Immunological and genetic profile of the pediatric population in the nitrate geochemical province

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

В последние десятилетия отмечается избыточное загрязнение подземных водных объектов нитратами в результате антропогенного воздействия (интенсивное использование почв для земледелия и животноводства, применение азотсодержащих удобрений и пестицидов, использование навоза в качестве органического удобрения, утечки из коммунальных сетей) и естественных природных процессов, формирующих химический состав воды (изменение уровня грунтовых вод, атмосферные осадки, внутриводоёмные процессы нитрификации). Установлено, что именно с питьевой водой в организм поступает большая часть нитратов, формирующих нитратную нагрузку [1, 2]. Негативное влияние на показатели здоровья оказывают также N-нитрозамины, предшественниками которых являются нитриты и нитраты. Показано, что содержание нитратов в воде хозяйственно-питьевого назначения на уровне регламентируемого (по данным ВОЗ, 50 мг/дм³ по NO₃^-) способствует образованию N-нитрозаминов, которые даже в низкой концентрации формируют вероятность возникновения неблагоприятных последствий для здоровья [3]. При поступлении в организм через желудочно-кишечный тракт до 90% нитратов всасывается в системный кровоток [4]. Путём построения экспериментальной модели и математического моделирования подтверждена прямая зависимость между концентрацией нитратов в питьевой воде и уровнем нитрат-иона в моче, концентрацией нитратов в питьевой воде и содержанием N-нитрозаминов в крови [5, 6]. Результаты экспериментальных и клинических исследований продемонстрировали, что избыточное поступление нитратов с питьевой водой способствует развитию метгемоглобинемии, опосредует дисбаланс ферментативной системы печени и соотношение окислительно-восстановительных реакций в клетке, обусловливает нарушение функции сердечно-сосудистой системы и желудочно-кишечного тракта [2, 5, 7]. Постоянное потребление воды с повышенным содержанием нитратов оказывает наиболее выраженное негативное влияние на показатели здоровья детей в связи с их возрастными анатомо-физиологическими особенностями (несформированная восстанавливающая ферментная система, незрелая детоксикационная функция печени, особенности формирования и состава микробиоты и др.), при этом дошкольный возраст является критическим периодом становления иммунной системы [7]. Дети в период интенсивного роста и развития особенно восприимчивы к токсическому действию ксенобиотиков, при этом ответ организма контролируется индивидуальной генетической программой. Ряд исследователей утверждают, что N-нитрозамины обладают тератогенной, мутагенной и канцерогенной активностью [1, 2, 4, 6, 7]. Ген семейства цитохрома CYP1A1 и родственные ему изоформы катализируют биоактивацию нитрозаминов в реакционноспособные электрофильные промежуточные соединения, которые образуют аддукты ДНК, приводящие к канцерогенезу [8]. Матриксная металлопротеиназа 9 (желатиназа В) участвует в ремоделировании тканей, формировании многочисленных соматических заболеваний, в том числе центральной нервной системы, выполняет важную роль в ангиогенезе, метастазировании и прогрессировании рака, обладает как проапототической, так и антиапоптотической активностью [9, 10]. Проапоптотическая активность ММР9 обусловлена её способностью изменять состав внеклеточного матрикса. И наоборот, антиапоптотическая активность обусловлена расщеплением FAS-лиганда, активацией протеинкиназы B. Ядерный рецептор активатора пролиферации пероксисом PPARD характеризуется способностью связываться со множеством лигандов, оказывает влияние на различные физиологические процессы в организме. Так, PPARD, активируя сигнальные пути МАРК (mitogen-activated protein kinase, митоген-активируемая протеинкиназа), участвует в регуляции апоптоза и клеточной дифференцировке, играет важную роль в энергетическом обмене, метаболизме и клеточном воспалении [11].

На сегодняшний день накоплены обширные сведения с различной доказательной базой о высоком риске нарушения здоровья от избыточного воздействия нитратов, поступающих в организм с питьевой водой. Вместе с тем остаются нерешёнными задачи по своевременному выявлению и предупреждению нарушений здоровья у детского населения геохимической провинции с повышенным содержанием нитратов. Очевидно, на современном этапе в области медико-биологических наук требуются дополнительные сведения об особенностях иммунного ответа и генетического профиля у детей в условиях нитратной геохимической провинции, что обусловливает актуальность настоящего исследования.

