Endoecology of the oral cavity and cytomorphological features of buccal epithelium in people with inflammatory periodontal diseases

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Эндоэкологический гомеостаз ротовой полости обеспечивается за счёт колонизационной резистентности микробиоты, её саморегуляции и высокого потенциала неспецифических и иммунных защитных реакций со стороны эпителиальных и иммунных клеток [1]. Буккальный эпителий — часть мукозальной иммунной системы — представляет собой многослойный плоский неороговевающий эпителий. Эпителиоциты экспрессируют сигнальные молекулы и участвуют в межклеточных взаимодействиях, формировании иммунного ответа, активации и регулировании воспалительных процессов. Не менее значимая особенность — уровень естественной колонизации эпителиоцитов, определяющий состояние местного иммунитета и эндоэкологический гомеостаз [2]. Микроорганизмы, находящиеся на поверхности эпителиоцитов, инвазируя эпителиальные клетки или оказывая воздействие на их структуру токсинами своей жизнедеятельности, инициируют секрецию цитокинов, поддерживая воспалительную реакцию. Клетки буккального эпителия экспрессируют, а при неблагоприятном воздействии — усиливают секрецию цитокинов, антимикробных пептидов и других медиаторов, взаимодействуя с нейтрофилами, эозинофилами, макрофагами, Т- и В-лимфоцитами. Образование цитокинов и хемокинов напрямую зависит от функционального состояния буккальных эпителиоцитов [3, 4].

Широко распространённые в Арктической зоне Российской Федерации стрессовые для организма человека факторы, такие как нарушение циркадного ритма, воздействие экстремальных условий окружающей среды, «экологические патогены», токсиканты, антропогенное загрязнение среды обитания, изменение характера питания и физической активности, вероятно, могут воздействовать на состав, функцию и метаболическую активность оральной микробиоты и влиять на состояние местного иммунитета [5, 6]. Одним из наиболее распространённых на Севере заболеваний полости рта является хронический пародонтит [7] — мультифакториальное заболевание, в основе которого лежит формирование микробной биоплёнки [3]. Воспалительные заболевания пародонта (ВЗП) на ранних стадиях обычно характеризуются слабовыраженной симптоматикой и часто не диагностируются вовремя, что обусловливает необходимость поиска новых методов для их раннего выявления. В центральных и южных регионах России у пациентов с ВЗП отмечается тенденция к нарастанию цитогенетической нестабильности буккального эпителия, повышению частоты встречаемости клеток с микроядрами [8]. Среди основных представителей резидентной микрофлоры полости рта выделяют оральные стрептококки (30–60%), вейлонеллы (25%) и дифтероиды (25%). В развитии ВЗП играют роль пародонтопатогенные виды 1-го порядка — Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Tannerella forsythia, Porphyromonas gingivalis («красный комплекс» по S.S. Socransky и др., 1998) и 2-го порядка — Eikenella corrodens, Fusobacterium nucleatum/periodonticum, Prevotella intermedia, Treponema denticola и др. [9]. В стоматологической практике изучение буккального эпителия представляет интерес, так как он является одним из основных маркёров состояния местного и общего эндоэкологического гомеостаза организма и его нарушений.

Цель исследования. Установить цитоморфологические особенности буккального эпителия и состояние микробиоты, колонизирующей биотопы ротовой полости при пародонтите, у лиц, проживающих в условиях Арктической зоны Российской Федерации.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Проведено поперечное клинико-лабораторное обследование 91 человека, постоянно проживающих в условиях Арктической зоны Российской Федерации (Архангельская область, г. Северодвинск). Выполнены анкетирование, стоматологический осмотр, цитоморфологический и молекулярно-генетический анализ. Сбор данных проведён в соответствии с международным стандартом GCP по методике, рекомендованной ВОЗ. Протокол исследования одобрен локальным этическим комитетом Северного государственного медицинского университета (протокол № 08/11 от 28.11.2018 г.).

Критерии включения пациентов в исследование: возраст от 18 до 45 лет; заполненное письменное информированное согласие на участие; хронический пародонтит лёгкой и средней степени; удовлетворительный уровень гигиены; проживание в условиях Арктической зоны Российской Федерации не менее 5 лет. В исследование не включали пациентов по следующим критериям: отсутствие письменного информированного согласия на участие; возраст до 18 и старше 45 лет; наличие острых или хронических соматических заболеваний в стадии обострения. Критерии исключения: другие воспалительные или дегенеративные заболевания в полости рта, в частности острые и хронические формы гингивита, хронический пародонтит тяжёлой степени, локализованные формы пародонтита и патологические виды прикуса; беременность и послеродовый период; невозможность проведения всего объёма планируемых исследований.

