиболее хорошо изученных является полиморфизм в зоне промотора -786Т>С [20]. В ряде мета-обзоров показаны связи между вариантом генотипа по данному полиморфизму гена еNOS, уровнем NO и отдельными параметрами функционирования сердечно-сосудистой системы [13, 17]. Однако практически все подобные исследования выполнены на лицах среднего и пожилого возраста с различной патологией системы кровообращения, что затрудняет оценку роли определенного генотипа по полиморфизму -786Т>С гена еNOS в формировании гемодинамических и сосудистых факторов риска развития артериальной гипертензии и не позволяет оценить перспективы его использования в качестве раннего маркера возникновения артериальной гипертензии. Цель исследования - установить роль полиморфизма -786Т>С гена еNOS в формировании гемоди-намических и гуморальных факторов риска развития артериальной гипертензии у практически здоровых юношей и девушек, постоянно проживающих в условиях Европейского Севера. Методы Исследования проводились в 2014-2016 годах в рамках гранта РФФИ и Правительства Архангельской области регионального конкурса «Север», проект № 14-04-98823 «Ассоциации полиморфизмов в генах NOS3, EDN1, EDNRA, EDNRB с периферической вазоконстрикцией». В поперечном исследовании участвовали 286 практически здоровых русских юношей и девушек. Критерии включения в исследование: постоянное проживание (с момента рождения) обследуемых лиц в условиях Европейского Севера Российской Федерации, возраст от 18 до 22 лет. Наличие у девушек устоявшегося регулярного, нормопонирующего менструального цикла, исследование проводили в фолликулярную (5-7 день) фазу овариально-менстру ального цикла. Наличие информированного согласия на участие в исследовании. Критерии исключения из исследования: наличие у обследуемых острых воспалительных заболеваний, любых хронических заболеваний внутренних органов, в том числе и в стадии стойкой ремиссии, ожирение, прием гормональных контрацептивов, курение. Кроме того, в изучаемую выборку не включались лица, имеющие регулярные (2-3 раза в неделю) физические нагрузки, поскольку систематические физические нагрузки динамического характера способствуют повышению эндотелийзависимой релаксации сосудов [15]. Все исследования проводились в осенний период в утренние часы при комфортной комнатой температуре. Тонус сосудов оценивался по данным периферической реовазографии с использованием индекса периферического сопротивления сосудов (ИПС). Реовазо-грамма снималась с указательного пальца левой руки. Для записи реовазограммы использовали многофункциональный диагностический компьютерный комплекс «Диастом-01» (ГОСТ 15.013-94). За нормальные показатели тонуса периферических сосудов принимались показатели ИПС от 80 до 90 удельных единиц (согласно инструкции к аппарату «Диастом-01»). Тонус сосудов фиксировался до и после (через 3 мин) пробы с дозированной физической нагрузкой по Мартине - Кушелевскому [9] с выделением типов гемодина-мической реакции с учетом показателей системной гемодинамики: систолического и диастолического артериального давления (САД и ДАД соответственно, мм рт. ст.) и частоты сердечных сокращений (ЧСС, уд/мин). Проба Мартине - Кушелевского позволяет оценить реакцию сердечно-сосудистой системы на нагрузку и выявить предрасположенность к периферической вазоконстрикции, которая в дальнейшем будет способствовать возникновению артериальной гипертензии. Артериальное давление и ЧСС фиксировали на автоматическом цифровом приборе для измерения давления и пульса МТ-40 производства «Meditech» (США). Общепринятыми расчетными методами определяли пульсовое давление (ПД, мм рт. ст.) и среднединамическое давление (СДД, мм рт. ст.). В качестве гемодинамических предикторов сердечнососудистого риска согласно Европейским рекомендациям по диагностике и лечению артериальной гипертонии [19] рассматривали ПД более 60 мм рт. ст. и нестабильность СДД при физической