ACTOPROTECTIVE ACTIVITY OF COMPLEX BIOLOGICS BASED ON LICHENS THALLI AND RHODIOLA ROSEA

Full Text

Известно, что ежегодные потери здравоохранения в мире вследствие низкой биодоступности и токсичности действующих веществ (ДВ) различных лекарственных препаратов составляют более 65 млрд долларов [10]. Процесс создания новых лекарств, биопрепаратов является длительным и требует больших финансовых вложений - именно поэтому актуальным является поиск путей повышения эффективности уже существующих действующих веществ. Одним из способов повышения биодоступности и, как следствие, терапевтической эффективности ДВ при снижении его дозы является получение высокоэффективных комплексов «носитель: ДВ», где активный носитель повышает биоусвояемость действующего вещества при снижении дозы и наряду с этим обладает детоксикационной активностью. Носители (подложки) востребованы в группах различных препаратов для лечения социально значимых заболеваний (заболевания сердечно-сосудистой системы, онкологические заболевания, вирусные гепатиты, туберкулез, сахарный диабет). Например, при создании комплексных противомикробных препаратов (антибиотики, противогрибковые средства и т. п.). Причины востребованности - широкая распространенность инфекционных заболеваний, возникновение побочных эффектов при лечении, развитие резистентности к препаратам. Кроме того, носитель, повышающий терапевтическую эффективность ДВ, может быть востребован в группах витаминных и витаминно-микроэлементных препаратов, иммуномодуляторов, адаптогенов и т. п. по причине низкой усвояемости ДВ, входящих в состав указан 46 Экология человека 2015.05 Экологическая физиология ных препаратов. Также одна из групп препаратов, где будет востребован носитель, это препараты, имеющие выраженное побочное действие (например, цитостатические средства в онкологии), что позволит за счет подложки одновременно проводить детоксикацию организма, а повышение биоусвояемости ДВ позволит уменьшить терапевтически эффективную дозу. Создание новых комплексных препаратов позволит улучшить качество жизни пациентов из перечисленных групп, уменьшить их инвалидизацию и государственные расходы на лечение социально значимых заболеваний. Для создания носителей (подложек) медицинского назначения необходимо привлекать как новые сырьевые источники, так и новые технологии их переработки. Теоретический анализ позволил нам предложить в качестве носителя лишайниковые β-олигосахариды, часть из которых содержит также аминогруппы, обладающие выраженной сорбционной активностью [3, 7]. При этом разрабатываемая в Северо-Восточном федеральном университете подложка обладает следующим набором свойств: • хорошая всасываемость в желудочно-кишечном тракте и проникновение через различного рода мембранные комплексы, т. е. ее бифильная биогенная структура максимально приближена к структуре определенных, прежде всего гликокаликсовых, элементов клеточных мембран; • высокая сорбционная способность по отношению к катионам тяжелых металлов и органическим соединениям, являющихся эндотоксинами - конечными продуктами обмена, интермедиатами воспалительных и аутоиммунных процессов (включая аллергические) и экзотоксинами, за счет большого числа слабых взаимодействий (не ковалентных связей), благодаря наличию в структуре полярных функциональных групп (ОН-, -NH2, -О- и других); • прочность структуры, не гидролизуемой и не окисляемой ферментами внутренних сред организма, так как определяется β-гликозидными связями; • комплексы, образуемые подложкой с сорбированными эндо- и/или экзотоксинами, хорошо выводятся из организма: в случае гидрофильной природы токсина - через почки с мочой; в случае гидрофобной природы токсина - желчным клиренсом. Кроме того, повышения базовых свойств ДВ можно достигнуть посредством его механохимического комплексообразования с предложенным носителем - лишайниковыми β-олигосахаридами [1]. Целью настоящей работы является изучение свойств носителя из таллома лишайников для твердых лекарственных форм и его комплекса с родиолой розовой. Методы В качестве объекта исследования как источника для расширения ассортимента носителей растительного происхождения, повышающего биодоступность ДВ и обладающего при этом детоксикационными свойствами, нами использовалось сырье для производства биологически активной добавки к пище (БАД) «Ягель порошкообразный ультрадисперсный» [2, 8], полученный ультратонкой механохимической активацией таллома лишайников рода Cladonia, предварительно грубоизмельченного до размера частиц 1-3 мм на высокоскоростном миксере грануляторе KMS-50 (Корея). Также исследовалась физиологически активная растительная композиция с повышенной фармакологической активностью адаптогенного действия, полученная нами на основе растительных субстанций, произрастающих в Якутии: слоевищ лишайников (Cladonia), корневищ родиолы розовой (Rhodiolarosea, сем. Crassulaceae), в массовом соотношении 