THE POPULATIONS OF PERIPHERAL BLOOD LEUKOCYTES CARRYING ADHESION MOLECULES, IN PATIENTS WITH PSORIASIS

Full Text

Миграция лейкоцитов через эндотелий сосудов микроциркуляторного русла регулируется молекулами адгезии [4, 18]. Процесс миграции лейкоцитов в ткани представляет собой трехступенчатый процесс, включающий скольжение - роллинг - лейкоцитов по поверхности эндотелия с последующей фазой прочной адгезии и заканчивающийся фазой трансмиграции лейкоцитов через эндотелий [15, 19]. Роллинг лейкоцитов опосредуется низкоаффинными рецепторами - селектинами, в том числе L-селектинами [17]. Фаза прочной адгезии реализуется с участием молекул ICAM-1, LFA-1, LFA-3 [20]. Собственно миграция лейкоцитов через эндотелий связана с экспрессией молекул PECAM [16]. Сведения о концентрациях молекул адгезии на нейтрофилах, моноцитах и лимфоцитах в условиях гиперпролиферации кератиноцитов единичны и противоречивы [8, 9, 14, 17]. В литературе нет сведений относительно уровня экспрессии молекул адгезии в зависимости от морфологических особенностей ней-трофилов, моноцитов и лимфоцитов. Таким образом, следует признать, что литературные данные по этому вопросу явно недостаточны, а сама проблема находится в стадии накопления фактов [18]. Принимая во внимание громадную физиологическую роль процессов миграции лейкоцитов из микроциркуляторного русла в ткани, сведения о концентрации молекул адгезии на нейтрофилах, моноцитах и лимфоцитах с учетом их морфологических особенностей представляют, несомненно, теоретический и практический интерес [7]. Углубленное изучение процессов миграции иммуно-компетентных клеток, а также условий, при которых может активизироваться или замедляться миграция, является особенно важным для понимания механизмов миграционной активности иммунокомпетентных клеток [5, 6, 12]. Практическая значимость работы заключается в том, что изучение механизмов миграции лейкоцитов необходимо для прогнозирования течения заболевания и обоснования поиска новых эффективных методов лечения. Все перечисленное определяет безусловную актуальность, перспективность и практическую значимость научного поиска механизмов регуляции миграционной активности иммунокомпетентных клеток [10, 13]. В связи с этим целью настоящего исследования было изучение миграции лейкоцитов, несущих молекулы адгезии, из периферической крови в кожу при псориазе и их роль в развитии патологического процесса. Методы Проведено клинико-иммунологическое обследование 82 больных вульгарными и экссудативными формами псориаза в прогрессирующую и стационарную стадии (39 женщин и 43 мужчины) в возрасте от 20 до 60 лет. Длительность заболевания составила от 3 месяцев до 10 лет. В качестве контрольной группы обследованы 50 практически здоровых лиц (28 женщин и 22 мужчины), не имеющих на момент обследования острых хронических заболеваний или их обострения. Обследование проводили с письменного согласия респондентов, с соблюдением основных норм биомедицинской этики в соответствии с документом «Этические принципы проведения медицинских исследований с участием людей в качестве субъектов исследования» (Хельсинкская декларация Всемирной медицинской ассоциации 1964 года с изменениями и дополнениями на 2008 год). Тип исследования - одномоментное поперечное. Критерии включения пациентов в исследование: возраст 20-60 лет, наличие псориаза вульгарной и экссудативной форм в прогрессирующей и стационарной стадиях, весенне-зимней формы; наличие информированного согласия пациента. Критерии исключения: лица возраста до 20 и старше 60 лет; наличие сопутствующей патологии