Обследованные были разделены на 2 группы:

• 1-я группа (n=67) — пациенты с диагнозом К05.31 (хронический (генерализованный) пародонтит лёгкой, средней степени) в соответствии с МКБ-10;
• 2-я группа (n=24) — контрольная (пациенты с интактным пародонтом).

Клинический материал для исследования клеток буккального эпителия получали путём соскоба со здорового участка слизистой оболочки щеки, наносили на обезжиренное стекло и высушивали при комнатной температуре. Препараты фиксировали в 96% этиловом спирте с последующим окрашиванием по Романовскому–Гимзе [10, 11].

Цитологическое исследование проводили под иммерсией, с использованием светового микроскопа Axio Scope A1 (Carl Zeiss, Germany) при помощи программного комплекса «МЕКОС-Ц2» («МЕдицинские КОмпьютерные Системы (МЕКОС)», Россия). В полученных образцах исследовали реакцию адсорбции микроорганизмов (РАМ), индекс дифференцировки клеток (ИДК) и индекс кератинизации (ИК). В соскобах фиксировали цитогенетические нарушения (наличие микроядер, протрузий), показатели апоптоза (кариорексис, кариолизис) и пролиферативные процессы (наличие многоядерных и двуядерных клеток).

Для определения РАМ в препаратах рассчитывали количество бактерий, адсорбированных на поверхности каждой эпителиальной клетки (расчёт проводили на 100 клеток). По количеству микроорганизмов клетки были разделены на 5 групп, определена их принадлежность к отрицательной РАМ (РАМ–) или положительной РАМ (РАМ+). Неспецифическую резистентность слизистой оболочки рта определяли в зависимости от количества клеток с РАМ+. Удовлетворительный показатель РАМ+ фиксировали при 31% и выше.

Индекс дифференцировки клеток определяли с помощью окуляра-линейки в соскобах: вычисляли ядерно-цитоплазматическое соотношение 100 эпителиальных клеток, на основании которого оценивали степень дифференцировки каждого эпителиоцита и присваивали одну из 6 степеней дифференцировки. ИДК вычисляли по формуле ИДК = 1a+2б+3в+4г+5д+6е, где 1–6 — цифровое обозначение степеней дифференцировки, а, б, в, г, д, е — процент клеток соответствующей степени дифференцировки. Удовлетворительным значение ИДК считали в пределах 450–470.

Индекс кератинизации определяли, рассчитывая процент безъядерных клеток по формуле: ИК = (число ороговевших клеток / общее количество клеток)×100. Удовлетворительные значения ИК определяли в пределах 15–25% [11, 12].

Маркёрные пародонтопатогены Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Tannerella forsythia, Treponema denticola, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia и Candida albicans выявляли методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени в соответствии с инструкциями к наборам реагентов «ПародонтоСкрин» («ДНК-Технология», Россия). В качестве клинического материала использовали отделяемое зубодесневого кармана, полученное в ходе амбулаторного приема путём аспирации с помощью стерильного шприц-тюбика. Полученную пробу (2 мл) центрифугировали при 1500 об./мин в течение 20 мин. Аликвоты образцов замораживали и хранили при –80 °С до проведения молекулярно-генетических исследований.

Статистическая обработка полученных результатов проведена с помощью пакета программ Stata 12 (StataCorp, США). Категориальные переменные представлены в виде абсолютных чисел и долей (%). Для определения значимости различий между количественными и качественными данными применяли критерий χ² Пирсона. Корреляционные взаимосвязи оценивали с помощью критерия Спирмена [13]. Критический уровень статистической значимости составил р ≤0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Функциональная характеристика клеток буккального эпителия включает определение способности адгезии микроорганизмов на поверхности клетки. Так, при цитологическом исследовании мазков буккального эпителия отмечено наличие бластоспор и псевдомицелия C. albicans, преобладающих в основной группе (р=0,024 и р=0,011). Кокковая флора, объединённая в микробные конгломераты, представлена стафилококками, стрептококками и диплококками и преобладает в группе с ВЗП (87,91; 67,03; 63,74% при р=0,024, р <0,001, р=0,002 соответственно). В ходе оценки РАМ установлено, что во всех образцах выявлена РАМ+. Несмотря на это, неудовлетворительный показатель резистентности слизистой оболочки рта преобладал в 1-й группе (с ВЗП) (41,2%; р=0,011).