нагрузке (отклонение более 15 % от исходной величины). Концентрацию NO в сыворотке крови оценивали по суммарной концентрации стабильных метаболитов нитратов/ нитритов биохимическим методом с использованием набора «Total NO/Nitrite/Nitrate («R&D Systems», США)». Содержание в плазме ЭТ-1 анализировали методом ИФА с использованием диагностического набора «Enzyme immunoassay for the quantitative determination of human endothelin 1-21 («BIOMEDICA GRUPPE», Австрия)». Рассчитывали индекс соотношения вазодилататор NO/вазоконстриктор ЭТ-1 по концентрации этих факторов в крови. Данный индекс 37 Экологическая физиология Экология человека 2018.04 позволяет оценить баланс продукции вазоактивных эндотелиальных факторов [6]. Генотипирование полиморфизма -786T>C в гене еNOS проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) на базе молекулярно-генетической лаборатории ЦНИЛ Северного государственного медицинского университета с использованием реактивов фирмы «Литех» (Москва). Все материалы были собраны анонимно, с соблюдением правил биоэтики и подписанием информированного согласия. В соответствии с законом о персональных данных данные были деперсонизированы. Статистическую обработку результатов производили с помощью пакета программы «SPSS 17». Нормальность распределения оценивали с помощью критериев Колгоморова - Смирнова и Шапиро - Уилка. Поскольку количественные показатели не подчинялись закону нормального распределения, результаты исследования представляли в виде медианы и квартилей (Ме, Qp Q3). При множественном сравнении независимых групп использовали тест Крускала - Уоллеса, попарные сравнения проводили с помощью критерия Манна - Уитни. Статистическую взаимосвязь между количественными данными (прирост САД, ДАД, ПД и СДД, ИПС) и вариантом генотипа по полиморфизму -786Т>С гена еNOS оценивали с использованием критерия X2 Пирсона. Данный показатель рассчитывали с использованием он-лайн калькулятора, размещенного на сайте medstatistic.ru. Критический уровень значимости (р) при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05. Результаты Характеристика гемодинамических показателей и уровня продукции вазоактивных эндотелиальных факторов у юношей с различными генотипами по полиморфизму - 786Т>С гена еNOS. Проведенное генотипирование полиморфизма -786T>C в промоторе гена еNOS у юношей выявило распределение генотипов -786ТТ - 42,4 %, -786ТС - 46,5 % и -786СС - 11,1 %. Наблюдаемое распределение частот различных аллелей и генотипов в группе обследованных соответствовало закону равновесия Харди - Вайнберга. Показатели, отражающие функциональное состояние сердечно-сосудистой системы юношей-северян, представлены в табл. 1. Все анализируемые фоновые гемодинамические показатели соответствуют нормативным значениям. Однако после проведения пробы с дозированной физической нагрузкой вне зависимости от генотипа были выявлены гемодинамические факторы риска артериальной гипертензии: гипертоническая реакция на нагрузку, периферическая вазоконстрикция (ИПС > 90), высокое ПД, нестабильность СДД. При этом изучаемые факторы риска чаще выявлялись у юношей с генотипом СС по сравнению с гетерозиготами и дикими гомозиготами по полиморфизму -786T>C промотора гена еNOS (см. табл. 1). Так, у юношей, гомозиготных по аллелю С, концентрация ЭТ-1 была статистически значимо выше (примерно в 2 раза) и соответственно индекс NO/ЭТ-! - в 2 раза меньше, чем у лиц с генотипами СТ и ТТ (табл. 2), что свидетельствует о сдвиге баланса продукции вазоактивных эндотелиальных факторов в сторону вазоконстрикции и позволяет оценивать данный генотип как предиктор возникновения эндотелиальной дисфункции, формирования периферической вазоконстрикции и артериальной гипертензии. Характеристика гемодинамических показателей и уровня продукции вазоактивных эндотелиальных факторов у девушек с различными генотипами по полиморфизму -786Т>С гена еNOS. Проведенное