сердечно-сосудистой, дыхательной, пищеварительной, эндокринной систем с функциональными нарушениями и/или в стадии суб-и декомпенсации; наличие иных клинических форм псориаза: летняя форма псориаза, псориатическая эритродермия, инверсный и пустулезный псориаз, псориаз ладоней и подошв; отказ от проведения исследования на первом и последующих этапах; отсутствие информированного согласия; отказ пациента после проведения обследования предоставить свои данные для статистической обработки. Венозную кровь для исследования брали утром натощак. На проточном цитометре FC-500 фирмы Beckman Coulter определяли удельный вес ней-трофилов, моноцитов и лимфоцитов, содержащих молекулы L-селектина (CD62L), ICAM-1 (CD54), LFA-1 (CD11a), LFA-3 (CD58), PECAM-1 (CD31). На мазке крови, зафиксированном смесью Никифорова и окрашенном по Романовскому - Гимзе, определяли удельный вес нейтрофилов, эозинофилов, базофилов, моноцитов, лимфоцитов [11]. В микроскопическом мазке венозной крови подсчитывали среднее количество фрагментов ядра у 100 нейтрофильных лейкоцитов [2]. В соответствии с методом, предложенным О. П. Григоровой [1], дифференцировали моноциты по морфологии ядра на промоноциты, собственно моноциты и полиморфно-ядерные моноциты. При изучении лимфоцитограммы дифференцировали лимфоциты по величине клетки с учетом размеров цитоплазмы: малые лимфоциты - до 8 мкм, средние - от 8 до 12 мкм, большие - больше 12 мкм [3]. Статистическую обработку результатов проводили с помощью «SPSS 13.0 for Windows». Распределение параметров было ненормальным, в связи с чем описание выборок осуществляли с помощью подсчета медианы (Мd) и межквартильного интервала (Q1; Q3). Вероятность различий оценивали по непараметрическим критериям Колмогорова - Смирнова, Вилкоксона. Корреляционный анализ проведен с использованием коэффициента корреляции Спирмена и расчетом уровня значимости. Результаты У больных псориазом по сравнению с контрольной группой регистрировали незначительную тенденцию 46 Экология человека 2017.12 Медицинская экология к снижению общего содержания нейтрофилов (с 3,90-Ш9 кл/л (3,02; 4,78) до 3,51 • 109 кл/л (2,89; 4,58); Z = 0,79; p = 0,55) и лимфоцитов (с 2,56-109 кл/л (2,05; 3,20) до 2,22-109кл/л (1,85; 3,00); Z = 1,23; p = 0,09), при этом изменений концентрации моноцитов в периферической крови (0,35-109 кл/л (0,22; 0,54) и 0,36-109 кл/л (0,21; 0,53); Z = 1,13; p = 0,19) не наблюдали. При наличии псориатических высыпаний в прогрессирующую и стационарную стадии выявляли снижение концентрации в периферической крови нейтрофилов и лимфоцитов, несущих молекулы L-селектина (с 2,43 109 кл/л (1,34; 3,63) до 2,20 • 109 кл/л (1,39; 2,99); Z = 1,15; р = 0,14, и с 0,32-109 кл/л (0,12; 0,64) до 0,24-109 кл/л (0,06; 0,57); Z = 1,15; р = 0,12) соответственно. В то же время в содержании моноцитов, имеющих данную молекулу, изменений не регистрировали (0,08-109 кл/л (0,02; 0,24) против 0,08-109 кл/л (0,05; 0,18); Z = 0,71; р = 0,88). В условиях гиперпролиферации кератиноцитов уровень нейтрофилов, несущих молекулу ICAM-1, имел тенденцию к снижению (с 1,91-109 кл/л (1,16; 2,85) до 1,58 109 кл/л (0,71; 2,62); Z = 0,94; р = 0,33), тогда как содержание лимфоцитов с данной молекулой, наоборот, увеличивалось (с 0,29-109 кл/л (0,10; 0,68) до 0,33-109 кл/л (0,12; 0,85); Z = 0,77; p = 0,58). Изменений в концентрации моноцитов, имеющих молекулу ICAM-1, не регистрировали. Если снижение абсолютного числа нейтрофилов с молекулой LFA-1 было в виде тенденции (с 3,67-109 кл/л (2,85; 4,60) до 3,25-109 кл/л (2,24; 4,36); Z = 0,99; р = 0,27), то снижение концентрации