Цель исследования. Изучить особенности иммунного статуса и генетического профиля детского населения нитратной геохимической провинции (на примере Пермского края).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Выполнено одномоментное (поперечное) исследование с соблюдением этических требований Хельсинкской декларации ВМА (Всемирная медицинская ассоциация). До начала исследовательской работы получено одобрение локального этического комитета федерального бюджетного учреждения науки «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» (ФБУН «ФНЦ МПТ УРЗН») Роспотребнадзора. Проведено углублённое обследование 78 детей дошкольного возраста, проживающих на территориях с различным содержанием нитратов в питьевой воде и посещающих детские дошкольные учреждения (ДДУ), расположенные на данных территориях. В группу сравнения включены 43 ребёнка (средний возраст 5,6±0,2 лет), потребляющие питьевую воду удовлетворительного качества по содержанию нитратов из подземных источников. Группу наблюдения составили 35 детей (средний возраст 5,4±0,3 лет), потребляющие питьевую воду из подземных источников питьевого водоснабжения с повышенным содержанием нитратов. Критерии включения в исследование: возраст 5–7 лет, принадлежность к группе здоровья I и II, отсутствие указаний о приёме иммунотропных препаратов за последние 6 месяцев, подписанная форма информационного согласия законных представителей детей на участие в исследовании. Критерии исключения: принадлежность к группе здоровья III и IV, участие детей в другом исследовании. Обследуемые дети группы наблюдения и группы сравнения проживали в условиях, соответствующих гигиеническим требованиям.

Исследования водопроводной воды на территории наблюдения и территории сравнения включали определение нитратов в соответствии ПНД Ф (природоохранные нормативные документы федеративные) 14.1:2:4.157-99 (с применением системы капиллярного электрофореза «Капель», Россия). В биосредах (кровь, моча) детей определяли массовые концентрации N-нитрозаминов и нитрат-ионов согласно МУК (методические указания) 4.1.3479-17, ПНД Ф 14.1:2:4.157-99 (газовый хроматограф Agilent 7890А, USA, система капиллярного электрофореза «Капель», Россия).

Технологией проточной цитометрии выполнена оценка показателей, характеризующих иммунный статус: субпопуляции лимфоцитов – CD3⁺CD16⁺CD56⁺ (CD, cluster of differentiation, кластер дифференцировки; natural killer T cells, натуральные киллерные Т-клетки, NKT), CD3⁺CD25⁺, CD4⁺CD25⁺CD127^– (regulatory cells, регуляторные клетки, Treg), CD3⁺CD95⁺ (FAS), внутриклеточные белки — р53, bax, bcl-2, показатели апоптоза — Annexin V-FITC⁺PI^– (ранний апоптоз) (Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC)/propidium iodide (PI); Аннексин V-флуоресцеин-изотиоцианат/пропидий йодид), Annexin V-FITC⁺PI⁺ (поздний апоптоз и/или некроз) (прибор FACSCalibur «Becton Dickinson», USA; реагенты «Becton Dickinson», USA). В качестве биоматериала использована суспензия мононуклеарных клеток периферической крови, выделенных путём центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографин. Уровень интерлейкина-17 (IL-17) в сыворотке крови изучен методом иммуноферментного анализа (прибор Sunrise «Tecan», Austria; тест-системы «Вектор-Бест», Россия).

Полиморфизм генов кандидатов оценивался методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени c оценкой аллельной дискриминации, биоматериалом являлся буккальный эпителий (прибор BioRAD CFX96, USA; реагенты ООО «Синтол», Россия). Исследованы особенности вариаций однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) генов: CYP1A1 (rs1048943) (цитохром Р450), MMP9 (rs17576) (матриксная металлопротеиназа), PPARD (rs2016520) (рецептор D активатора пролиферации пероксисом). Статистический анализ генов кандидатов выполнен при помощи мультипликативной, общей, доминантной и рецессивной моделей наследования, с расчётом показателей хи-квадрат (χ²), OR — оценка шансов, CI — доверительный интервал в программе SNPstats.