Индекс дифференцировки клеток в преобладающей степени оказался неудовлетворительным в обеих исследуемых группах (72,5%). Распределение по группам было следующим: удовлетворительный ИДК преобладал у здоровых пациентов (62,5%), в группе с пародонтитом он отмечен лишь у 13,4%. Неудовлетворительный индекс отмечался в группе с ВЗП (85,0%; р <0,001).

Изучение степени ороговения слизистой оболочки рта (что характеризует её барьерную функцию) показало явное преобладание неудовлетворительных показателей в группе с ВЗП (88%; р <0,001). Удовлетворительный уровень кератинизации в группе здоровых лиц составил 62,5% (р <0,001). Результаты индексной оценки представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Индексная оценка клеток буккального эпителия в сравниваемых группах, %

Table 1. Index score of buccal epithelial cells in the study groups, %

Показатель Indicator	Результат Result	Группа контроля Control group (n=24)	Пациенты с воспалительными заболеваниями пародонта Patients with inflammatory periodontal diseases (n=67)	р	χ2
Индекс дифференцировки клеток Cell differentiation index	Неудовлетворительный Poor	37,5	85,0	<0,001	20,072
	Удовлетворительный Satisfactory	62,5	15,0
Индекс кератинизации Keratinization index	Неудовлетворительный Poor	37,5	88,0	<0,001	38,270
	Удовлетворительный Satisfactory	62,5	12,0
Реакция адсорбции микроорганизмов Microbial cell adsorption reaction	Удовлетворительный Satisfactory	87,5	58,7	0,011	6,473
	Неудовлетворительный Poor	12,5	41,2

 

Проведённое исследование выявило следующие цитологические нарушения буккальных эпителиоцитов. В группе пациентов с хроническим пародонтитом установлено наличие микроядер (88%), протрузий (71,6%), отмечены показатели пролиферации (двуядерные клетки 89,5%) и апоптоза (каролизис — 10,4% и кариорексис — 26,8%). В контрольной группе отмечали наличие микроядер (87,5%), протрузии (29,2%) и двуядерных клеток (37,5%). Показателей деструкции ядер в данной группе не выявлено. Клеток с кариопикнозом не обнаружено ни в одной из групп (табл. 2).

 

Таблица 2. Средние значения и пределы варьирования кариологических показателей буккальных эпителиоцитов в обследуемых группах, M±S

Table 2. Mean values and limits of variation in the karyological parameters of buccal epithelial cells in the studied groups, M±S

Показатели (частота встречаемости) Indicators (rate of occurrence)	Группа контроля Control group (n=24)	Пациенты с воспалительными заболеваниями пародонта Patients with inflammatory periodontal diseases (n=67)	р
Клеток с микроядрами Cells with micronuclei	1,45±0,80	8,20±3,60	0,024
Клеток с протрузиями Cells with protrusions	0,29±0,46	3,40±3,35	0,043
Двуядерных клеток Binuclear cells	0,37±0,57	8,71±5,0	0,012
Клеток с кариорексисом Cells with karyorhexis	0,08±0,28	0,73±1,10	0,056
Клеток с кариолизисом Cells with karyolysis	0	0,58±1,23	0,062

 

В исследовании оценивали маркёры пародонтопатогенных микроорганизмов зубодесневого кармана, колонизирующих экосистему при пародонтите. У пациентов 1-й группы частота выявления пародонтопатогенных бактерий составила 86,6%. Наиболее часто (70,1%) выявляли маркёры P. gingivalis, в 41,8% случаев — T. forsythia, в 22,4% — A. actinomycetemcomitans, в 26,9% — C. albicans, в 11,9% — P. intermedia, в 6,0% — Т. denticola. Интересной особенностью стало выявление ассоциаций пародонтопатогенных бактерий у 12 пациентов (17,8%): наиболее часто встречалась ассоциация пародонтопатогенных представителей 1-го порядка P. gingivalis с A. actinomycetemcomitans (13,4%).

Анализ полученных данных показал, что в группе контроля частота выявления пародонтопатогенных видов бактерий составила 29,2% — преимущественно пародонтопатогенных представителей 2-го порядка P. intermedia (20,8%) и Т. denticola (8,3%). Ассоциации пародонтопатогенов и представители 1-го порядка в группе контроля не выявлены.