лимфоцитов, имеющих данную молекулу, было статистически значимым (с 1,73-109 кл/л (1,15; 2,27) до 1,26109 кл/л (0,68; 2,16); Z = 1,68; p = 0,007). Изменения в содержании моноцитов с молекулой LFA-1 не наблюдали. Наряду с появлением псориатической сыпи выявляли статистически значимое снижение концентрации нейтрофилов с молекулой LFA-3 (с 3,14 • 109 кл/л (1,77; 4,55) до 2,32-109 кл/л (1,43; 3,65); Z = 1,46; р = 0,02), при этом увеличение содержания лимфоцитов, несущих LFA-3, было только в виде тенденции (с 0,91-109 кл/л (0,31; 2,28) до 1,11109 кл/л (0,18; 1,79); Z = 0,77; p = 0,58). Изменения в содержании моноцитов с молекулой LFA-3 не наблюдали. Подобную ситуацию регистрировали в отношении молекулы PECAM-1: на фоне тенденции к снижению концентрации нейтрофилов с молекулой PECAM-1 (с 3,53-109 кл/л (2,59; 4,47) до 3,0-109 кл/л (2,20; 3,76); Z = 0,95; р = 0,31). Отмечали статистически значимое уменьшение числа лимфоцитов (с 0,41-109 кл/л (0,13; 0,75) до 0,20-109 кл/л (0,06; 0,4); Z = 1,41; p = 0,03) и без изменений уровня моноцитов с молекулой PECAM-1. Таким образом, развитие псориатического процесса сопровождается снижением в периферической крови числа нейтрофилов, несущих молекулы L-селектина, ICAM-1, LFA-1, LFA-3, PECAM-1; уровень лимфо цитов с молекулами ICAM-1, LFA-3 незначительно увеличивается, но уменьшается число лимфоцитов с молекулами L-селектина, LFA-1, PECAM-1; изменения в уровне моноцитов, несущих молекулы адгезии, отсутствуют. Анализ сегментограммы показал, что в периферической крови регистрировали статистически значимое снижение нейтрофилов с 4 (с 1, 13 • 109 кл/л (0,9; 1,59) до 1,01-10в кл/л (0,67; 1,43); Z = 1,56; p = 0,01) и 5 (с 0,55 • 109 кл/л (0,38; 0,68) до 0,3 • 109 кл/л (0,13; 0,50); Z = 2,45; p = 0,001) сегментами в ядре. При оценке лимфоцитограммы (рис. 1) установлено, что в венозной крови у больных псориазом в сравнении с группой контроля различий в содержании малых и средних лимфоцитов не выявлено: 0,78-109 кл/л (0,50; 1,08) против 0,63-109 кл/л (0,40; 1,07); Z = 0,85; р = 0,45, и (0,94 • 109 кл/л (0,69; 1,37) против 1,04 •Ю9 кл/л (0,81; 1,41); Z = 0,89; р = 0,39. При этом наблюдаемое снижение концентрации больших лимфоцитов было статистически значимым: с 0,25-109 кл/л (0,11; 0,39) до 0,03-109 кл/л (0,1; 0,16); Z = 2,45; р = 0,001. Рис. 1. Лимфоцитограмма у практически здоровых и больных псориазом Примечания', по оси абсцисс - группы лимфоцитов в зависимости от величины их клетки с учетом размеров цитоплазмы: малые лимфоциты - до 8 мкм, средние - 8-12 мкм, большие - больше 12 мкм; по оси ординат - содержание лимфоцитов в процентах (Md); ** - р < 0,01, сравнение между практически здоровыми и больными псориазом (непараметрический критерий Колмогорова - Смирнова). Анализ моноцитограммы (рис. 2) продемонстрировал, что в условиях гиперпролиферации кератино-цитов наблюдается увеличение в крови содержания промоноцитов (с 0,09 • 109 кл/л (0,05; 0,14) до 0,12-109 кл/л (0,07; 0,20); Z = 1,07; р = 0,20) при снижении концентрации собственно моноцитов (с 0,12Ч09 кл/л (0,07; 0,20) до 0,10 • 109 кл/л (0,05; 0,18); Z = 0,75; р = 0,61) без существенных изменений в уровне полиморфно-ядерных моноцитов (0,12 409 кл/л (0,06; 0,20) и 0,12 • 109 кл/л (0,07; 0,20); Z = 0,38; р = 0,99). Корреляционный анализ (рис. 3a) на этапе роллин-га у больных псориазом показал наличие значимых корреляций между уровнем экспрессии L-селектина с концентрацией нейтрофилов с 1, 2 и 3 сегментами в 47 Медицинская экология Экология человека 2017.12 Рис. 2. Моноцитограмма (промоноциты, собственно моноциты, полиморфно-ядерные