Процедуры статистического анализа данных осуществляли с использованием пакета STATISTICA 6.0 (StatSoft, USA). Для проверки статистических гипотез о виде распределения был применен критерий Колмогорова–Смирнова. Во всех случаях распределение признаков соответствовало закону нормального распределения. Для проверки нулевых гипотез о равенстве средних значений между двумя независимыми группами применялся t-критерий Стьюдента. При описании данных использовали среднее арифметическое значение, стандартную ошибку средней арифметической (М±m) и 95%-ный доверительный интервала для среднего (95% ДИ). Для установления вероятностной причинно-следственной связи «химический фактор в крови–показатель иммунного статуса» использован простой логистический регрессионный анализ. Критическое значение уровня статистической значимости при проверке нулевых гипотез принималось равным 0,05. Если значение p было меньше 0,001, то p указывали в формате p <0,001.

РЕЗУЛЬТАТЫ

При оценке качества хозяйственно-питьевого водоснабжения обнаружены превышения ПДК (предельно-допустимая концентрация) по нитратам в пробах, отобранных на территории наблюдения. Доля нестандартных проб по содержанию нитратов составила 33,3%. Максимальная концентрация нитратов в питьевой воде составила 54,1 мг/дм³ (1,2 ПДК). Установлено, что на территории наблюдения среднее содержание нитратов в питьевой воде (31,17±3,12 мг/дм³) статистически значимо (t=6,09, р <0,001) в 2,8 раза превышает значения, выявленные на территории сравнения (11,03±1,10 мг/дм³). Установлено, что у детей с территории, характеризующейся повышенным содержанием нитратов в воде централизованной системы хозяйственно-питьевого водоснабжения, в крови статистически значимо (р <0,05) в 2,3 раза повышено содержание N-нитрозодиэтиламина, а в моче в 1,6 раза содержание нитрат-иона относительно значений, выявленных у детей, проживающих на территории, характеризующейся удовлетворительным качеством питьевой воды по содержанию нитратов (табл. 1). Данные химико-аналитического исследования свидетельствуют об идентификации в моче детей группы наблюдения N-нитрозодиметиламина (0,01±0,002 мкг/мл) и N-нитрозодиэтиламина (0,0005±0,00013 мкг/мл), которые в норме не должны обнаруживаться.

 

Таблица 1. Содержание химических соединений в биосредах у детского населения, М±m

Table 1. Concentrations of chemical compounds in biological fluids in the pediatric population, М±m

Контаминант Contaminant	Группа сравнения Comparison group	Группа наблюдения Observation group	t	р
Контаминант в крови, мкг/мл Blood contaminant, µg /ml
N-нитрозодиметиламин N-nitrosodimethylamine	0,00014±0,00007	0,00018±0,00004	0,50	0,983
N-нитрозодиэтиламин N-nitrosodiethylamine	0,0008±0,0003	0,0018±0,0004	2,00	0,049
Контаминант в моче, мкг/мл Contaminant in urine, µg /ml
Нитрат-ион Nitrate ion	16,68±2,23	26,11±4,61	2,05	0,044

Примечание: М — среднее арифметическое значение; m — стандартная ошибка средней арифметической.

Note: М — arithmetic mean; m — standard error of the arithmetic mean.

 

