FUNCTIONAL ACTIVITY OF THE ANTIOXIDANT SYSTEM OF A PERSON LIVING IN THE NORTH DURING THE YEAR

Full Text

Изучение ферментов системы антиоксидантной молекулярной биологии и медицины. Значение защиты в условиях метаболической адаптации ор- антиоксидантной системы (АОС) заключается в ганизма к изменяющимся условиям внешней среды регуляции необходимых для организма процессов составляет важнейшую проблему современной свободнорадикального окисления (СРО), которые при 33 Экологическая физиология Экология человека 2018.03 нарушении сбалансированного соотношения между прооксидантами и антиоксидантами могут привести к развитию патологии [14]. Баланс антиоксидантов и прооксидантов в тканях зависит от функционального состояния организма и от различных факторов среды обитания. Устойчивость организма к внешним воздействиям, а также способность адаптироваться к ним в значительной мере определяется функциональной активностью АОС [5]. Основными компонентами ферментативного звена АОС организма являются ферменты супероксиддис-мутаза (СОД), глутатионпероксидаза (ГП), характеризующиеся высокой специфичностью действия, направленного к определенным активным формам кислорода (АФК), специфичностью клеточной и органной локализации, кооперативным и сбалансированным действием. Антиоксидантную активность проявляют такие низкомолекулярные соединения, как водо- и жирорастворимые витамины, составляющие неферментативное звено АОС [14]. Определенное количество функциональных белков и структурных компонентов, низкий уровень окислительных процессов в эритроцитах (отсутствие митохондриальной цепи транспорта электронов, поддержание геминового железа в восстановленном состоянии), мощная антиоксидантная система [14] позволяют утверждать, что изменения активности ферментов антиоксидантов эритроцитов не являются случайными флуктуациями окислительных реакций, а свидетельствуют о существенном влиянии факторов среды на организм. Целью данного исследования являлось изучение сезонных изменений функционирования ферментативного и неферментативного звеньев АОС в крови молодых мужчин, проживающих на Европейском Севере России. Методы В течение года ежемесячно с октября по октябрь обследовалась группа (n = 20) практически здоровых мужчин 18-22 лет, по роду деятельности находящихся через день по 12 часов на открытом воздухе. Обследуемым были объяснены задачи исследования и получено их письменное согласие. Условия проживания и питания для всех однотипны. Забор крови в группе наблюдения осуществляли с 6.00 до 7.00 ч натощак из локтевой вены в вакутайнеры Bekton Dickinson BP (США). Собранную кровь центрифугировали при 3 000 об./мин в течение 15 мин, затем плазму отделяли от эритроцитов. Эритроциты трижды отмывали охлажденным 0,9 % раствором хлорида натрия, центрифугировали 15 мин при 3 000 об./мин. Из отмытых эритроцитов готовили водные гемолизаты, которые до анализа хранили при -40 °С. Активность СОД определяли по методу [2], основанному на ингибировании реакции восстановления нитротетразолия синего в формазан (гидразинтетра-золий) супероксидными анион-радикалами кислорода, генерируемыми системой «NADH-феназинметасульфат», активность ГП - по убыли восстановленного глутатиона при его окислении гидроперекисью трет-бутила [6]. Метод определения активности глутати-онредуктазы (ГР) основан на скорости окисления NADPH при 340 нм [12]. Концентрацию ретинола и токоферола устанавливали по интенсивности флуоресценции липидного экстракта сыворотки крови [13], концентрацию селена в плазме определяли флуориметрическим методом с 2,3-диаминонафтали-ном [3]. В качестве стандарта органической формы селена использовали сыворотку крови с известным содержанием селена Seronorm Trace Elements Serum, Lot MI0181 (Норвегия). Коэффициент жесткости погоды по Сайплу [11] рассчитывали, используя данные о температуре воздуха из метеосводки Центра по гидрометеорологии и мониторингу окружающей среды Республики Коми, г. Сыктывкар. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью прикладного пакета программ Microsoft Excel и «Биостат» (версия 4.03). Различия считали значимыми при уровне p < 0,05, оцененному по критерию Крускала - Уоллеса и критерию Данна для непараметрических выборок. Для выявления взаимосвязей между изучаемыми показателями вычисляли коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Результаты Ферменты АОС. Мониторинг изучения активности СОД, ГП, ГР в эритроцитах обследованных мужчин показал существенное влияние факторов внешней среды на функционирование ферментативного звена АОС. Показана значительная флуктуация активности СОД за все время наблюдения: разница между наибольшей и наименьшей активностью СОД составила 6,3 раза. Выявлены периоды максимальной и минимальной активности СОД в эритроцитах молодых мужчин - жителей Европейского Севера России (рис. 1). Минимальная активность СОД наблюдалась в холодный период года на фоне повышения коэффициента жесткости погоды, а максимальная - при наиболее благоприятных погодных условиях. 120 --*--СОД « Жесткость погоды 12ю О -I-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1- о Х-1 XI XII I II III IV V VI VII VIII IX Х-2 Месяц обследования Рис. 1. Активность супероксиддисмутазы эритроцитов у молодых мужчин-северян и жесткость погоды Примечание. Значимость различий по сравнению с показателем предыдущего месяца: * - p < 0,05; ** - p < 0,01; *** - p < 0,001. 34 Экология человека 2018.03 Экологическая физиология Антиоксидантная молекулярная система «ГП - глутатион - ГР» является ключевой в защите функциональной активности эритроцитов [12]. Анализ годовой динамики активности ГП (рис. 2) выявил повышенную активность этого фермента с увеличением коэффициента жесткости погоды, то есть с октября по март. Коэффициент жесткости погоды (ветро-холодо-вой индекс Сайпла) - это шкала величин теплопотерь в кДж (ккал/м2) в час, которая колеблется от 600 (прохладно) до 1 000 (очень холодно) и 2 500 (невыносимый холод) [9]. В апреле показано резкое (в 2,6 раза, p < 0,001) снижение активности фермента, практически не изменяющееся летом, и небольшое повышение в сентябре - октябре. Рис. 2. Активность глутатионпероксидазы эритроцитов у молодых мужчин-северян и жесткость погоды Примечание. Значимость различий по сравнению с показателем предыдущего месяца: *** - p < 0,001. Годовая динамика активности ГР имеет несколько отличий от таковой для ГП. Во-первых, активность ГР с октября по декабрь снизилась, а активность ГП в это время возросла. В обоих случаях активность ферментов изменилась в 1,5 раза. Во-вторых, в марте активность ГР достигла своего максимального значения, а активность ГП в это время начала снижаться. В период март -апрель в обоих случаях наблюдалось значимое снижение активности этих ферментов. Так, активность ГП с марта по апрель снизилась в 2,6 раза (p < 0,001) и достигла минимального значения за весь период обследования, в то же время активность ГР снизилась в 1,3 раза (p < 0,01). В период с апреля по август активность ГР и ГП изменялась незначительно (рис. 3). Рис. 3. Активность глутатионпероксидазы (ГП) и глутатионредук-тазы (ГР) эритроцитов у молодых мужчин-северян Примечание. Значимость различий по сравнению с показателем предыдущего месяца: * - p < 0,05; ** - p < 0,01; *** - p < 0,001. Неферментативное звено АОС. Уровень токоферола в сыворотке крови мужчин в течение года варьировал в пределах от 2,39 до 6,53 мкг/мл, что значительно ниже среднеширотной нормы изучаемого показателя. Наименьший уровень его выявлен в августе, сентябре, октябре и январе, а наибольший - в ноябре и марте. Уровень ретинола имел схожую с описанной для токоферола годовую динамику. Среднегрупповые показатели концентрации ретинола в течение года находились на нижней границе или ниже нормы (30-80 мкг/мл) (рис. 4). Рис. 4. Содержание витаминов А и Е в плазме молодых мужчин-северян Среднегодовое значение уровня селена в плазме крови обследованных мужчин составило (82,32 ± 11,23) мкг/л. Выявлена значительная флуктуация его содержания в течение года (рис. 5). Так, с октября по март наблюдалось постепенное увеличение его уровня в крови. В феврале и марте у испытуемых обнаружены наиболее высокие значения сывороточного селена -(88,75 ± 9,31) и (91,28 ± 14,49) мкг/л соответственно. С марта по июль прослеживалось выраженное снижение уровня селена, причем минимальные значения отмечены в июле (54,1 ± 6,9) мкг/л. Годовая динамика содержания селена в плазме соответствует годовой динамике активности ГП (см. рис. 3). Рис. 5. Активность глутатионпероксидазы (ГП) эритроцитов и содержание селена (Se) в плазме у молодых мужчин-северян Примечание. Значимость различий по сравнению с показателем предыдущего месяца: *** - p < 0,001. Корреляционные отношения. О сложности