моноциты) у практически здоровых лиц и больных псориазом ядре. Напротив, в контрольной группе между концентрацией нейтрофилов с L-селектином и содержанием нейтрофилов с 2 сегментами значимых корреляций не выявлено, но определена значимая связь между содержанием нейтрофилов с L-селектином и нейтро-филами с 3, 4 и 5 сегментами в ядре. Существенные различия были отмечены в отношении нейтрофилов, экспрессирующих молекулу ICAM-1: у больных псориазом в отличие от контрольной группы регистрировались статистически значимые корреляции с содержанием нейтрофилов с 2, 3 и 4 сегментами в ядре и исчезли в случае, когда нейтрофилы имели 5 и более сегментов (рис. 3b). На этапе прочной адгезии количество нейтрофилов с молекулой LFA-1 коррелировало с концентрацией нейтрофилов с 1, 2, 3, 4 и 5 сегментами в ядре как у больных псориазом, так и у здоровых лиц, с той разницей, что у больных псориазом наблюдалось ослабление корреляционных связей (рис. 3c). Между содержанием нейтрофилов с рецепторами LFA-3 выявлены корреляции с концентрациями нейтрофилов, содержащих 1, 2, 3 и 4 сегмента в ядре как у больных псориазом, так и у здоровых лиц. Корреляций с нейтрофилами, содержащими 5 сегментов в ядре, не прослеживалось ни у больных псориазом, ни в группе контроля (рис. 3d). На этапе трансмиграции у практически здоровых регистрировали значимые корреляции между содержанием нейтрофилов, имеющих рецепторы PECAM-1, с концентрацией нейтрофилов, содержащих 1, 2, 3, Практически здоровые Больные псориазом 1 сегмент (+0,36*) я 1 сегмент (+0,25*) L-селе ктин (+0,04* \\Г * (+0,18) L-селектин - \ 3 сегмента (+0 44*) 5 сегментов і ' (+0,04) 4 сегмента (+0.59**) 2 сегмента (+0,28*) 3 сегмента (+0,29*) 4 сегмента (+0,17) a b 48 Экология человека 2017.12 Медицинская экология Рис. 3. Корреляция между содержанием молекул адгезии L-селектина (CD62L) - а, ICAM-1 (CD54) - b, LFA-1 (CD11a) - с, LFA-3 (CD58) - d, PECAM-1 (CD31) - e на нейтрофилах и сегментацией ядер нейтрофильных лейкоцитов Условные обозначения: слабая связь - стрелка со штрихами; умеренная связь - стрелка средней толщины; высокая связь - стрелка толстая. В скобках указаны корреляционные значения по Спирмену и значимость коэффициента корреляции * - p < 0,05 и ** - p < 0,01. 4, 5 и более сегментов в ядре. У больных псориазом корреляционные связи ослабевали и даже отсутствовали в случае с нейтрофилами, содержащими 2 и 5 сегментов в ядре (рис. 3e). Корреляционный анализ лимфоцитов на этапе роллинга у больных псориазом показал отсутствие значимых корреляций между содержанием лимфоцитов с молекулой L-селектина и концентрацией малых, средних и больших лимфоцитов, тогда как в группе контроля между концентрациями средних по размеру лимфоцитов и лимфоцитами с молекулой L-селектина выявлена статистически значимая корреляция (r = 0,35; р = 0,01). Существенные различия были отмечены в отношении лимфоцитов, имеющих молекулу ICAM-1: у больных псориазом в отличие от контрольной группы регистрировались статистически c d e 49 Медицинская экология Экология человека 2017.12 значимые корреляции с содержанием средних (r = 0,29; р = 0,013) и больших лимфоцитов (r = 0,39; р = 0,005). На этапе прочной адгезии количество лимфоцитов с LFA-1 коррелировало с концентрацией средних лимфоцитов как у больных псориазом (r = 0,50; р = 0,001), так и у здоровых лиц (r = 0,57; р = 0,001). Различие состояло в том, что у больных псориазом была отмечена корреляция с большими лимфоцитами (r = 0,41; р = 0,003) и не было, как в группе контроля, корреляций с концентрацией малых лимфоцитов. Между содержанием лимфоцитов с LFA-3 