У детей, проживающих в условиях нитратной геохимической провинции, статистически значимо (р <0,05) в 1,3 раза снижено количество NKT-лимфоцитов по сравнению с результатами, полученными у детей, проживающих на территории с удовлетворительным качеством питьевой воды по содержанию нитратов (табл. 2). Установлено, что у детей, потребляющих некачественную питьевую воду, статистически значимо (р <0,05) в среднем в 1,3 раза повышается абсолютное число CD3⁺CD25⁺-лимфоцитов, содержание CD3⁺CD95⁺-лимфоцитов (по относительной и абсолютной величинам) по сравнению со значениями, выявленными у детей, потребляющих качественную питьевую воду. Оценка показателей иммунного статуса по результатам наших исследований продемонстрировала статистически значимое (р <0,05) повышение (в 6,7 раза) концентрации IL-17 и в 2 раза содержание bax у детей группы наблюдения по отношению к результатам, зафиксированным у детей группы сравнения. Среднегрупповое содержание bcl-2, идентифицированное у детей группы наблюдения (0,59 (0,41;0,76), %), не имело достоверных различий (p >0,05) с результатами, зафиксированными у обследуемых группы сравнения (2,08 (0,56;3,50), %). Обнаружено, что у детей, потребляющих питьевую воду с избыточным содержанием нитратов, статистически значимо (р <0,001) в 4,3 раза повышено процентное содержание Annexin V-FITC⁺PI^–-лимфоцитов и в 2,9 Annexin V-FITC⁺PI⁺-лимфоцитов относительно аналогичных показателей у детей, потребляющих питьевую воду, соответствующую гигиеническим нормативам по содержанию нитратов. Таким образом, у детей группы наблюдения отмечается выраженная инициация FAS-зависимых и митохондриальных апоптотических событий, а также активация клеточной гибели по пути некроза.

 

Таблица 2. Сравнительный анализ изменений показателей иммунного статуса у детей нитратной геохимической провинции

Table 2. Comparative analysis of changes in the parameters of the immune status in children from the nitrate geochemical province

Показатели Indicators	Группа сравнения Comparison group		Группа наблюдения Observation group		t	р
	М±m	95% ДИ 95% CI	М±m	95% ДИ 95% CI
NKT, %	15,00±1,21	13,63–16,79	11,26±0,72	9,98–12,42	2,66	0,009
NKT, 109/дм3 | NKT, 109/dm3	0,45±0,04	0,39–0,51	0,34±0,03	0,29–0,39	2,20	0,030
Treg, %	2,04±0,66	1,50–2,28	1,43±0,02	1,12–1,73	0,88	0,379
CD3+CD25+, %	5,89±0,35	5,43–6,35	7,08±0,63	6,05–8,11	1,62	0,105
CD3+CD25+, 109/дм3 CD3+CD25+, 109/dm3	0,17±0,01	0,15–0,18	0,20±0,01	0,18–0,23	2,12	0,039
CD3+СD95+, %	9,58±0,84	8,49–10,67	12,2±0,78	11,94–12,46	2,29	0,025
CD3+СD95+, 109/дм3 CD3+CD95+, 109/dm3	0,25±0,01	0,23–0,27	0,36±0,02	0,32–0,40	4,92	<0,001
р53, %	0,38±0,09	0,30–0,46	0,49±0,08	0,46–0,52	0,78	0,437
bax, %	5,48±0,46	4,69–6,27	10,94±3,20	8,38–13,50	2,95	0,005
IL17, пг/см3 | IL17, pg/cm3	1,52±0,14	1,46–1,58	9,85±2,68	7,94–11,76	3,10	0,002
Annexin V-FITC+PI–, %	0,28±0,07	0,19–0,37	1,20±0,12	1,02–1,38	5,89	<0,001
Annexin V-FITC+PI+,%	3,48±0,60	2,79–4,17	9,97±0,63	9,03–10,91	7,22	<0,001

Примечание: М — среднее арифметическое значение; m — стандартная ошибка средней арифметической; ДИ — доверительный интервал; NKT — натуральные киллерные Т-клетки; Treg — регуляторные клетки.

Note: М — arithmetic mean; m — standard error of the arithmetic mean; CI — confidence interval; NKT — natural killer T cells; Treg — regulatory cells.