Для выделения связей между выявленными видами пародонтопатогенов и нарушениями клеток буккального эпителия у представителей обеих групп был проведён корреляционный анализ цитоморфологических изменений клеток буккального эпителия (табл. 3), который показал, что в группе пациентов с хроническим пародонтитом установлена выраженная корреляционная зависимость средней и слабой степени между наличием клеток с цитоморфологическими нарушениями и определением P. gingivalis: клетки с микроядрами (r=0,413; p <0,001), клетки с протрузиями (r=0,228; p=0,029), двуядерные клетки (r=0,402; p <0,001) и показатели апоптоза (r=0,283; p=0,006 и r=0,383; p <0,001). Положительные корреляции средней степени установлены между всеми исследуемыми цитоморфологическими нарушениями и выделением пародонтопатогена T. forsythia. Отмечены положительные корреляции между выявлением клеток с наличием микроядер и наличием двуядерных клеток с выделенным пародонтопатогеном A. actinomycetemcomitans (r=0,333; p=0,001 и r=0,231; p=0,027). Прямые корреляции средней степени установлены между выделением пародонтопатогенов в ассоциациях и наличием клеток с протрузиями, показателями пролиферации и апоптоза.

 

Таблица 3. Корреляционная матрица цитоморфологических изменений клеток буккального эпителия и маркеров пародонтопатогенных микроорганизмов

Table 3. Correlation matrix of cytomorphological changes in the buccal epithelial cells and markers of periodontopathogenic microorganisms

Показатели Indicators	Цитогенетические аномалии Cytogenetic abnormalities		Показатели пролиферации Proliferation indicators	Показатели апоптоза Apoptosis indicators
	Наличие микроядер Micronuclei	Протрузия Protrusion	Наличие двуядерных клеток Binuclear cells	Кариорексис Karyorhexis	Кариолизис Karyolysis
Пародонтит | Periodontitis
P. gingivalis	r=0,4133 (p <0,001)	r=0,2280 (p=0,029)	r=0,4026 (p <0,001)	r=0,2831 (p=0,006)	r=0,3831 (p <0,001)
T. forsythia	r=0,3528 (p <0,001)	r=0,7858 (p <0,001)	r=0,6666 (p <0,001)	r=0,4135 (p <0,001)	r=0,3745 (p <0,001)
A. actinomycetemcomitans	r=0,3332 (p=0,001)	r=–0,1147 (p=0,279)	r=0,2312 (p=0,027)	r=–0,0789 (p=0,457)	r=0,0510 (p=0,631)
Ассоциации пародонтопатогенов Associations of periodontopathogens	r=0,1090 (p=0,303)	r=0,3034 (p=0,003)	r=0,3522 (p <0,001)	r=0,4482 (p <0,001)	r=0,4867 (p <0,001)
Контроль | Control
P. intermedia	r=–0,1624 (p=0,124)	r=–0,1892 (p=0,0725)	r=–0,2766 (p=0,008)	r=–0,2160 (p=0,039)	r=–0,1875 (p=0,075)
Т. denticola	r=0,0812 (p=0,444)	r=0,0656 (p=0,536)	r=0,0732 (p=0,491)	r=0,1651 (p=0,117)	r=0,2351 (p=0,024)

 

У обследованных контрольной группы выявлены отрицательные корреляции слабой силы между показателями пролиферации и апоптоза (кариорексис) с определением P. gingivalis (r=–0,276; p=0,008 и r=–0,216; p=0,039).

ОБСУЖДЕНИЕ

Ключевая функция клеток буккального эпителия в реакциях неспецифического и специфического реагирования иммунной системы делает их ключевыми клетками во взаимодействии с профессиональными индукторными и эффекторными клетками. Микробные факторы изменяют функциональный статус эпителиоцитов, включают их в образование порочных кругов, инициирующих хронический воспалительный процесс [14]. Присутствие стрептококков в цитологических препаратах относят к нормофлоре [9], однако увеличение количества адгезированных микроорганизмами клеток в цитограммах свидетельствует о снижении неспецифической резистентности организма и повышении риска развития воспалительных заболеваний полости рта. Выявленные признаки митотической активности C. albicans, преобладание клеток с представителями кокковой флоры и микробных конгломератов, адгезированных на поверхностях эпителиоцитов, указывают на явное нарушение микробного равновесия в группе с ВЗП. Выявленное в нашем исследовании изменение уровня естественной колонизации эпителиоцитов может свидетельствовать об ослаблении колонизационной резистентности слизистой оболочки рта у лиц с пародонтитом, что находит отражение в работах исследователей из других регионов Российской Федерации [8, 10].