выявлены корреляции с концентрациями средних лимфоцитов как у больных псориазом (r = 0,49; р = 0,001), так и у здоровых лиц (r = 0,43; р = 0,01). Отличительной особенностью было то, что у больных псориазом наблюдалась корреляция LFA-3 с большими лимфоцитами (r = 0,59; р = 0,001), которой не было в группе контроля. На этапе трансмиграции у больных псориазом выявлены статистически значимые корреляции между уровнем лимфоцитов с молекулой PECAM-1 и концентрациями средних (r = 0,34; р = 0,01) и больших лимфоцитов (r = 0,47; р = 0,001). В группе контроля статистически значимых корреляций не выявлено. Корреляционный анализ моноцитов показал, что в условиях псориаза концентрация промоноцитов коррелировала только с содержанием моноцитов с молекулами LFA-1 и ICAM-1 (r = 0,39; р = 0,005 и r = 0,43; р = 0,002), в то же время у собственно моноцитов появилась корреляция с концентрацией моноцитов, содержащих молекулу LFA-3 (r = 0,38; р = 0,03), а у полиморфно-ядерных моноцитов еще и содержанием моноцитов с молекулой PECAM-1 (r = 0,45; р = 0,03). Обсуждение результатов Накопленный в настоящее время фактический материал показывает, что функциональные возможности нейтрофильных лейкоцитов выходят за пределы традиционного понимания как о клетках только системы противоинфекционной защиты организма [2]. Имеется достаточно много свидетельств о роли нейтрофилов в представлении антигенов и аутоантигенов моноцитам и лимфоцитам, влиянии на антителообразование, а также возможности регулировать функции иммунокомпетентных клеток через продукцию цитокинов [8, 9]. На основании полученных данных можно утверждать, что в прогрессирующую и стационарную стадии псориаза циркулирующие нейтрофильные лейкоциты имеют на своей поверхности молекулы адгезии -L-селектина, LFA-1, ICAM-1, LFA-3, PECAM-1. Если учитывать, что в сосудистом русле существуют два почти равных пула нейтрофилов: циркулирующий и пристеночный, а при заборе венозной крови сосчитывается только циркулирующий пул, можно полагать, что у больных псориазом, впрочем как и в группе контроля, уже на уровне нейтрофилов циркулирующего пула имеются все необходимые возможности для трансмиграции [7, 13]. Снижение абсолютного количества нейтрофилов, экспрессирующих молекулы адгезии, может быть связано либо с уменьшением поступления их из красного костного мозга в кровь, либо повышением интенсивности миграции из крови в ткань, в частности в кожу. В случае снижения поступления нейтрофилов из красного костного мозга изменения в структуре сегментограммы касались бы резкого увеличения незрелых форм, т. е. односегментных нейтрофилов [2]. В соответствии с полученными данными при псориазе, наоборот, регистрировали увеличение 2 и 3 сегментных форм, что не подтверждает версии о снижении поступления нейтрофилов из красного костного мозга в периферическую кровь. В пользу повышенной миграционной активности нейтрофилов из крови в ткань может свидетельствовать наличие положительных статистически значимых корреляций между концентрациями 2 и 3 сегментных форм ней-трофилов с содержанием нейтрофилов с молекулами L-селектина, ICAM-1, LFA-1, LFA-3, PECAM-1. Кроме того, в пользу повышенной миграционной активности нейтрофилов из крови в кожу также свидетельствует скопление нейтрофилов в эпидермисе псориатической папулы, определяемые как псевдоабсцессы Мунро [1]. В свою очередь, известно, что адгезия, вызванная селектинами, обратима, кратковременна и малоэффективна. Более прочную и необратимую адгезию нейтрофилов на эндотелии обусловливают В2-интегрины, к которым относится молекула LFA-1 [14]. В соответствии