THE INVOLVEMENT OF LEPTIN IN THE REGULATION OF PROGRAMMED CELL DEATH IN PERSONS WITH DYSLIPIDEMIA

Full Text

Stavinskaya O.A., Balashova S.N. The Involvement of Leptin in the Regulation of Programmed Cell Death in Persons with Dyslipidemia. Ekologiya cheloveka [Human Ecology]. 2015, 12, pp. 34-37. Лептин производится клетками жировой ткани адипоцитами и представляет собой белок молекулярной массой 16 кДа, важной функцией которого является регулирование энергетического баланса и массы тела организма [7]. Данный гормон увеличивает интенсивность липолиза за счет активизации ферментов малатдегидрогеназы, липопротеинлипазы и Jak/STAT [16], стимулирует фосфорилирование АМФКа [14], уменьшает содержание триглицеридов и секрецию их в печени [10]. Влияние лептина на иммунологическую реактивность, в частности на программируемую клеточную гибель (апоптоз), изучено в меньшей степени и ограничено результатами исследования гранулоцитов, дендритных клеток и CD4+ лимфоцитов. Так, по отношению к эозино-филам и базофилам лептин выступает как фактор 34 Экология человека 2015.12 Экологическая физиология выживания, предотвращая расщепление белков Bax и выход цитохрома с из митохондрий [5, 17]. При добавлении к дендритным клеткам лептин подавляет их апоптоз, индуцированный ультрафиолетом, путем фосфорилирования STAT-3, активизации NF-kB и регуляции экспрессии bcl-2 и bcl-xL генов [13]. Гормон вызывает пролиферацию CD4+CD45RA+ лимфоцитов, но препятствует увеличению количества CD4+CD45RO+ Т-клеток [11]. В связи с этим целью исследования явилось изучение особенностей программируемой гибели моноцитов, нейтрофилов и лимфоцитов крови у лиц с дислипидемией. Методы Проведено обследование 28 больных метаболическим синдромом. Диагноз поставлен врачами городского эндокринологического консультативного центра г. Архангельска. Исследование проводили с соблюдением основных норм биомедицинской этики. Для изучения взаимосвязи уровня лептина и состояния программируемой клеточной гибели в условиях дислипидемии были выделены две группы обследуемых лиц: с условно повышенным (>25 нг/мл, n = 13) и условно пониженным (<10 нг/ мл, n = 13) содержанием в крови лептина - медиана составляет 39,3 (32,2-45,2) и 8,6 (7,1 -9,4) нг/мл соответственно, p < 0,001. Группы были практически равноценны по возрасту (52,5 ± 1,4) и (50,7 ± 2,4) года и полу (женщины). Концентрацию цитокинов IL-6, IL-10, TNF-a и IFN-y в сыворотке крови определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (Invitrogen, США). Данным методом также выявляли уровни лептина и IgE в крови, используя реактивы компаний DRG и Dr. Fooke (Германия). Реакцию оценивали с помощью фотометра Multiskan MS (Labsystems, Финляндия) при длине волны 450 нм. Исследование уровня инсулина осуществлялось реактивами фирмы DRG на автоматическом иммуноферментном анализаторе EtoHs фирмы «Био-Рад» (Германия). Содержание фенотипов лимфоцитов определяли методом двойной пероксидазной метки с использованием моноклональных антител (НПЦ «МедБиоСпектр», Россия). Показатели липидного обмена (общий холестерин, триглицериды, АПО В) изучали в сыворотке крови на биохимическом анализаторе Stat fax 1904 Plus реагентами фирмы Human (Германия). В мазках крови, окрашенных по Романовскому - Гимзе, кроме лейкограммы определяли моноцитограмму и нейтро-грамму. В составе моноцитограмм устанавливали содержание промоноцитов, моноцитов и полиморфноядерных моноцитов. Нейтрофильные гранулоциты дифференцировали по содержанию фрагментов ядра, где выраженность апоптоза определяли по количеству нейтрофилов с пятью и более сегментами. Программируемую гибель лимфоцитов периферической крови оценивали с помощью FITC -аннексина-V, специфически связывающегося с участками фос-фатидилсерина на мембранах апоптозных клеток, и пропидиума йодида, позволяющего