 

По результатам оценки вероятностной причинно-следственной связи установлена зависимость повышения абсолютного числа CD3⁺CD25⁺-лимфоцитов (b₀=–2,85; b₁=899,28; F=109,74; R²=0,46; р <0,001) от содержания в крови N-нитрозодиметиламина, выявлена статистически значимая вероятность снижения содержания регуляторных клеток (b₀=–2,32; b₁=1515,55; F=81,35; R²=0,38; р <0,001) и уровня bcl-2 (b₀=1,56; b₁=2410,7; F=172,98; R²=0,57; р <0,001) при контаминации биосред N-нитрозодиметиламинов. Установлена статистически значимая зависимость, указывающая на повышение концентрации IL-17 (b₀=–2,05; b₁=205,48; F=385,79; R²=0,74; р <0,001) в присутствии в крови N-нитрозодиэтиламина. Оценка вероятностных причинно-следственных связей подтверждает процессы избыточной ранней клеточной активации, дисрегуляцию митохондриальной функции, нарушение иммунорегуляторных процессов в условиях экспозиции нитратами.

Дети, проживающие на территории нитратной геохимической провинции и употребляющие воду с избыточным содержанием нитратов, характеризуются наличием достоверного риска развития генетически опосредованных метаболомных нарушений, ассоциированных с полиморфизмом генов (табл. 3–5).

 

Таблица 3. Результаты генетического обследования детей, проживающих на территории нитратной геохимической провинции

Table 3. Results of the genetic examination of children living in the territory of the nitrate geochemical province

Ген | Gene		BRCA1	CYP1A1	PPARD	MMP9
rs		3950989	1048943	2016520	17576
Гомозигота 1 | Homozygote 1		G/G	A/A	A/A	A/A
Гетерозигота | Heterozygote		G/A	A/G	A/G	A/G
Гомозигота 2 | Homozygote 2		A/A	G/G	G/G	G/G
Группа наблюдения Observation group	Гомозигота 1, % | Homozygote 1, %	27,9	90,9	81,8	33,8
	Гетерозигота, % | Heterozygote, %	58,1	9,1	15,6	57,1
	Гомозигота 2, % | Homozygote 2, %	14,0	0,0	2,6	9,1
	Аллель 1, % | Allele 1,%	57,0	95,5	89,6	62,3
	Аллель 2, % | Allele 2, %	43,0	4,6	10,4	37,7
Группа сравнения Comparison group	Гомозигота 1, % | Homozygote 1, %	45,4	75,6	58,1	50,0
	Гетерозигота, % | Heterozygote, %	40,7	23,3	36,1	38,4
	Гомозигота 2, % | Homozygote 2, %	14,0	1,2	5,8	11,6
	Аллель 1, % | Allele 1, %	65,7	87,2	76,2	69,2
	Аллель 2, % | Allele 2, %	34,3	12,8	23,8	30,8

 

Таблица 4. Мультипликативная модель наследования генов кандидатов

Table 4. Multiplicative model of inheritance of candidate genes

Показатели Indicators	Ген | Gene
	BRCA1	CYP1A1	PPARD	MMP9
rs	3950989	1048943	2016520	17576
χ²	1,87	6,81	10,18	1,70
p	0,1719	0,0090	0,0014	0,1927
OR Аллель 1 | OR Allele 1	0,69	3,08	2,70	0,74
CI 95-	0,41	1,28	1,44	0,47
CI 95+	1,18	7,43	5,04	1,17
OR Аллель 2 | OR Allele 2	1,45	0,32	0,37	1,36
CI 95–	0,85	0,13	0,20	0,86
CI 95+	2,46	0,78	0,69	2,15

Примечание: χ² — критерий хи-квадрат; OR — отношение шансов; CI — доверительный интервал.

Note: χ² — chi-squared test value; OR — odds ratio; CI — confidence interval.

 

Таблица 5. Общая модель наследования генов кандидатов

Table 5. General model of inheritance of candidate genes

Показатели Indicators	Ген | Gene
	BRCA1	CYP1A1	PPARD	MMP9
rs	3950989	1048943	2016520	17576
χ²	4,08	6,97	10,71	5,81
p	0,0434	0,0083	0,0011	0,0159
OR Гомозигота 1 | OR Homozygote 1	0,47	3,23	3,24	0,51
CI 95–	0,21	1,29	1,58	0,27
CI 95+	1,03	8,10	6,66	0,96
OR Гетерозигота | OR Heterozygote	2,02	0,33	0,33	2,14
CI 95–	0,96	0,13	0,15	1,14
CI 95+	4,25	0,83	0,70	4,01
OR Гомозигота 2 | OR Homozygote 2	1,00	–	0,43	0,76
CI 95–	0,35	–	0,08	0,27
CI 95+	2,88	–	2,29	2,11

Примечание: χ² — критерий хи-квадрат; OR — отношение шансов; CI — доверительный интервал.

