PRODUCTION AND IN VIVO TOXICITY TESTING OF MICROCRYSTALLINE CELLULOSE DERIVED FROM BACTERIAL CELLULOSE

Full Text

Актуальным направлением в современной медицине и фармации является разработка и исследование инертных носителей для приготовления дозированных лекарственных форм, косметических средств, биологически активных добавок к пище, продуктов функционального питания [5, 8]. К таким носителям-наполнителям относится микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ). Традиционно для получения МКЦ применяют растительную целлюлозу и технические древесные целлюлозы. Перспективным является биотехнологический подход к получению целлюлозы с использованием симбиотической непатогенной популяции живых микроорганизмов. Получение МКЦ на основе целлюлозы бактериального происхождения 21 Окружающая среда Экология человека 2018.02 имеет ряд технологических особенностей. Результаты кислотной депротеинизации целлюлозного материала, обусловленной функционированием клеточной массы бактерий, изучение микроморфологической структуры препаратов МКЦ и их токсикологическое исследование имеют первостепенное значение при анализе бактериальной целлюлозы как нового сырьевого источника. Целью настоящего исследования является получение микрокристаллической целлюлозы бактериального происхождения, определение ее микромор-фологических и токсикологических характеристик. Методы В качестве продуцента целлюлозы использовали симбиотическую непатогенную популяцию живых микроорганизмов - культуру уксуснокислых бактерий р. Acetobacter с дрожжами. Культивировали клетки на синтетических глюкозных субстратах. Наращивание симбиотической биомассы и культивирование продуцентов целлюлозы проводили с использованием термостата с функцией шейкера Environmental Shaker-Incubator ES-20 BioSan; хладотермостата ХТ-3/40-1 для культивирования симбиоза микроорганизмов; стерильность микробиологических анализов и пересевы культуры обеспечивали за счет ламинарного шкафа с УФ-системой Lamsystems. МКЦ получали из целлюлозы бактериального происхождения при ее кипячении в 2,5 н HCl в течение 1,5-4 ч. Образцы отмывали от кислоты до нейтральной реакции и высушивали с помощью системы лиофиль-ной сушки FreeZone 2,5 L (Labconco, США). Оценка размера и формы микрокристаллитов МКЦ и исследование микроморфологической структуры целлюлозы бактериального происхождения выполнена методом электронной микроскопии на сканирующем микроскопе высокого разрешения SEM Sigma VP ZEISS (ускоряющее напряжение 20 кВ, детектор InLens) и атомно-силовом микроскопе ACM Multimod 8 Bruker. Производили МКЦ на кафедре биологии, экологии и биотехнологии Северного (Арктического) федерального университета имени М. В. Ломоносова. Доклиническое токсикологическое исследование препаратов МКЦ включало изучение острой и под-острой токсичности. Эксперименты выполняли на кафедре фармации и фармакологии Северного государственного медицинского университета (СГМУ) после рассмотрения пакета документов на заседании этического комитета СГМУ и получения согласия на исследования (протокол № 1, от 01.02.2017). Экспериментальные исследования проводились в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» и Методическими рекомендациями «Деонтология медико-биологического эксперимента» (1987), а также с соблюдением правил гуманного обращения с животными (Reportofthe AVMA PanelonEuthanasia JAVMA, 2001) и этических норм, изложенных в Хельсинкской декларации и Директивах Европейского сообщества (8/609ЕС). В экспериментальных целях использовали 26 половозрелых белых нелинейных крыс обоих полов с начальным весом 125 - 240 г. Животные были получены из вивария СГМУ, где содержались в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986). Животные были разделены на четыре группы по шесть особей в каждой. Животным первой (контрольной) группы вводили 1 мл дистиллированной воды. Животные второй, третьей и четвертой опытных групп получали