CORRELATION OF THE SHEDDING OF LYMPHOCYTES RECEPTORS WITH PARAMETERS OF IMMUNOLOGIC REACTIVITY IN RESIDENTS OF THE NORTH

Full Text

Важную роль в реализации иммунного ответа играют поверхностные мембранные белки иммуно-компетентных клеток, экспрессирующиеся на разных этапах гемопоэза: маркеры активации, дифференци-ровки, пролиферации, апоптоза. Следует отметить, что каждой стадии дифференцировки соответствует собственный набор клеточных поверхностных антигенов, являющихся маркерами различных клеточных популяций [2]. В настоящее время установлено, что у белков, присутствующих на мембране клеток иммунной си стемы, могут быть растворимые гомологи, которые обнаруживаются в биологических жидкостях, в том числе в крови, в разных концентрациях. Таким образом, наряду с мембранными белками в осуществлении иммунных реакций принимают участие и их растворимые формы (s-формы), образующиеся за счёт протеолитического слущивания. Растворимая форма, образованная путем шеддинга, характеризуется отсутствием внутриклеточного и трансмембранного доменов и вследствие этого имеет меньшую молекулярную массу, чем мембранная форма. Присутствую 29 Экологическая физиология Экология человека 2016.11 щие в её составе внеклеточные домены, как правило, сохраняют свои функциональные возможности, что существенно для выполнения биологической роли, связанной с регуляцией иммунного ответа [16]. Доказано, что s-формы поверхностных мембранных белков иммунокомпетентных клеток обладают иммунорегуляторными свойствами, а их уровни могут отражать процессы активации иммунной системы и служить маркерами течения патологического процесса [1]. Экспрессия мембранных и растворимых форм дифференцировочных антигенов имеет различные механизмы регуляции, а повышение уровня экспрессии мембранного антигена не обязательно влечет за собой увеличение уровня растворимой формы антигена во внеклеточном пространстве и наоборот. Нарушение их равновесного содержания в межклеточном пространстве и биологических жидкостях организма приводит к модуляции межклеточных мембранных взаимодействий и соответственно иммунного ответа. В связи с этим растворимые формы мембранных антигенов рассматривают в качестве эндогенных иммунорегуляторных молекул, интегрированных в глобальную иммунологическую сеть [6]. Следует отметить, что до сих пор не изученным остается вопрос, на каком именно этапе своего развития происходит освобождение мембраны клеток от рецепторов. Имеются сведения, что этот процесс связан с активизацией клетки, то есть процессами её пролиферации и дифференцировки [2, 8, 12]. Однако конкретные данные по этому вопросу отсутствуют. Исходя из этого целью настоящей работы было изучение динамики иммунологических показателей при изменении соотношения мембранных и растворимых форм дифференцировочных антигенов иммунокомпе-тентных клеток. Методы В настоящем исследовании были использованы материалы иммунологических обследований, проведенных на базе Института физиологии природных адаптаций УрО РАН. Для изучения соотношения мембранной и растворимой форм рецепторов лимфоцитов проведено одномоментное (поперечное) проспективное исследование, в ходе которого были проанализированы результаты обследования иммунного статуса 78 практически здоровых жителей г. Архангельска в возрасте от 25 до 54 лет (мужчин 10 - 12,8 %, женщин 68 - 87,2 %). Комплекс исследований включал определение содержания в периферической крови лимфоцитов фенотипов CD3+, CD4 + , CD5+, CD8+, CD10+, CD16+, CD22+, CD23+, CD25+, CD71 + , CD80+, CD95+, HLADR+ с помощью непрямой иммунопероксидазной реакции с использованием препаратов лимфоцитов типа «высушенной капли» (реактивы НПЦ «МедБиоСпектр», г. Москва). Были изучены лейкограмма, фагоцитарное число и фагоцитарный показатель. Содержание цитокинов: интерлейкина-1 (IL-1), интерлейкина-6 (IL-6), интерлейкина-10 (IL-10), фактора некроза опухоли-альфа (TNF-a), иммуноглобулинов (Ig) классов