с результатами исследования при псориазе число нейтрофилов циркулирующего пула с молекулой LFA-1 превышало число нейтрофилов с молекулой L-селектина (3,25-109 кл/л (2,24; 4,36) против 2,20- 109 кл/л (1,39; 2,99); W = -6,58; р = 0,0001. Учитывая возможность протеолитического отщепления молекулы L-селектина при экспрессии на нейтрофилах ß2 -интегринов на клеточной поверхности, что определяется как шеддинг-феномен, можно предполагать, что шеддинг молекул L-селектина при псориазе проявляется среди нейтрофилов циркулирующего пула достаточно активно и связан с необходимостью более интенсивной миграции нейтрофилов в ткань [6, 13]. В условиях псориаза содержание малых лимфоцитов не изменялось. Не было и статистически значимых корреляций между концентрациями малых лимфоцитов и лимфоцитов, несущих молекулы L-селектина, ICAM-1, LFA-1, LFA-3 и PECAM-1. В связи с этим можно предполагать отсутствие существенной роли малых лимфоцитов в патогенезе гиперпролиферации кератиноцитов при псориазе. Изменений в концентрации средних лимфоцитов у больных псориазом не регистрировали. Корреляции между содержаниями средних лимфоцитов и лимфоцитов, имеющих молекулы LFA-1 и LFA-3, наблюдали как у больных псориазом, так и в группе контроля. Отличием являлось то, что в условиях гиперпролиферации кератиноцитов отмечены статистически значимые 50 Экология человека 2017.12 Медицинская экология корреляции между уровнями средних лимфоцитов и лимфоцитов с молекулами ICAM-1 и PECAM-1. Наибольшие изменения касались содержания в венозной крови больших лимфоцитов, уровень, которых был существенно снижен. Как известно, большие лимфоциты являются свидетельством лимфопроли-ферации [8, 15]. Складывается впечатление, что в условиях гиперпролиферации кератиноцитов либо лимфопролиферативная реакция снижается, либо увеличивается миграция именно больших, но не средних, а тем более малых лимфоцитов. В пользу увеличения миграционной активности больших лимфоцитов может указывать тот факт, что хронический воспалительный процесс сопровождается лимфопролиферацией, и псориаз в этом смысле не исключение [7, 10, 13]. С другой стороны, наличие статистически значимых корреляций между концентрациями больших лимфоцитов и лимфоцитов, несущих молекулы ICAM-1, LFA-1, LFA-3 и PECAM-1, при отсутствии таковых корреляций в группе контроля может указывать на преимущественную миграцию лимфоцитов, вступивших в лимфопролиферацию. В условиях гиперпролиферации кератиноцитов наблюдалось снижение удельного веса собственно моноцитов и значимая корреляция их с концентрацией моноцитов, несущих молекулу ICAM-1, что может указывать на готовность к миграции собственно моноцитов. Таким образом, изучение механизмов миграционной активности лейкоцитов из периферической крови в кожу при псориазе представляет собой не только теоретический, но и практический интерес, поскольку регуляция данного процесса дает новые возможности в терапии.

About the authors

A K Sherstennikova

Northern State Medical University

Email: a.sherstennikova@yandex.ru
Arkhangelsk

S L Kashutin

North-Western State Medical University named by I. I. Mechnikov

Saint-Petersburg, Russia

V I Nikolaev

Northern State Medical University

Arkhangelsk

V S Neklyudova

Northern State Medical University

Arkhangelsk

L L Shagrov

North-Western State Medical University named by I. I. Mechnikov

Saint-Petersburg, Russia

S V Klyuchareva

North-Western State Medical University named by I. I. Mechnikov

Saint-Petersburg, Russia

V A Pyryatynsky

Northern State Medical University

Arkhangelsk

References

Supplementary files