препараты МКЦ при внутрижелу-дочном введении через полиуретановый зонд методом фиксированной дозы из расчета 4,9-43,4-434,8 мг/ кг массы тела в соответствии с рекомендациями по доклиническому исследованию новых фармакологических веществ [7]. Препарат МКЦ готовили перед употреблением, суспендируя в 1 мл дистиллированной воды, и вводили животным однократно. Содержали и кормили животных 1-4 групп одинаково. В день эксперимента их не кормили, содержали с беспрепятственным доступом к воде. Острую токсичность МКЦ оценивали после однократного или многократного введения с интервалом в 6 ч в течение суток. Общая продолжительность наблюдения за животными составляла не менее двух недель, при этом в первый день животные находились под непрерывным наблюдением. Подострую токсичность определяли по совокупности функциональных нарушений органов и систем животного после повторного введения определенных доз МКЦ. Продолжительность введения составляла две недели с интервалом введения не менее 24 ч, 3, 5, 8, 12 и 14 сут. На протяжении исследования в течение семи суток животные находились под ежедневным наблюдением. Перед постановкой эксперимента и по его завершении животных взвешивали, наблюдали за степенью их активности, состоянием волосяного и кожного покрова, окраской слизистых оболочек. Эвтаназию проводили с помощью ингаляционного наркоза эфиром для наркоза без предварительного введения других анестетиков. По результатам эксперимента определяли класс опасности исследуемых препаратов. Обрабатывали полученные результаты c помощью программ SPSS Statistic 24. Для выявления статистической значимости различий использовали критерии Уилкоксона, Шапиро - Уилка. Различия сравниваемых величин считали значимыми при р < 0,05. Результаты Микроскопирование биопленки, образованной уксуснокислыми бактериями в симбиотическом комплексе с дрожжами, показало наличие однородных микрофибрилл целлюлозы с содержанием в объеме биопленки клеток микроорганизмов. Бактерии р. Acetobacter являются главными продуцентами целлюлозы. На микрофотографии (рис. 1А) пока 22 Экология человека 2018.02 Окружающая среда заны вытянутые палочки, в ряде случаев связанные в цепочки. Размеры клеток составляют 2-3 мкм х 0,5 мкм. Биосинтез целлюлозных микрофибрилл обеспечивается терминальными ферментными комплексами, расположенными в цитоплазматической мембране по всей поверхности бактериальной клетки. Целлюлоза бактериального происхождения имеет уникальный механизм синтеза и сборки целлюлозных цепей: терминальные комплексы целлюлозосинтазы в липопротеиновом слое мембраны бактерий предположительно являются сайтами выделения целлюлозных полимеров примерно по 10-15 цепей, которые при ассоциации друг с другом формируют фибриллы толщиной 1,5 нм [10]. Четко визуализирована сетчатая структура целлюлозной матрицы и крупные фибриллы бактериальной целлюлозы, формируемые в результате самосборки отдельных микрофибрилл и имеющие точку инициации на поверхности клетки (см. рис. 1А). Проведенное нами ранее исследование частоты встречаемости микрофибрилл бактериальной целлюлозы показало, что среднее значение их размера составляет 34 нм [2]. На микрофотографии (рис. 1Б) показана поверхность слоя целлюлозы бактериального происхождения, полученная высушиванием на воздухе. Силы поверхностного натяжения, создаваемые водой при высыхании, стягивают микрофибриллы и бактерии в Рис. 1. Структура микрофибрилл бактериальной скопе SEM SigmaVP ZEISS (A) и атомно-сило линейка 1 мкм плотную массу, чего не происходит при лиофильном высушивании (см. рис. 1А). Полученную целлюлозу использовали для производства препаратов МКЦ. Кислотный гидролиз образцов бактериальной и растительной целлюлозы, проводимый в жестких условиях, позволил деструктировать микрофибриллы с получением микрокристаллитов. Обнаружены топохимические отличия микрокристаллитов бактериальной и хлопковой целлюлозы после их гидролиза (рис. 2). МКЦ, полученная гидролизом