A, M, G, E, РЭА, INF-y определяли с помощью твердофазного иммуноферментного метода. Учет результатов проводили на спектрофотометре серии «Multiscan» (Labsystems, Финляндия). Концентрацию свободных форм мембранных антигенов CD23+, CD80+ в сыворотке крови определяли с помощью твердофазного иммуноферментного метода на анализаторе Evolis фирмы «Bio-RAD» (реактивы «Bender MeSystem», GmbH). По каждому из перечисленных показателей были рассчитаны параметры описательной статистики (М - среднее арифметическое значение, с - стандартное отклонение, m - стандартная ошибка среднего, Md - медиана, R - размах, W - коэффициент вариации, границы 95 % доверительного интервала). Проверка законов распределения значений иммунологических показателей выполнялась с использованием статистического х2-критерия Пирсона. Проверка нулевой гипотезы о равенстве всех средних в исследуемых группах осуществлялась с использованием однофакторного дисперсионного анализа. В условиях неподчинения данных закону нормального распределения сравнение двух разных групп по количественным признакам проводилось с использованием непараметрического критерия Манна - Уитни. Для изучения соотношения уровней содержания мембранной и свободной форм дифференцировочных антигенов CD23+ исходные значения в базе данных были разделены на четыре выборки: высокое содержание мембранной формы mCD23+ на фоне значимого снижения (1 группа, n = 24) и повышения (2 группа, n = 18) уровней растворимой формы; высокое содержание свободной формы sCD23+ с одновременным снижением (3 группа, n = 19) и значимо низкой концентрацией мембранной формы (4 группа, n = 17). Для изучения баланса между мембранной и растворимой формами дифференцировочного антигена CD80+ деление на подгруппы производили следующим образом: параллельно низкое содержание мембранного и свободного рецептора (1 группа, n = 25), повышение концентрации мембранного антигена mCD80+ с одновременно низкими уровнями свободного (2 группа, n = 28), среднее содержание mCD80+ и параллельное повышение концентрации свободной формы sCD80+ (3 группа, n = 25). Для оценки динамики иммунологических показателей при изменении соотношения между мембранной и свободной формами дифференцировочных антигенов CD23+, CD80+ на основании средних значений, рассчитанных для каждой фазы, были определены коэффициенты динамики - темпы прироста (убыли) (в %) уровней переменных по следующей формуле: У-о-. T = J2Ü . 100 - 100 i 30 Экология человека 2016.11 Экологическая физиология При анализе рассчитанных темпов прироста (убыли) оценке подвергали значения, соответствующие тем иммунологическим показателям, для которых были обнаружены статистически значимые различия в средних уровнях между выделенными группами. Математический и статистический анализ результатов исследования проводился на компьютере IBM/ AT-Pentium 4 с использованием пакета прикладных программ «Microsoft Excel 2010» (США) и «Statistica 7.0» («StatSoft», США). Критический уровень значимости (p) в данной работе принимался равным 0,05. Результаты Рассчитанные в процессе статистического анализа коэффициенты темпа прироста (убыли) позволили проанализировать количественную динамику основных показателей иммунного статуса на различных этапах соотношения уровней mCD23 и sCD23 (табл. 1). Таблица 1 Оценка средних темпов изменения уровней (в %) иммунологических показателей в процессе сброса рецептора mCD23 с клетки между выделенными группами Показа тель 1-2 этап шеддинга р между группами 1 и 2 2-3 этап шеддинга р между группами 2 и 3 3-4 этап шеддинга р между группами 3 и 4 CD4 + 56,0* 0,042 - 37,2 0,095 -24,5 0,250 CD8 + 43,3* 0,050 -47,5* 0,002 - 11,9 0,527 CD10+ 20,4 0,208 -29,2 0,065 - 39,1* 0,009 CD22 + 21,4 0,362 -29,4 0,294 -47,9* <0,001 CD16+ 52,2* 0,048 -47,1* <0,001 -22,2 0,299 CD25 + 32,3 0,066 -39,2* 0,005 -22,2 0,254 CD71 + 32,7 0,091 - 36,9 0,055 -34,1 0,177 CD80 + 38,6 0,177 -46,8* 0,001 0,0 1,000 CD95 + 15,0 0,215 -27,5 0,088 -24,0 0,269 HLADR+ 50,0* 0,002 -39,5* 0,033 - 38,8 0,052 IgE 55,3* 0,050 -43,6* 0,002 - 15,4 0,813 IgA 2,5 0,890 - 5,0 0,094 6,8 0,566 IL-1 90,0* <0,001 33,8 0,501 - 16,9 0,635 IL-6 -65,1* <0,001 7,8 0,826 - 36,4 0,093 IL-10 62,4* 0,004 7,4 0,864 64,2* 0,005 %АФ -23,5 0,196 38,5* 0,036 -31,0 0,079 ФЧ -25,2 0,085 30,0 0,064 -28,6 0,183 TNF-a - 5,6 0,502 -9,3 0,544 -2,9 0,759 РЭА -45,0* 0,044 -24,1 0,622 - 11,1 0,844 INF 0,0 1,000 -9,2 0,645 4,5 0,856 Примечание. * - значимые результаты. Результаты анализа совокупности коэффициентов динамики показали, что поскольку для Т-хелперов (CD4 + ) и цитотоксических лимфоцитов (CD8 + ) получены значимые результаты, можно утверждать, что активный шеддинг возникает на фоне повышенной активности дифференциации иммунокомпетентных клеток в тот момент, когда клетка становится зрелой. Доказательством тому, что в период пролифера-тивных явлений активизация не связана с шеддингом, является тот факт, что маркеры активизации CD25+, CD71+, HLADR+ не ассоциированы с повышенным содержанием свободных рецепторов. Для указанных показателей значения коэффициентов прироста являются отрицательными. Анализ коэффициентов показал также, что шеддинг связан с активной дифференцировкой натуральных киллеров (CD16+). Низкие значения анализируемых коэффициентов установлены для рецептора CD95+, это можно объяснить тем, что апоптозу не подвергаются клетки, освободившиеся в процессе выполнения своей функции от ненужных рецепторных субстанций. Можно предположить, что торможению шеддинга будет способствовать активизация апоптоза этих клеток. В пользу этого предположения свидетельствуют данные появления отрицательных коэффициентов прироста между уровнем свободных рецепторов и количеством клеток, меченых к апоптозу. Отмечена достаточно сильная взаимосвязь шеддинга с увеличением содержания в межклеточном пространстве IL-1 и IL-10. При росте содержания сывороточной формы sCD23 увеличивается процент активных фагоцитов (%АФ), необходимых для утилизации (клиренса) рецепторов и циркулирующих иммунных комплексов. Увеличение интенсивности фагоцитоза в период максимальных концентраций свободных рецепторов объясняется необходимостью в срочном порядке препятствовать накоплению ненужных субстанций в сыворотке крови. Дальнейшее повышение содержания sCD23 снижает концентрации IgE путем образования комплексов CD23 - IgE. Далее была проанализирована динамика изменения параметров иммунологической реактивности в зависимости от соотношения уровней мембранной и растворимой форм рецептора CD80+. В табл. 2 представлены данные о содержании мембранных и растворимых форм рецептора CD80+, а также иммунологических параметров иммунного фона. Как и в отношении рецептора CD23+, подтверждается закономерность о том, что активный шеддинг костимулирующих молекул осуществляется дифференцированными иммунокомпетентными клетками (CD4 + , CD8 + ). Отмечены, кроме того, высокие коэффициенты прироста и для уровней натуральных киллеров CD16+, содержание которых сочетается с активным шеддингом. Следует отметить, что в данной ситуации не подтверждается взаимосвязь повышения интенсивности фагоцитоза и содержания внеклеточных рецепторов. Наиболее тесная взаимосвязь дифференцировки В-лимфоцитов выявлена с экспрессией CD71+, что объясняет, вероятно, энергетическую зависимость указанного процесса. Велик уровень значений коэффициента прироста для CD95+, который значительно выше по сравнению с таковым у Т-лимфоцитов, что свидетельствует о более активном процессе апоптоза В-клеток по сравнению с Т-клетками. 