Note: χ² — chi-squared test value; OR — odds ratio; CI — confidence interval.

 

Полученные результаты и их статистическая обработка позволила выделить ключевые полиморфизмы кандидатных генов: дельта рецептора PPARD (rs2016520) A/G, активируемого пролифераторами пероксисом, синтезируемого в печени, способствующего ангиогенезу опухоли (типичная гомозигота, мультипликативная модель: OR=2,70; 95% ДИ=1,44–5,04, p=0,001); гена детоксикации первой фазы цитохрома р450 CYP1A1 (rs1048943) (типичная гомозигота, мультипликативная модель: OR=3,08; 95% ДИ=1,28–7,43, p=0,009), гена матриксной металлопротеиназы MMP9 (rs17576), генетические варианты которого связаны с коллагенопатиями, пролиферативными процессами в печени и поджелудочной железе (гетерозигота АG, общая модель: OR=2,14; 95% ДИ=1,14–4,01, p=0,015); транскрипционного фактора BRCA1 G/A (rs3950989) (гетерозигота, OR=2,02; 95% ДИ=0,96–4,25, p=0,043).

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящее время имеются убедительные доказательства того, что в условиях избыточного поступления нитратов с питьевой водой формируются предпосылки иммунной дисфункции, одним из проявлений которой может быть нарушение апоптоза [12, 13]. Апоптоз — это физиологический процесс, необходимый для поддержания гомеостатического баланса между пролиферацией клеток и их гибелью. Дерегуляция иммунного ответа, характеризующаяся либо ингибированием, либо активацией клеточной гибели, часто является причиной развития иммунопролиферативных заболеваний или иммунодефицитных состояний. Летальная программа клетки строго регулируется взаимозависимыми внутриклеточными сигнальными каскадами, энергетическим потенциалом митохондрии, балансом апоптотических и антиапоптотических стимулов, особенностями микроокружения клетки и её генома.