внутрисистемных взаимоотношений между антиоксидантными 35 Экологическая физиология Экология человека 2018.03 ферментами и неферментативными антиоксидантами свидетельствуют данные корреляционного анализа, который показал значимую взаимосвязь показателей активности СОД, ГП и ГП с содержанием селена и витаминов в годовом цикле наблюдения (таблица), а именно: значимую отрицательную корреляцию активности СОД с содержанием витаминов А и Е (p < 0,001), положительную корреляцию активности ГП с содержанием селена (p < 0,001) и отрицательную корреляцию активности ГП (p < 0,05) и СОД эритроцитов. Корреляция показателей активности глутатионпероксидазы и супероксиддисмутазы эритроцитов с содержанием селена и витаминов в плазме у мужчин Метаболиты Супероксиддисмутаза Глутатионпероксидаза Глутатионпероксидаза -0,15* - Селен - + 0 4*** Витамин А (ретинол) -0,35*** +0,19** Витамин Е (а-токоферол) -0,28*** - Примечание. Значимость различий: * - p < 0,05; ** - p < 0,01; *** - p < 0,001. Обсуждение результатов Процессы адаптации организма человека зависят от функционального состояния основных адаптивных систем, к которым, в частности, относится АОС, названная Ф. З. Меерсоном [5] периферической регуляторной стресс-лимитирующей системой. Активация ферментативного звена АОС наблюдается под влиянием факторов, вызывающих состояние стресса, например холода, напряженных физических нагрузок [20]. В период обследования дискомфорт погоды наблюдался c октября по апрель с максимумом в феврале - марте, а наиболее благоприятные условия отмечались с мая по сентябрь. Предположительно значимое снижение активности СОД в начале обследования (октябрь) обусловлено повышенным содержанием молекулярных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Известно, что процессы СРО и ПОЛ имеют сезонные различия - количество продуктов СРО и ПОЛ увеличивается осенью и весной [1]. Одним из механизмов действия продуктов ПОЛ является окисление сульфгидрильных белковых групп до дисульфидных. Серосодержащие аминокислоты являются основными целями АФК, а во вторичной структуре молекулы СОД присутствует дисульфидная связь между Cys 57 и Cys 147, потеря которой может привести к инактивации фермента [16]. Минимальная активность СОД наблюдалась в мае. Вероятно, это связано с весенним повышением содержания как первичных, так и конечных продуктов ПОЛ. Известно, что альдегиды обладают высокой реакционной способностью по отношению к белкам, модифицируя лизиновые и другие аминокислотные остатки, а также тиоловые группы белков [4]. Антиоксидантная молекулярная система «ГП -глутатион - ГР» является ключевой в защите функ циональной активности эритроцитов, так как перекись водорода способствует окислению входящего в состав гемоглобина Fe2+ до Fe3+ с образованием метгемо-глобина, не способного переносить кислород. Глута-тионпероксидаза играет важную роль в элиминации перекиси водорода эндогенного происхождения, то есть при автоокислении гемоглобина [14]. Антиоксидантное действие ГП заключается в том, что фермент, кроме инактивации перекиси водорода, катализирует реакцию восстановления глутатионом нестойких органических гидропероксидов, включая гидроперекиси полинена-сыщенных жирных кислот [18]. Одним из факторов, лимитирующих активность ГП, является содержание восстановленного глутатиона в клетке, уровень которого в значительной степени зависит от активности ГР. Сравнивая активность ГП и ГР (см. рис. 3) в годовой динамике, можно сказать, что снижение активности ГР в декабре до минимума за весь период наблюдения, возможно, обусловлено субстратным ингибированием, так как концентрация кофермента ГР рибофлавина у молодых мужчин была в норме. Эндогенная АОС поддерживается экзогенными факторами, например витаминами и микроэлементами, такими как селен, с уровнем которого связана активность ГП в сыворотке крови [18]. Известно, что недостаточное питание может привести к микродефициту питательных веществ, включая дефицит селена [7, 8]. Биологическая активность селена связана с селенопротеинами, содержащими селеноцистеин; у млекопитающих это в основном ГП [18]. По данным литературы, для оптимизации активности ГП необходимо содержание селена в плазме/сыворотке от 63 до 98 мкг/л [21]. Диета, бедная селеном и витамином Е, снижает активность ГП. В литературе [17] имеются данные, показывающие, что в тромбоцитах и эритроцитах