генотипирование полиморфизма -786T>C в промоторе гена еNOS у девушек выявило распределение генотипов -786ТТ - 42,2 %, -786ТС - 47,4 % и 786СС - 10,4 %. Наблюдаемое распределение частот различных аллелей и генотипов в группе обследованных соответствовало закону равновесия Харди - Вайнберга. Показатели, отражающие функциональное состояние сердечно-сосудистой системы девушек-северянок, представлены в табл. 1. Фоновые гемодинамические показатели, а также гемодинамические показатели после пробы с дозированной физической нагрузкой у девушек значительно не различались в зависимости от генотипа по полиморфизму -786Т>С гена еNOS (см. табл. 1). Анализ вазоактивных эндотелиальных факторов не выявил статистически значимых различий по уровню продукции ЭТ-1 и NO в зависимости от генотипа по полиморфизму -786Т>С гена еNOS (см. табл. 2). Обсуждение результатов В результате молекулярно-генетического исследования были определены все аллели и генотипы изучаемого полиморфизма -786Т>С в промоторе гена еNOS. Преобладающими генотипами как у юношей, так и девушек являлись генотипы, содержащие дикий вариант изучаемого аллеля, а именно вариант Т. Наиболее редким являлся генотип СС, что согласуется с общемировыми данными [14, 16]. Были выявлены половые различия содержания вазоактивных эндотелиальных факторов в плазме крови (см. табл. 2). Известно, что эстрогены участвуют в активации синтеза эндотелийзависимых вазодилятаторов, в том числе и NO [18], а андрогены увеличивают синтез ЭТ-1 [21]. В связи с этими данными ожидалось повышение уровня NO и снижение уровня ЭТ-1 у девушек по сравнению с юношами. Однако согласно результатам нашего исследования уровень ЭТ-1 у девушек оказался выше, чем у юношей: у лиц с генотипом ТТ по исследуемому полиморфизму на 53,5 % (р = 0,013), ТС - 75,0 % (р = 0,001), СС - 24,1 % (р = 0,013), а уровень NO у девушек был ниже, чем у юношей: у лиц с генотипом ТТ по исследуемому полиморфизму на 64,4 % (р = 0,001), ТС - 37,0 % (р = 0,001), СС - 13,6 % (р = 0,242). При этом у обследованных девушек изменений показателя NO/ЭТ-! в зависимости от генотипа по по- 38 Экология человека 2018.04 Экологическая физиология Таблица 1 Показатели гемодинамики у юношей и девушек c различными генотипами по полиморфизму -786Т>С гена eNOS, Ме (Qp Q3) Показатель ТТ (1) ТС (2) СС (3) Значимость различий (р) Юноши Девушки Юноши Девушки Юноши Девушки Юноши Девушки n 72 49 79 55 19 12 В покое САД, мм рт. ст. 132 (124; 138) 115 (112; 121) 130 (122; 140) 112 (108; 119) 125 (122; 132) 120 (111; 129) (1 - 2) 0,23 (2-3) 0,25 (1-3) 0,03 (1-2) 0,31 (2-3) 0,03 (1-3) 0,11 ДАД, мм рт. ст. 79 (74; 86) 71 (66; 75) 80 (73; 85) 72 (66; 77) 72 (66; 84) 74 (70; 85) (1 - 2) 0,98 (2-3) 0,07 (1-3) 0,10 (1-2) 0,38 (2-3) 0,23 (1-3) 0,07 ПД, мм рт. ст. 51 (46; 59) 58 (36; 67) 50 (44; 56) 51 (34; 67) 50 (45; 58) 51 (34; 69) (1 - 2) 0,35 (2-3) 0,72 (1-3) 0,74 (1-2) 0,04 (2-3) 0,13 (1-3) 0,79 СДД, мм рт. ст. 96 (91; 102) 86 (81; 89) 97 (90; 101) 85 (80; 91) 91 (85; 100) 89 (86; 95) (1 - 2) 0,74 (2-3) 0,09 (1-3) 0,05 (1-2) 0,31 (2-3) 0,03 (1-3) 0,11 ЧСС, уд/мин 72 (64; 79) 73 (66; 84) 72 (65; 80) 76 (68; 94) 75 (66; 80) 79 (69; 89) (1 - 2) 0,62 (2-3) 0,99 (1-3) 0,63 (1-2) 0,39 (2-3) 0,05 (1-3) 0,49 ИПС, усл. ед. 87 (81; 91) 82 (75; 92) 87 (81; 90) 84 (77; 90) 86 (80; 94) 83 (78; 90) (1-2) 0,71 (2-3) 0,44 (1-3) 0,06 (1-2) 0,53 (2-3) 0,88 (1-3) 0,64 Через 3 мин после пробы с дозированной физической нагрузкой САД, ммрт. ст. 160 (147; 170) 132 (116; 142) 158 (145; 172) 130 (113; 142) 163 (156; 180) 134 (116; 145) (1 - 2) 0,43 (2-3) 0,09 (1-3) 0,20 (1-2) 0,73 (2-3) 0,56 (1-3) 0,69 ДАД, мм рт. ст. 84 (78; 93) 72 (67; 78) 84 (73; 92) 76 (70; 81) 86 (75; 91) 74,5 (69; 81) (1 - 2) 0,50 (2-3) 0,86 (1-3) 0,69 (1-2) 0,06 (2-3) 0,66 (1-3) 0,47 ПД, мм рт. ст. 75 (63; 86) 58 (36; 67) 74 (65; 80) 51 (40; 67) 82 (71; 90) 52 (47; 69) (1 - 2) 0,73 (2-3) 0,02 (1-3) 0,06 (1-2) 0,13 (2-3) 0,53 (1-3) 0,65 СДД, мм рт. ст. 107 (104; 119) 93 (83; 97) 108 (97; 116) 94 (87; 101) 113 (101; 118) 94 (85; 100) (1 - 2) 0,32 (2-3) 0,34 (1-3) 0,77 (1-2) 0,39 (2-3) 0,32 (1-3) 0,49 ЧСС, уд /мин 96 (83; 101) 93 (84; 102) 93 (87; 103) 93 (73; 103) 89 (81; 98) 94 (84; 110) (1 - 2) 0,55 (2-3) 0,07 (1-3) 0,21 (1-2) 0,60 (2-3) 0,31 (1-3) 0,98 ИПС, усл. ед. 93 (85; 92) 82 (76; 91) 91 (83; 98) 86 (81; 94) 102 (87; 108) 90 (81; 103) (1-2) 0,21 (2-3) 0,01 (1-3) 0,05 (1-2) 0,17 (2-3) 0,37 (1-3) 0,31 Примечания: САД - систолическое артериальное давление, ДАД - диастолическое артериальное давление, ПД - пульсовое давление, СДД - среднединамическое давление, ЧСС - частота сердечных сокращений, ИПС - индекс периферического сопротивления; жирным шрифтом обозначено статистически значимое различие показателей в группах. Таблица 2 Продукция вазоактивных эндотелиальных факторов у юношей и девушек с различными генотипами по полиморфизму -786Т>С гена eNOS, Ме (Qp Q3) Показатель ТТ (1) ТС (2) СС (3) Значимость различий (р) Юноши Девушки Юноши Девушки Юноши Девушки Юноши Девушки n 72 49 79 55 19 12 NO, ммоль/л 21,7 (17,6; 28,6) 13,2 (9,4; 17,0) 21,1 (18,6; 28,2) 15,4 (12,5; 18,2) 19,6 (18,2; 22,6) 16,9 (13,8; 24,2) (1-2) 0,81 (2-3) 0,17 (1-30 0,17 (1-2) 0,08 (2-3) 0,27 (1-3) 0,06 ЭТ-1, фмоль/мл 0,39 (0,29; 0,57) 0,84 (0,59; 1,1) 0,35 (0,24; 0,62) 1,0 (0,75; 1,14) 0,66 (0,34; 0,82) 0,87 (0,51; 2,80) (1 - 2) 0,38 (2-3) 0,01 (1-3) 0,01 (1-2) 0,43 (2-3) 0,93 (1-3) 0,54 NO/ЭТ-! 58,9 (38,9; 100,7) 15,0 (9,0; 24,0) 66,6 (37,2; 104,5) 17,0 (8,0; 22,0) 29,3 (23,2; 64,2) 17,0 (7,5; 26,7) (1-2) 0,51 (2-3) 0,03 (1-3) 0,08 (1-2) 0,72 (2-3) 0,97 (1-3) 0,91 Примечание. NO - оксид азота, ЭТ-1 - эндотелин-1, NO/ЭТ-1 - соотношение вазодилятатор оксид азота/ вазоконстриктор эндотелин-1. лиморфизму -786Т>С гена еNOS выявлено не было, в то время как у юношей самый низкий показатель был в группе с генотипом СС (см. табл. 2). При этом у юношей, как и у девушек, статистически значимой разницы в уровне NO в зависимости от генотипа по полиморфизму -786Т>С гена еNOS выявлено не было (см. табл. 2). Вместе с тем у юношей с генотипом СС по исследуемому полиморфизму уровень ЭТ-1 был выше на 46,9 % (р = 0,01) и 40,9 % (р = 0,01), чем у юношей с генотипами ТС и ТТ соответственно. 39 Экологическая физиология Экология человека 2018.04 В целом у девушек по сравнению с юношами вне зависимости от генотипа были выявлены статистически значимо более низкие показатели индекса отношения вазодилятатор/вазоконстриктор. Однако ИПС у девушек как до, так и после нагрузки не выходил за пределы нормы и не зависел от генотипа по изучаемому полиморфизму, что, вероятно, связано с действием эндогенных эстрогенов, повышающих эластичность стенок артерий и проходимость системы мелких артерий, в том числе и за счет усиления активности эндотелийзависимого ответа, снижения активности ангиотензинпревращающего фермента и других эстрогенопосредуемых механизмов вазодилятации [8]. При этом у юношей, несмотря на значительно более высокие значения индекса отношения вазодилятатор/ вазоконстриктор по сравнению с девушками, ИПС как в покое, так и после физической нагрузки был выше, чем у девушек, причем статистически значимой эта разница становилась после нагрузки (х2 = 9,913, р = 0,01). Наиболее высокие показатели ИПС после проведения пробы Мартине - Кушелевского были зафиксированы у юношей с генотипом СС по полиморфизму -786Т>С гена еNOS. У юношей с данным генотипом уровень ИПС после нагрузки оказался выше, чем у юношей с генотипами ТТ и ТС, на 8,8 % (р = 0,05) и 10,8 % (р = 0,01) соответственно. У юношей по сравнению с девушками после проведения пробы Мартине - Кушелевского чаще выявлялась гипертоническая реакция (рис. 1). При этом у юношей выявлены статистически значимые различия по частоте встречаемости гипертонической реакции на нагрузку в зависимости от генотипа по полиморфизму -786Т>С гена еNOS (х2 = 13,4; р = 0,01). Наиболее часто гипертоническая реакция встречалась у юношей с генотипами СС (см. рис. 1). В основе этой реакции лежит повышение периферического сопротивления, т. е. спазм артериол. Таким образом, склонность лиц с генотипом СС к прессорным реакциям подтвердилась и при анализе типа гемодинамической реакции в тесте с дозированной физической нагрузкой. В группах девушек с генотипами ТТ, СТ, СС по полиморфизму -786Т>С гена еNOS преобладала нормотоническая реакция на нагрузку (рис. 2). Статистически значимой разницы по частоте встречаемости гипертонической реакции у девушек в зависимости от генотипа по исследуемому полиморфизму не было выявлено (х2 = 3,85, р > 0,05). Таким образом, можно сделать вывод, что генотип СС промотора гена еNOS (-786T>C) у юношей обусловливает склонность к периферическому вазоспазму и не влияет негативным образом на периферический сосудистый тонус у девушек. У девушек во всех группах после выполнения пробы с дозированной физической нагрузкой ПД составляло менее 60 мм рт. ст. У юношей в отличие от девушек после проведения пробы Мартине - Кушелевского вне зависимости от генотипа было выявлено высокое ПД. Наиболее высокий уровень ПД после проведения пробы был зафиксирован у юношей с генотипом СС. У юношей с данным генотипом уровень ПД после нагрузки оказался выше, чем у юношей с генотипами ТТ и ТС, на 8,5 % (р = 0,05) и 9,8 % (р = 0,02) соответственно. Нестабильность СДД свидетельствует о напряженности механизмов регуляции АД и является гемодинамическим фактором риска возникновения артериальной гипертензии [1]. У большинства девушек вне зависимости от генотипа по полиморфизму -786Т>С гена еNOS изменение СДД после нагрузки не превышало 15 % от исходного, статистической взаимосвязи с генотипом по данному показателю выявлено не было (х2 = 5,18, р > 0,05). У юношей была установлена статистически значимая связь данного показателя с генотипом СС (х2 = 6,25; р = 0,044). У 68,0 % юношей с данным генотипом СДД после нагрузки превышал фоновое значение более чем на 15 %. Таким образом, в качестве генетического предиктора формирования ряда гемодинамических факторов сердечно-сосудистого риска у юношей можно рассматри Рис 1. Частота встречаемости гипертонической реакции на дозированную физическую нагрузку среди лиц с разными генотипами по полиморфизму -786Т>С гена еЫОЭ 40 Экология человека 2018.04 Экологическая физиология Рис. 2. Частота встречаемости нормотонической реакции на дозированную физическую нагрузку среди лиц с разными генотипами по полиморфизму -786Т>С гена еNOS. вать генотип СС промотора гена еNOS (-786T>C), у девушек данный генотип не оказывает выраженного отрицательного влияния на механизмы регуляции АД. В целом результаты исследования позволяют сделать вывод, что генотип СС полиморфизма -786Т>С гена еNOS является генетическим предиктором риска артериальной гипертензии у юношей, проживающих на арктических и приарктических территориях, внося определенный негативный вклад в формирование ряда гемодинамических и сосудистых факторов риска развития этой патологии, в то время как его влияние на риск развития артериальной гипертензии у девушек, проживающих в этих же широтах, менее выражено. В связи с этим представляется целесообразным для более детального понимания патогенетических механизмов развития артериальной гипертензии дальнейшее проведение комплексных клинических исследований по изучению роли полиморфизма -786Т>С гена еNOS в возникновении этой патологии у мужчин различных возрастных групп.

About the authors

N A Bebyakova

Northern State Medical University

Email: nbebyakova@mail.ru
Arkhangelsk, Russia

O M Feliksova

Northern State Medical University

Arkhangelsk, Russia

A V Khromova

Northern State Medical University

Arkhangelsk, Russia

I A Shabalina

Northern State Medical University

Arkhangelsk, Russia

References

Supplementary files