Субпопуляции NKT-лимфоцитов и Treg-лимфоцитов в значительной мере определяют вариабельность противоопухолевого иммунитета, а их иммунорегуляторные функции модулируются их микроокружением. NKT-клетки способны изменять направленность иммунного ответа за счёт возможности секретировать Th1 (Т-хелпер 1 типа), Th2, Th17 или Treg ассоциированные цитокины. Однако механизмы такого переключения, в том числе под действием химических факторов, не установлены и продолжают активно изучаться. Антигенспецифическая цитотоксичность NKT-клеток осуществляется с помощью сигналов, полученных при взаимодействии с системой FAS/FASL [14]. CD95-опосредованные сигналы приводят к активации инициаторной каспазы-8, которая участвует в запуске рецепторопосредованного (внешнего) и митохондриального (внутреннего) пути апоптоза. FAS-рецептор и каспаза-8 отвечают за формирование сигнального комплекса DISC (death inducing signalling complex, сигнальный комплекс, индуцирующий гибель), опосредующего экстернализацию фосфатидилсерина. Полученные нами результаты демонстрируют, что в ответ на апоптотические стимулы происходит повышение количества Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD95. В дальнейшем FAS-индуцированная активация каспазы-8 значительно усиливает апоптоз, что позволяет предположить, что избыток нитратов в организме повышает чувствительность клетки к рецепторопрсредованному апоптозу. Гибель клеток, опосредованная рецептором смерти, является формой апоптоза, при которой активация каспазного каскада возможна без участия митохондрии. Между тем существуют доказательства взаимодействия и перекрёстного регулирования различных механизмов клеточной гибели. Так, на уровне каспазы-8 внешний и внутренний пути апоптоза могут пересекаться [15]. Не имея ферментативной активности FAS между тем способен запускать разные внутриклеточные каскады, в том числе NF-κB-путь (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, ядерный фактор κB) или МАРК-киназные механизмы регуляции клеточной гибели, вызывая некроз или апоптоз. Показана роль арилуглеводородного рецептора (AhR) в активации ферментов цитохрома Р450 (изоформа CYP1A1, CYP1A2, CYP1В1), регуляции FAS-зависимого и р53-контролируемого апоптоза [1]. В зависимости от химической природы лиганда AhR принимает участие в активации либо Treg, либо Th17, что в ряде случаев обусловливает нарушение соотношения Treg/Th17 [16]. Т-хелперы 17-го типа являются основными продуцентами IL-17, именно через данный цитокин лимфоциты проявляют свои эффекторные функции [17, 18]. Полагают, что концентрация интерлейкина-17 в значительной мере отражает количественное содержание Th17, характеризуя дисбаланс в системе Treg/Th17 [19]. Результаты математического моделирования, представленные в данной работе, подтверждают нарушения взаимоотношения реципрокного характера регуляторных клеток и Т-хелперов 17, проявляющиеся формирующейся тенденцией снижения процентного содержания Treg и дальнейшим увеличением секреции IL-17 в условиях экспозиции нитрозаминами. Согласно литературным данным, производные нитратов (N-нитрозодиметиламина и N-нитрозодиэтиламина) способны вызывать гиперпродукцию IL-17 и повышать экспрессию bax, тем самым индуцируя каскад апоптотических и некротических событий [20]. Оценка данных, полученных в настоящем исследовании, указывающих на модифицирующее воздействие нитратов на цитокиновый профиль и митохондриальную активность, в значительной степени согласуется с результатами других исследователей. Члены семейства белков bcl-2 обладают как про-, так и антиапоптотической активностью, доказана их роль в контроле клеточной гибели. Прямое связывание bcl-2 с белком bах ингибирует проапоптотический эффект последнего. Однако дисбаланс в семействе bcl-2 повышает вероятность активации митохондриальных апоптотических событий и/или падение митохондриального потенциала, опосредуя гибель клетки по пути некроза. Согласно данным последнего десятилетия, митохондрии — это не только источник энергообеспечения клетки, но триггерный, сигнальный и регуляторный центр. Установлено, что транскрипционный фактор р53 вызывает гиперэкспрессию bах и угнетение активности bcl-2, а также повышает экспонирование рецептора FAS на клеточной мембране, таким образом, создавая условия для развития р53-независимого апоптоза [21, 22]. В настоящем исследовании не обнаружены достоверные межгрупповые различия по уровню р53 и bcl-2, что объясняется взаиморегулирующими связями между данными белками [23]. Однако установленная зависимость снижения уровня антиапоптотического белка от концентрации N-нитрозодиметиламина в крови свидетельствует о нарушении программированной процедуры клеточной гибели в присутствии токсиканта в организме. Идентифицированное в данном исследовании у детей группы наблюдения повышение уровня маркера апоптоза bax на 53% относительно значений, идентифицированных у детей группы сравнения, свидетельствует об интенсификации клеточной гибели в условиях избыточного содержания нитратов в биосредах. Установлено, что в условиях экспозиции нитрозосоединениями наблюдаются нарушения энергетического обеспечения клетки, запуск апоптоза и включение альтернативного пути гибели клетки — некроза. Решающее значение для запуска и реализации каскадных нарушений апоптоза в условиях экспозиции нитратами играют индивидуальные особенности нуклеотидных замен в кандидатных генах. Наблюдаемая комбинация полиморфизмов ключевых генов формирует патологический сценарий замедления клеточной гибели: так гетерозигота AG гена матриксной металлопротеиназы MMP9 (rs17576) частично отменяет ремоделинг структур внеклеточного матрикса фермента желатиназы В, участвующей в тканевом обновлении; гетерозигота GA транскрипционного фактора BRCA1 G/A (rs3950989), ассоциированная с опухолеобразованием; типичная гомозигота АА D-рецептора PPARD A/G, активируемого пролифераторами пероксисом, ассоциирована с повышенной интенсивностью обменных процессов, истощением, опухолевым ангиогенезом; типичная гомозигота АА гена детоксикации первой фазы цитохрома р450 CYP1A1 (rs1048943) сопряжена со слабой экспрессией фермента и неэффективностью метаболизма стабильных органических ядов, в том числе нитрозаминов. Нарушения клеточной гибели, ассоциированные с нитратным загрязнением питьевой воды и полиморфизмом кандидатных генов, могут служить причиной развития иммуноопосредованных состояний, в том числе онкопролиферативных, среди детского населения, длительно потребляющего такую воду.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Установлено, что хроническая низкоуровневая экспозиция нитратами с питьевой водой формирует избыточное содержание в крови N-нитрозодиэтиламина, нитрат-иона и N-нитрозоаминов в моче, что обусловливает особенности иммунного ответа: угнетение процессов иммунорегуляции (дефицит NKT-лимфоцитов, нарушение соотношения Treg/Th17), дисбаланс в системе белков bcl-2, контролирующих митохондриальный апоптоз (гиперпродукция bax), повышение пролиферативного потенциала и высокая готовность лимфоцитов к вступлению в апоптоз, усиление передачи апоптогенного сигнала с участием мембранных рецепторов (гиперэкспрессия CD25⁺ и FAS), интенсификация клеточной гибели (увеличение содержания Annexin V-FITC⁺PI^–-лимфоцитов и Annexin V-FITC⁺PI⁺-лимфоцитов), что на фоне полиморфизма кандидатных генов, отвечающих за детоксикацию первой фазы (метаболизм) CYP1A1 (rs1048943), пролиферацию и апоптоз (MMP9 (rs17576); BRCA1 (rs3950989)), дифференцировку клеток (PPARD (rs2016520)), повышает в 2,02–3,08 (OR) раза риск возникновения нарушений здоровья детского населения.