целлюлозы бактериального происхождения, имеет более вытянутую форму микрокристаллитов (рис. 2Б), тогда как растительная (хлопковая) МКЦ отличается наличием коротких веретенообразных форм (рис. 2А). С использованием полуавтоматического метода измерения, предоставляемого программой SmartTiff («Zeiss»), на микрофотографиях были определены поперечные размеры около тысячи микрофибрилл хлопковой и бактериальной целлюлозы. Поперечный размер микрокристаллитов хлопковой целлюлозы составил около 21,2 нм, а их длина укладывалась в диапазон 200-300 нм. Исследование частоты встречаемости микрокристаллитов бактериальной целлюлозы показало, что среднее значение их размера составляет 16,6 нм. При гидролизе микрофибриллы бактериальной целлюлозы уменьшаются в диаметре без укорочения, то есть аморфные участки расположены преимущественно на поверхности микрофибрилл. юлозы, визуализированная на электронном микромикроскопе Multimod 8 Bruker (Б). Масштабная Рис. 2. Образцы микрокристаллической целлюлозы, визуализированные на электронном микроскопе SEM SigmaVP ZEISS: А - МКЦ из хлопковой целлюлозы, Б - МКЦ из бактериальной целлюлозы. Масштабная линейка 100 нм 23 Окружающая среда Экология человека 2018.02 В ходе оценки острой и подострой токсичности было показано, что применение МКЦ не приводило к изменению физиологического состояния экспериментальных животных: не было выявлено их гибели. Крысы были подвижны, активно передвигались по клетке, при незначительных болевых и тактильных раздражителях наблюдалась реакция голосовая и активно-оборонительная, кусательные движения. Потребление пищи животными - без изменений, не отличалось от данного показателя в контрольной группе. При исследовании не выявлено отклонений в состоянии волосяного и кожного покрова животных. Слизистые оболочки влажные, бледно-розового цвета. Шерсть животных блестящая, не загрязнена, кожные покровы и окраска в норме. При оценке подострой токсичности показано, что динамика прироста массы тела животных (таблица) на 7-й день эксперимента зависела от дозы МКЦ. В группе животных, получавших МКЦ в дозе 4,9 мг/ кг, масса тела значимо не отличалась от параметра в контрольной (интактной) группе. Интрагастральное введение крысам МКЦ в дозе 43,4 и 434,8 мг/кг приводило к увеличению массы тела крыс в 2,2-2,3 раза соответственно. При этом потребление пищи, активность, окраска слизистых, состояние волосяного и кожного покрова не изменялось. Среднесуточный и относительный прирост экспериментальных животных Показатель 1 группа, самцы 2 группа, самки 3 группа, самцы 4 группа, самки Прирост массы тела за 7 суток, % 15,0 ± 0,47 12,2 ± 1,38 34,1 ± 0,16 33,1 ± 0,23 Относительная среднесуточная масса тела, % 2,1 1,7 4,9 4,7 Наличие/отсутствие гибели животного Гибель животных в группах отсутствует Примечание. Значимость различий с группой интактных животных р < 0,05 Представленные результаты показывают, что бактериальная МКЦ в дозе 4,9 мг/кг не обладает токсичностью и может быть отнесена к 4 классу опасности: «вещества малоопасные». Экспериментальные данные служат основанием для дальнейшего исследования МКЦ бактериального происхождения. Обсуждение результатов Бактериальные клетки синтезируют целлюлозу в среду в виде микрофибрилл, в этом случае параллельной укладки микрофибрилл не происходит. Отсутствие пространственных ограничений для передвижения бактерий в среде приводит к формированию сетчатой целлюлозной матрицы, в которой практически не происходит структурирования и строгой ориентации элементов надмолекулярной структуры. Учитывая сетчатую структуру получаемого материала, его доступность для химической модификации, применение целлюлозы бактериального происхождения в разработке новых модификаций целлюлозных нанокомпозитов для фармацевтической промышленности является весьма перспективным. Биотехнологически получаемая целлюлоза применима для производства на ее основе препаратов МКЦ. Выделенная МКЦ является частично деполи-меризованным препаратом бактериальной целлюлозы. Сравнение микроморфологических особенностей микрокристаллитов МКЦ растительного и бактериального происхождения, связанных с особенностями биосинтетических процессов, показало, что микрокристаллиты бактериальной МКЦ имеют более вытянутую форму по сравнению с растительной (хлопковой) МКЦ и характеризуются уменьшением поперечных размеров микрофибрилл примерно в 2 раза в результате кислотного гидролиза. Преимущественно поверхностная локализация аморфных участков в микрофибриллах бактериального происхождения обусловливает формирование микрокристаллитов большой длины, практически идентичной исходной длине микрофибрилл. Степень кристалличности препаратов МКЦ является важной структурной характеристикой целлюлозного наноматериала, обусловливающей процессы его деструкции, набухания и химической активности. Особенностью МКЦ, определяющей потребительские свойства и практическую ценность, является наличие в ее составе отдельных высококристаллических агрегатов. По результатам проведенных нами ранее исследований [3, 6], степень кристалличности полученных препаратов МКЦ бактериального происхождения имеет максимальное значение (после гидролиза в течение 4 ч). Значение этого показателя примерно в 2 раза выше, чем у исходной бактериальной целлюлозы. Степень кристалличности МКЦ из хлопка, широко применяемой в настоящее время, составляет 72,7 % относительно МКЦ бактериального происхождения. Высокая степень кристалличности МКЦ, полученной из бактериальной целлюлозы, обусловливает возможность ее применения в области производства препаратов лекарственного и пищевого назначения. Несомненно, одним из важных свойств новых биоматериалов для фармацевтики является биосовместимость, способность функционировать в организме, не вызывая существенных негативных процессов. Аспекты биосовместимости МКЦ бактериального происхождения и ее применения в медицине активно изучаются и публикуются в работах зарубежных и отечественных научных коллективов. В частности, изучается применение МКЦ (в т. ч. и бактериального происхождения) и ее производных в качестве транс-дермальных терапевтических систем, компонентов лекарственных форм, новых поверхностно-активных материалов для доставки и инкапсулирования лекарств, в технологии тканей и пр. [1, 4, 9, 11-13]. Анализ результатов исследования острой и подо-строй токсичности показал, что внутрижелудочное введение препаратов МКЦ бактериального происхождения методом фиксированной дозы из расчета 4,9-43,4-434,8 мг/кг массы тела в организм экс 24 Экология человека 2018.02 Окружающая среда периментальных животных через полиуретановый зонд не вызывает их гибели и отклонений от нормального физиологического состояния. Препарат МКЦ бактериального происхождения при интрагастральном введении белым нелинейным крысам в дозе 4,9 мг/кг согласно ГОСТ 121007-76 можно отнести к 4 классу опасности: «вещества малоопасные». МКЦ представляет интерес для дальнейшего анализа и выявления дополнительных биологических эффектов, имеющих значение в разработке продуктов функционального питания, биологически активных добавок к пище, лекарственных препаратов, косметических средств. Работа выполнена с использованием оборудования ЦКП НО «Арктика» Северного (Арктического) федерального университета имени М. В. Ломоносова (уникальный идентификатор RFMEFI59417X0013) в рамках базовой части государственного задания Минобрнауки РФ № 15.8815.2017/8.9 «Молекулярнобиологические методы в биотехнологии термостабильных ферментов»

About the authors

K S Bolotova

Northern (Arctic) Federal University

Email: k.bolotova@narfu.ru

O V Buyuklinskaya

Northern State Medical University

A S Chistyakova

Northern State Medical University

O V Travina

Federal Center for Integrated Arctic Research of Russian Academy of Sciences

D G Chukhchin

Northern (Arctic) Federal University

References

Supplementary files