Неудовлетворительные результаты РАМ говорят о дестабилизации адаптационных механизмов — это потенциал для развития воспалительных реакций и в целом ослабление неспецифической резистентности как в полости рта, так и на системном уровне. Соответственно лица с неудовлетворительными результатами могут войти в группу риска с ослаблением колонизационной резистентности к условно-патогенным микроорганизмам, развитием дисбиоза, что в свою очередь может привести к развитию пародонтита либо значительно утяжелить его течение [2, 11].

Функциональный статус клеток буккального эпителия формируется в зависимости от степени их зрелости. Буккальные эпителиоциты представлены разными стадиями дифференцировки — от малодифференцированных предшественников, расположенных в базальном слое и обеспечивающих обновление эпителиального пласта, до более дифференцированных клеток, смещающихся в поверхностные слои [4, 12, 15]. Преобладание парабазальных клеток отражает общее омоложение эпителиального пласта и преобладание процессов пролиферации, что свидетельствует о высокой активности регенераторного процесса [16].

Полученные результаты оценки ИК показывают, что в контрольной группе протекают естественные биологические процессы старения эпителиоцитов. В группе с ВЗП практически полное отсутствие безъядерных клеток свидетельствует о снижении репаративной регенерации клеток буккального эпителия.

При анализе показателей деструкции ядер статистически значимых различий между группами не выявлено. Однако незначительное повышение показателей в 1-й группе по сравнению с контрольной может свидетельствовать об активной элиминации повреждённых клеток в ответ на бактериальную инвазию [8, 17].

Микроядра образуются при нарушении клеточного деления или фрагментации ядра. К причинам возникновения аномалии можно отнести влияние инвазивных свойств и факторов агрессии пародонтопатогенных бактерий, присутствующих при ВЗП.

В ходе анализа показателей цитологических нарушений при ВЗП по регионам Российской Федерации установлено, что частота встречаемости клеток с аномалиями в южных и центральных регионах ниже, чем в Арктической зоне. Так, по данным изучения микроядерного теста у пациентов с ВЗП в южных регионах Российской Федерации, микроядра встречались с меньшей частотой, как и кариорексис [8, 9, 18]. Увеличение числа клеток с выявленными микроядрами и протрузиями ядер является показателем генетических нарушений [10].

В нашем исследовании морфологические признаки нарушения пролиферации регистрировались в соскобах у лиц с ВЗП (рис. 1). Увеличение количества двуядерных клеток может свидетельствовать о повышении пролиферативной активности и усилении регенеративных процессов. Появление многоядерных эпителиоцитов чаще связывают с результатом слияния клеток друг с другом или нарушением процесса цитотомии, что в свою очередь может быть результатом влияния различных факторов, таких как стресс, микробная инвазия, воспалительные процессы в полости рта.

 

Рис. 1. Цитологические нарушения в клетках буккального эпителия пациентов с воспалительными заболеваниями пародонта:

а — норма; b — микроядра; c — протрузия; d — двуядерные клетки; e — кариорексис; f — кариолизис.

 

Микробный фактор играет ведущую роль в возникновении и прогрессировании ВЗП, лежит в основе альтерации эпителиальной ткани, появления цитоморфологических аномалий и нарушения эндоэкологического равновесия [9, 19].

Модуляция эпителиального барьера слизистой оболочки патогенными бактериями, по-видимому, является критическим шагом в инициации и прогрессировании заболеваний пародонта. Пародонтопатогены, такие как P. gingivalis, нарушают структурную и функциональную целостность эпителия слизистой оболочки рта; прикрепляясь к эпителиальным клеткам, проникают в них и размножаются, подавляя реакцию хозяина на бактериальные вызовы; инактивируя иммунные клетки и молекулы, активируют процессы, ведущие к разрушению тканей [20, 21]. Т. forsythia почти всегда определяется в ассоциации с Р. gingivalis. Некоторые авторы предполагают, что T. forsythia могут также проникать и существовать в эпителиальных клетках слизистой оболочки рта [7, 11]. Одним из факторов вирулентности Т. forsythia является способность к цитотоксический активности и инициации апоптоза. A. actinomycetemcomitans, проникая в эпителиальные клетки, нарушает местный гомеостаз и защитную систему организма. Протеины A. actinomycetemcomitans (особенно лейкотоксин) индуцируют апоптоз иммунных клеток [9]. Представленные данные о выделенных пародонтопатогенах находят отражение в корреляционных взаимосвязях с цитоморфологическими аномалиями клеток буккальных эпителиоцитов, что свидетельствует о вовлечённости клеток слизистой оболочки рта в характер течения ВЗП. Адаптивная способность пародонтопатогенов, позволяющая им выживать в эпителиальных клетках и разрушать компоненты ткани пародонта, а также влиять на иммунный ответ организма, видимо, способствует возникновению и прогрессированию пародонтита. Вероятно, повышение частоты встречаемости цитологических аномалий клеток буккального эпителия в Арктической зоне Российской Федерации может быть следствием высокой частоты встречаемости пародонтопатогенов, а также действующих стрессорных факторов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Воспаление пародонтальных тканей обеспечивается сдвигами эндоэкологического равновесия: сочетанным действием пародонтопатогенных микробов, запускающим каскад иммунных реакций, которые приводят к повреждению тканевого микроокружения, в первую очередь клеток буккального эпителия.