дифференцировать клетки с интактной и проницаемой мембраной. Анализ апоптотически измененных лимфоцитов AnV+/PI - проводился на проточном цитофлуориметре Epics XL (Beckman Coulter, США). Результаты исследования обработаны с использованием пакета прикладных программ Statistica 6 (StatSoft, США). Тип исследования ретроспективный, выборки случайные, одномоментные. Генеральная совокупность - жители севера европейской территории России. Границы нормального распределения количественных показателей определяли при помощи критерия Шапиро - Уилка. При анализе полученных результатов использовали среднее значение и стандартное отклонение, медиану и нижний, верхний квартили. Достоверность различий между группами оценивали с помощью параметрического t-критерия Стьюдента для независимых выборок и непараметрического критерия Уилкоксона. Статистическая достоверность присваивалась при значении p < 0,05. Результаты Установлено, что при увеличении концентрации лептина растет индекс массы тела с (27,4 ± 0,76) до (36,4 ± 2,05) кг/м2 и уровень инсулина в крови с (12,2 ± 1,09) до (14,4 ± 1,04) мгЕд/мл, p = 0,025. Повышается и медиана содержания общего холестерина, триглицеридов соответственно с 4,9 (4,1 -6,3) до 6,1 (5,9-6,7) моль/л, p = 0,045; и с 2,1 (1,1 -4,3) до 3,1 (2,4 - 3,6) моль/л, p = 0,47 и АпоВ (рис. 1). Рис. 1. Содержание АпоВ периферической крови в условиях различного уровня лептина у лиц с дислипидемией В условиях нарастания уровня сывороточного лептина меняется и динамика иммунологической реактивности обследуемых лиц. Так, увеличивается общее количество лейкоцитов с (5,46 ± 0,26) до (6,56 ± 0,31) x 109 кл/л, p = 0,039, за счет нейтрофилов с (2,95 ± 0,19) до (3,66 ± 0,22) x 109 кл/л, p = 0,036, и лимфоцитов с (1,92 ± 0,16) до (2,29 ± 0,16) x 109 кл/л, p = 0,038. Последние повышают экспрессию молекул активации (CD3+, CD25+), 35 Экологическая физиология Экология человека 2015.12 дифференцировки (CD4 + , CD8+), пролиферации и готовности к апоптозу (CD 10+, CD95+); увеличивается содержание натуральных киллеров (рис. 2). Все это отражается на процессе программируемой гибели лимфоцитов, так как увеличивается число апоптотических клеток AnV+/PI- с 5,8 (3,8-9,1) до 8,9 (4,2-15,4) %, p = 0,043. При исследовании нейтрограммы лиц с повышенной концентрацией лептина выявлено увеличение количества клеток с тремя, четырьмя, пятью и более сегментами ядра (рис. 3). Относительно нейтрофилов с двумя фрагментами ядра не установлено статистически значимых различий (p = 0,072), однако есть тенденция к повышению палочкоядерных форм с (0,17 ± 0,02) до (0,22 ± 0,04) x 109 кл/л. На этом фоне не меняется фагоцитарная активность грануло-цитов (27,2 ± 3,06) и (28,5 ± 3,5) %, p = 0,064, но снижается интенсивность данного процесса с (4,5 ± 0,69) до (3,6 ± 0,35) ед/кл, p = 0,021. Нарастание количества лептина ассоциировано с повышением общего содержания моноцитов с 0,29 (1,16-0,66) до 0,39 (0,32-0,52) x 109 кл/л, p = 0,013, что происходит в основном за счет зрелых моноцитов - 0,18 (0,14-0,23) и 0,09 (0,06-0,19) x 109 кл/л, p = 0,024, и не затрагивает уровня промоноцитов и полиморфноядерных клеток - соответственно 0,14 (0,09-0,19) и 0,11 (0,06-0,31) x 109 кл/л, p = 0,075; 0,08 (0,05-0,13) и 0,07 (0,06-0,15) x 109 кл/л, p = 0,078. Изменение цитокинового профиля реализуется посредством IFN-y и IL-10 (таблица), содержание TNF-a и IL-6 не имело статистически значимых различий (p = 0,068 и p = 0,059). Установлено, что с повышением количества лептина в крови значительно Рис. 2. Содержание фенотипов лимфоцитов периферической крови в условиях различного уровня лептина у лиц с дислипидемией Примечание. * - p < 0,001 по отношению к группе с пониженным содержанием лептина. увеличивается уровень IgE с 16,7 (12,1-44,7) до 73,9 (40,7-136,1) МЕ/мл, p = 0,001. Содержание цитокинов крови у лиц с дислипидемией при различной концентрации лептина, Ме (25-75) Цитокины, пг/мл Лептин >25 нг/мл Лептин <10 нг/мл IL-6 8,3(6,7-10,9) 8,5(6,4-10) IL-10 22,7(18,6-51,4) 19,6(15,1-28,3) IFN-y 18(4-30) 15,5(10-55) TNF-a 27,9(25,8 -30,1) 26,9(25,3-29,5) Обсуждение результатов С увеличением индекса массы тела и дислипидемии нарастает концентрация лептина в крови, что ассоциировано с интенсификацией всей последовательности клеточных событий (пролиферация, активизация, дифференцировка, антителообразование и апоптоз) у лимфоцитов и нейтрофилов. Известно, что лептин является структурным гомологом семейства цитокинов, включающих IL-6, IL-11, IL-12, лейкозингибирующий фактор (LIF) и G-CSF [18]. Рост пролиферации лимфоцитов ведет к повышению их общего содержания и закономерному апоптозу избыточно активированных и дифференцированных клеток. Пролиферативный эффект со стороны лептина достигается путем включения каскадных реакций JAK-STAT, IRS-1-PI3K и MAPK киназ, что стимулирует тирозин-фосфорили-рование белка Sam68, участвующего в диссоциации РНК [15]. Нельзя исключать возможности потенциального действия лептина на все этапы жизненного цикла клетки, так как показано наличие рецепторов к лептину (OB-Rb) на мембране лимфоцитов, моно Рис. 3. Нейтрограмма периферической крови лиц с дислипидемией в условиях различной концентрации лептина Примечание. По горизонтали - количество сегментов ядра нейтрофила. 36 Экология человека 2015.12 Экологическая физиология цитов и нейтрофилов [6]. Однако данное утверждение мы можем подтвердить относительно лимфоцитов и нейтрофилов; система моноцитов проявляет чувствительность к лептину лишь в момент активизации и функциональной зрелости без изменения со стороны пролиферирующих и апоптотических клеток. В литературе широко представлены сведения об ингибирующем влиянии лептина на программируемую гибель лимфоцитов, моноцитов и нейтрофилов [3, 8, 12, 15]. В основном указанные исследования касаются опытов in vitro без учёта дислипидемии. Этим мы объясняем разницу в полученных результатах. Если же рассматривать дислипидемию как фактор регуляции апоптоза, то существуют данные о нарушениях работы митохондрий лимфоцитов, вызванных накапливающимися хромосомными абберациями и укорочением те-ломер под влиянием дислипидемии [2, 4]. В частности, избыточные концентрации триглицеридов вызывают апоптоз макрофагов за счет повышения уровня цитозольного Ca2+ и реактивных кислородных радикалов, выхода цитохрома с из митохондрий, локализации AIF в ядре и активизации белков Bax. Процесс сопровождается появлением молекул фосфатидилсерина на плазматической мембране, расщеплением каспазы-3 и поли(АДФ-рибозы)-полимеразы [1]. В нашем исследовании у лиц с дислипидемией отмечается повышение в крови уровня IFN-y как в квартильном, так и среднем выражении с (20,3 ± 4,37) до (37,7 ± 6,47) пг/мл, p = 0,036, что подтверждает факт лептинзависимой дифференцировки Т-хелперов в направлении ^ 1 типа с преимущественным синтезом IFN-y и IL-2 [12]. Выявленное увеличение количества IgE свидетельствует об активизации антителообразования, что также ассоциировано с накоплением лептина в крови [9]. Таким образом, под действием дислипидемии нарастает концентрация лептина в крови, гормон стимулирует пролиферацию лимфоцитов и нейтрофилов: увеличивается общее количество данных клеток, нарастают процессы дифференцировки и, как следствие, активизируется апоптоз. В условиях избыточного количества лептина не меняетс

About the authors

O A Stavinskaya

Institute of Environmental Physiology Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: ifpa-olga@mail.ru

S N Balashova

Institute of Environmental Physiology Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

References

Supplementary files