активность ГП не изменяется при добавлении в рацион селенобогащенных добавок, в отличии от ГП плазмы. В нашем исследовании диета участников была стандатизирована, причем суточный рацион питания включал белка и углеводов на 20-30 % больше установленных требований в подобных группах. В группе обследуемых рацион не менялся в течение года. Оптимальное потребление селена для поддержания здоровья и лучшие биологические маркеры для оценки достаточности селена окончательно не установлены. Исходя из данных литературы [21], можно заключить, что содержание селена в плазме крови обследуемых было субоптимальным. Глутатионпероксидаза является адаптивным ферментом, активность которого регулируется продуктами липопероксидации и АФК [18], следовательно, наблюдаемая активация ферментативного звена АОС в холодный период года свидетельствует об усилении процессов СРО. Основными источниками АФК в эритроцитах являются гемоглобин [14], содержащий ионы Fe (II), и мембраны с высоким уровнем полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК). Мембраны эритроцитов 36 Экология человека 2018.03 Экологическая физиология особенно чувствительны к окислительному повреждению из-за высокого содержания ПНЖК [19], которые являются основными целями АФК. Основной функцией токоферола в естественных условиях является непосредственная нейтрализация АФК для поддержания целостности длинноцепочечных ПНЖК в мембранах клеток и их биологической активности [22]. По нашим данным, показатели концентрации токоферола и ретинола в течение года находятся на нижней границе или ниже нормы. Причиной низкого содержания витамина Е в сыворотке могут быть проживание на загрязненных территориях [10], нарушение процесса всасывания, связанное с хроническим заболеванием тонкого кишечника [23], сезон, курение, диета, возраст [15]. В нашем исследовании участвовали здоровые мужчины, проживающие в экологически чистом районе. Жирорастворимые витамины - пищевые антиоксиданты. Известно, что основными источниками токоферола в организме являются растительные масла и орехи, а ретинола - сливочное масло и яйца [12]. Из проведенного опроса следует, что обследованные мужчины потребляли данные продукты питания в течение всего года в недостаточном количестве, что, возможно, отразилось в целом на уровне жирорастворимых витаминов в организме. В литературе имеются данные, что при Е-витаминной недостаточности наблюдается частичный гемолиз эритроцитов, в них снижается активность ферментов АОС [22]. Анализ данных осмотической резистентности эритроцитов молодых мужчин в холодное время года служит подтверждением нашего предположения о частичном повреждении СОД избытком АФК и продуктов ПОЛ в зимние месяцы. Снижение резистентности с начальным гемолизом начинается при концентрации хлорида натрия от 0,5 до 0,7 %. В эритроцитах мужчин снижение резистентности в неинкубированной крови зафиксировано в ноябре при концентрации хлорида натрия 0,6 %. При концентрации хлорида натрия 0,5 % гемолиз эритроцитов в ноябре составил 23,78 %, в декабре - 19,38 %, январе - 10,21 %, феврале - 4,2 %, в марте - 8,26 %. Представленные данные отражают интенсивность процессов СРО в эритроцитах в зависимости от дискомфорта погоды. Таким образом, выявленные нами сезонные различия в активности АОС показали развитие окислительного стресса в ноябре - первом месяце с устойчивыми отрицательными температурами, что выражается в повышении активности ГП и ГР, снижении активности СОД. Выявленные сезонные колебания содержания витаминов, селена, активности СОД и ГП эритроцитов можно рассматривать как адаптационные процессы, связанные с воздействием природно-климатических факторов. Мы благодарим добровольцев, принимавших участие в исследовании.

About the authors

V D Shadrina

Komi Science Centre, the Urals Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: Vera.shadrina56@mail.ru
Institute of Physiology Syktyvkar, Russia

N N Potolitsyna

Komi Science Centre, the Urals Branch of the Russian Academy of Sciences

Syktyvkar, Russia

O I Parshukova

Komi Science Centre, the Urals Branch of the Russian Academy of Sciences

Syktyvkar, Russia

T V Eseva

Komi Science Centre, the Urals Branch of the Russian Academy of Sciences

Syktyvkar, Russia

E R Boyko

Komi Science Centre, the Urals Branch of the Russian Academy of Sciences

Syktyvkar, Russia

References

Supplementary files