31 Экологическая физиология Экология человека 2016.11 Таблица 2 Оценка средних темпов изменения уровней (в %) иммунологических показателей в процессе сброса рецептора mCD80 с клетки между выделенными группами Показатель 1-2 этап шед-динга р между группами 1 и 2 2-3 этап шеддинга р между группами 2 и 3 CD4+ 30,8 0,356 72,6* 0,050 CD8+ 10,8 0,732 156,1* 0,003 CD10 + 46,4* 0,044 65,9* 0,001 CD22 + 51,7* 0,035 47,7* 0,047 CD16+ 43,6* 0,012 64,9 * 0,050 CD25 + 77,8* 0,009 64,6* 0,005 CD71 + 184,4* <0,001 -29,7 0,062 CD95 + 148,6* 0,001 - 18,4 0,128 HLADR+ 85,7* 0,020 48,1* 0,007 IgE -2,18 0,959 43,2* 0,009 IgA 5,29 0,776 2,95 0,773 IL-1 81,4* 0,003 26,9 0,700 IL-6 -44,3* 0,039 70,5* <0,001 IL-10 -2,81 0,945 93,1* <0,001 %АФ - 1,10 0,951 2,47 0,920 ФЧ 22,2 0,680 13,1 0,675 TNF-a - 3,64 0,530 - 1,46 0,787 РЭА - 16,4 0,759 -23,9 0,534 INF-y 50,0* 0,007 - 17,1 0,355 mCD23 68,2* 0,005 35,1 0,150 sCD23 40,9* 0,004 -31,2 0,251 Примечание. * - значимые результаты. Отмечены высокие значения коэффициента прироста для ассоциации экспрессии mCD80+ и IL-1. В противоположность этому низкая взаимосвязь или её отсутствие регистрируются относительно концентрации провоспалительных цитокинов. На наш взгляд, эти различия объясняются тем, что индукция антителообразования зависит от неспецифического регуляторного цитокина IL-1 ß, секретируемого анти-генпредставляющими клетками и моноцитами. Обсуждение результатов Молекула CD23 (FceRII) - низкоаффинный рецептор лектинового типа для Ig Е, появляется на зрелых активированных В-лимфоцитах, моноцитах, макрофагах и эозинофилах, играет важную роль в дифференцировке B-лимфоцитов. Известно две формы низкоаффинного рецептора для IgE - CD23a и CD23b, которые отличаются друг от друга несколькими аминокислотными остатками цитоплазматического домена, а внеклеточные домены являются идентичными [9]. Особенным свойством этого белка является способность к аутопротеолитическому перевариванию, за счет которого рецептор распадается на растворимые фрагменты с молекулярной массой 37; 33; 25-27 и 12 кБ, обладающие способностью (за исключением последнего) связывать IgE [3]. Согласно общепринятым взглядам, рецептор CD23, представляющий собой низкоаффинный рецептор к Fc, ранее отождествлялся исключительно с атопией. Вполне вероятно, что CD23 выполняет различные функции и спектр участия этой молекулы в иммунологически опосредованных реакциях может быть шире, чем сейчас представляется. В проведенных нами ранее исследованиях [7, 10] были получены сведения о том, что процессы пролиферации и шеддинг происходят одновременно. Настоящее исследование позволяет утверждать, что имеется временная разница, необходимая для диффе-ренцировки и начала шеддинга, это подтверждается появлением отрицательного знака коэффициентов прироста для таких показателей, как CD25+, CD71 + , HLADR+ при шеддинге молекулы CD23+. Кроме того, не наблюдается зависимости между уровнем шеддинга CD23+, CD80+ и повышением уровней естественных митогенов (РЭА), что ещё раз подтверждает отсутствие взаимосвязи активного сброса рецепторов с клетки с её пролиферацией. Дополнительным подтверждением того, что сбрасывание рецепторов происходит зрелыми дифференцированными клетками, является смена знака коэффициентов прироста на отрицательные для соотношения свободных рецепторов и содержания CD4+ и CD8+. Кроме того, сложно себе представить, что в период пролиферации и активизации клетки, когда она ещё не дифференцирована по своим функциям, происходит шеддинг. Мы полагаем, что шеддинг, по крайней мере, изучаемых рецепторов осуществляется дифференцированными клетками, в том числе CD4+ и CD8+. Сбрасываются, по всей видимости, рецепторы, которые прекращают развитие иммунной реакции. Шеддинг рецептора к Fc-фрагментам IgE тормозит иммунную реакцию, связанную с клеточно-опосредованной и антителозависимой цитотоксичностью. Участие в шеддинге натуральных киллеров может быть объяснено со следующих позиций: имея на своей поверхности рецепторы к Fc-фрагментам Ig, натуральные киллеры могут сбрасывать их в свободное межклеточное пространство; в то же время натуральные киллеры могут участвовать в процессе шеддинга рецепторов с дифференцированных имму-нокомпетентных клеток. При усиленном шеддинге и возрастании доли активных фагоцитов может наступать сокращение резервных возможностей повышения количества фагоцитирующих клеток в результате недостаточности энергетического ресурса. Компенсаторная реакция увеличения интенсивности фагоцитоза, с одной стороны, увеличивает клиренс свободных рецепторов в межклеточном пространстве, с другой - может явиться критерием недостаточности энергетического потенциала. Отрицательные коэффициенты свидетельствуют о накоплении свободных веществ и рецепторов в межклеточном пространстве. Имеется ещё одно объяснение снижения доли 32 Экология человека 2016.11 Экологическая физиология активных фагоцитов при увеличении концентрации свободных рецепторов. Дело в том, что фагоцитоз является энергозатратным механизмом защиты, поэтому используется в исключительных случаях [4, 5]. Гораздо более экономично и более выгодно с этих позиций удаление из сыворотки крови и межклеточного пространства свободных рецепторов путем адсорбции с помощью системы комплемента на клеточных мембранах эритроцитов, тромбоцитов, моноцитов, гранулоцитов. CD80 входят в суперсемейство иммуноглобулинов, кодируются различными генами и экспрессируются дендритными клетками, активированными макрофагами, гранулоцитами, В- и Т-клетками [14]. CD80 обеспечивают костимулирующий сигнал с CD28 или CTLA4 (cytotoxic T-lymphocyte antigen 4; CD 152) на T-клетках. Соединение Т-клеточного рецептора CD28+ с CD80+ (или CD86+) приводит к активации, дифференцировке и миграции Т-лимфоцитов в ткани T-клеток [15]. Высокий коэффициент динамики взаимодействия шеддинга CD80+ и активности Т-цитотоксических лимфоцитов (CD8+) указывает на участие последних в ингибиции антителообразования путем лимфоцито-токсичности. Натуральные киллеры осуществляют гибель В-лимфоцитов в меньшей степени, практически одинаково и в период активного антителообразования, и после шеддинга кластеров дифференцировки. Таким образом, можно считать, что накопление sCD80 взаимосвязано со снижением эффективности представления антигенов антителопредставляющей клеткой, торможением клеточно-опосредованной цитотоксичности и активизации апоптоза В-лимфоцитов. Высокий коэффициент активности шеддинга mCD80+ и mCD23+ с содержанием цитокинов IL-1, IL-6 и IL-10 в межклеточной среде является отражением регуляции биологических процессов по типу обратной связи: увеличение концентрации рецепторов в межклеточной среде посредством цитокинов блокирует экспрессию рецепторов клетки. Другими словами, можно говорить о влиянии внеклеточных IL-1, IL-6, IL-10 на биологическую активность клетки. По всей вероятности, увеличение темпов прироста IL-1 отражает взаимосвязь реакций активизации иммуно-компетентных клеток с адаптивным иммунитетом про-тективных реакций воспаления. Известно, что IL-10 ингибирует экспрессию антигенов Главного комплекса гистосовместимости и костимулирующих молекул, ми-тогениндуцированную пролиферацию Т-хелперов, но усиливает пролиферацию В-лимфоцитов [13]. Может быть, это зависит от снижения содержания в крови нормальных киллеров и фагоцитарной активности посредством IL-10. Сочетание активного шеддинга и концентрации сывороточного IL-6 может быть обусловлено особенностью влияния этого цитокина на кластеры дифференцировки в отличие от рецепторов к Fc-иммуноглобулину. Таким образом, шеддинг дифференцировочных антигенов CD23 и CD80 не связан напрямую с процессами активизации и пролиферации, отражает непосредственную взаимосвязь с дифференцированными клетками (CD4 + , CD8+, CD16+, CD22+), с которых происходит сброс клеточных рецепторов.

About the authors

O E Karyakina

Institute of Environmental Physiology, Federal Center for Integrated Arctic Research, Russian Academy of Sciences

Email: novogil@mail.ru
Arkhangelsk, Russia

L K Dobrodeeva

Institute of Environmental Physiology, Federal Center for Integrated Arctic Research, Russian Academy of Sciences

Arkhangelsk, Russia

References

Supplementary files