Инвазивные, адгезивные и токсические свойства маркёрных пародонтопатогенов P. gingivalis, T. forsythia и их ассоциаций лежат в основе сдвигов процессов репаративной регенерации слизистой оболочки ротовой полости и регуляции местного иммунитета. Появление нетипичных эпителиальных клеток с микроядрами, протрузиями и многоядерных клеток, нарушение процессов дифференцировки и кератинизации свидетельствуют о снижении реактивности эпителиоцитов, угнетении местного и системного иммунного ответа на микробную инвазию.

Цитологическое исследование клеток буккального эпителия может быть рекомендовано в качестве оценки системных и локальных реакций организма в диагностике воспалительных заболеваний пародонта, а также являться одним из методов оценки эффективности лечебно-профилактических мероприятий при воспалительных заболеваниях пародонта.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ /ADDITIONAL INFORMATION

Вклад авторов. А.С. Галиева внесла существенный вклад в концепцию и дизайн исследования, получение, анализ и интерпретацию данных, подготовила первый вариант статьи; Н.В. Давидович внесла существенный вклад в концепцию исследования, анализ и интерпретацию данных, участвовала в подготовке первого варианта статьи; А.С. Оправин, Т.А. Бажукова, Е.Н. Башилова и Т.Ю. Гагарина участвовали в анализе данных, окончательно утвердили присланную в редакцию рукопись; Л.Л. Шагров внёс существенный вклад в анализ данных, проводил цитологическое исследование.

Authors contribution. A.S. Galieva made a significant contribution to the concept and design of the study, data acquisition, analysis, and interpretation, prepared the first version of the article; N.V. Davidovich made a significant contribution to the concept of the study, analysis, and interpretation of data, participated in the preparation of the first version of the article; A.S. Opravin, T.A. Bazhukova, E.N. Bashilova and T.J. Gagarina — participated in the analysis of the data, finally approved the manuscript sent to the editorial office; L.L. Shagrov — made a significant contribution to the analysis of data, conducted a cytological study.

Funding source. The project did not have financial support.

Финансирование исследования. Исследование проведено на личные средства авторского коллектива.

Конфликт интересов отсутствует.

Competing interests. The authors declare that there is no conflict of interests.

About the authors

Aleksandra S. Galieva

Northern State Medical University

Author for correspondence.
Email: alexgalieva@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7037-7730
SPIN-code: 3054-9139

assistant lecturer

Russian Federation, Arkhangelsk

Natalija V. Davidovich

Northern State Medical University

Email: nvdavidovich@gmail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6414-9870
SPIN-code: 5230-2125

Cand. Sci. (Med.), assistant professor

Russian Federation, Arkhangelsk

Aleksandr S. Opravin

Northern State Medical University

Email: opravinas@nsmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-0057-3357
SPIN-code: 7270-2960

Dr.Sci. (Med.), professor

Russian Federation, Arkhangelsk

Tat’jana A. Bazhukova

Northern State Medical University

Email: tbazhukova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7890-2341
SPIN-code: 2220-2151
Russian Federation, Arkhangelsk

Leonid L. Shagrov

Northern State Medical University

Email: leonidshagrov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2655-9649
SPIN-code: 3842-2145

junior research associate

Russian Federation, Arkhangelsk

Elena N. Bashilova

Northern State Medical University

Email: ebashilova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9247-6633
SPIN-code: 9526-8284
Russian Federation, Arkhangelsk

Tat’jana J. Gagarina

Northern State Medical University

Email: gagarlic@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3071-4146
SPIN-code: 3594-2167

Cand. Sci. (Med.), assistant professor

Russian Federation, Arkhangelsk

References

Supplementary files