Таким образом, у детей, потребляющих питьевую воду из подземных источников питьевого водоснабжения с повышенным содержанием нитратов (1,2 ПДК), выявлены ранние признаки дисбаланса показателей иммунорегуляции, ассоциированные с контаминацией биосред нитратами и полиморфизмом кандидатных генов, что обусловливает риск формирования пролиферативных процессов на фоне дисбаланса программированной клеточной гибели и нарушенного контроллинга генов за опухолеобразованием.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. О.В. Долгих внёс существенный вклад в концепцию исследования и интерпретацию данных, окончательно утвердил присланную в редакцию рукопись; Д.Г. Дианова внесла существенный вклад в концепцию и дизайн исследования, анализ и интерпретацию данных, подготовила первый вариант статьи; О.А. Казакова выполнила статистический анализ полученных результатов, внесла существенный вклад в анализ данных.

Финансирование. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Конфликт интересов отсутствует.

ADDITIONAL INFORMATION

Authors’ contribution. O.V. Dolgikh made a significant contribution to the concept of research and interpretation of data, approved the final version of the manuscript submitted to the editorial office; D.G. Dianova made a significant contribution to the concept and design of the study, analysis and interpretation of data, prepared the first draft of the article; O.A. Kazakova performed a statistical analysis of the results, made a significant contribution to data analysis.

Funding sources. The authors declare no external funding.

Competing interests. No conflict of interest.

About the authors

Oleg V. Dolgikh

Federal Scientific Center for Medical and Preventive Health Risk Management Technologies

Author for correspondence.
Email: oleg@fcrisk.ru
ORCID iD: 0000-0003-4860-3145
SPIN-code: 8288-7995

MD, Dr. Sci (Med.)

Russian Federation, Perm

Dina G. Dianova

Federal Scientific Center for Medical and Preventive Health Risk Management Technologies

Email: dianovadina@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0002-0170-1824
SPIN-code: 6494-1717

MD, Dr. Sci (Med.)

Russian Federation, Perm

Olga A. Kazakova

Federal Scientific Center for Medical and Preventive Health Risk Management Technologies

Email: chakina2011@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-0114-3930
SPIN-code: 5949-9235
Russian Federation, Perm

References

Supplementary files