10: 1 из сухого сырья без участия растворителей в одну технологическую стадию с использованием механохимических технологий в шаровых мельницах с центробежным ускорением мелющих тел в интервале 10-30 g [9]. Сорбционную активность подложки «Ягель порошкообразный ультрадисперсный» in vitro определяли по отношению к маркеру метиленовому синему, моделирующему средне- и низкомолекулярные токсины, и ионам Co2+, представляющему ионы тяжелых металлов, методом прямой спектрофотометрии по модифицированной методике ГОСТ 4453-74 на спектрометре с программным обеспечением LAMBDA 20 при длинах волн (X) 400 и 590 нм соответственно в кюветах толщиной поглощающего свет слоя 10 мм относительно дистиллированной воды. Модификация заключалась в дополнительном фильтровании на этапе центрифугирования, т. к. обычное центрифугирование не дает полного разделения фаз. Детоксикационные свойства носителя и физиологическую активность биокомплекса с родиолой розовой на его основе различной активации как грубого измельчения, так и механоактивированного определяли in vivo при пероральном введении мышам линии CD-1 (n = 15 в каждой группе). Животные контрольной группы получали растворитель (воду), остальные животные исследуемых групп получали биопрепарат из расчета 50 мг/кг зондовым введением в желудок. На 30-й день по 5 животных из каждой группы были подвергнуты эвтаназии с тотальным забором крови, на 45-й день оставшиеся экспериментальные животные также подвергнуты эвтаназии с тотальным забором крови для биохимического анализа на содержание токсина «усталости» - лактата. Оценка поведенческой активности животных проводилась с использованием тестов «Плавание» и «AutoTrack» согласно стандартным операционным процедурам на 30-й и 45-й день введения препарата [5]. Поведенческие тесты отличаются высокой нестабильностью экспериментального объекта, поэтому корректно провели фоновое исследование поведенческой активности, которое мы сделали за один 47 Экологическая физиология Экология человека 2015.05 день до начала введения, на основании полученных результатов провели формирование групп для снижения погрешности. Для всех данных применена описательная статистика. Для определения значимости межгрупповых различий данные проанализированы тестом MannWhitney (U-test) для непараметрических данных. Для данных с нормальным распределением межгрупповое сравнение проводили с использованием t-критерия Стьюдента (t-test) для множественного сравнения. Анализ выполнен для каждого пола отдельно. Статистическую обработку результатов исследования выполняли с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel 2010. Полученные данные обработаны статистически стандартными параметрическими методами с вычислением среднего арифметического (M), стандартного отклонения (SD), доверительного интервала по Стьюденту при критическом уровне значимости р = 0,05. Результаты представлены в виде M ± m, где M - среднее арифметическое значение, m - доверительный интервал. Результаты Лишайники из рода кладонии (Cladonia) - лекарственное растение, используемое в народной медицине для лечения многих заболеваний. В гифах лишайников обнаружен полисахарид лихенин, называемый еще лишайниковым крахмалом, количество которого доходит до 50 % на сухое вещество. При его гидролизе образуется 98-99 % D-глюкозы, остатки которой связаны в лихенине двояким образом - 73 % β-гликозидными связями между 1-м и 4-м и 27 % β-гликозидными связями между 1-м и 3-м углеродными атомами [3]. Синтез лихенина в лабораторных условиях еще не осуществлен. Организм человека лихенин не усваивает, северными оленями он усваивается благодаря гидролизу бактериями, находящимися в пищеварительном канале. β-полисахариды выстилают гифы лишайников, образуя трехмерную матрицу, в ячейках которой практически в «иммобилизованном» виде находятся другие биологически активные вещества (БАВ). Применение механохимической активации разрушает корковый слой, сформированный плотным сплетением грибных гиф, между которыми расположены клетки фикобионта, альгальная зона, гониди-альный слой, где и находится основная часть БАВ, например, широкий спектр метаболитов, обладающих антибактериальным действием [1, 3]. В результате такого биотехнологичного воздействия происходит разрушение части прочных β-гликозидных связей с получением β-олигосахаридных молекул и деиммобилизацией других групп лишайниковых БАВ [9]. Анализ водорастворимых углеводов по методу «восстанавливающих концов» в экстрактах слоевищ лишайников рода Cladonia после грубого измельчения либо механохимической активации подтвердил факт частичной декструкции β-гликозидных связей в лишайниковых β-полисахаридах с образованием β-олигосахаридных молекул при механохимической активации. Содержание легкогидролизуемых углеводов в пробах лишайника рода Cladonia увеличилось в 8 раз после его механоактивации и составило 33,48 мг/г сухого механоактивированного сырья и 4,61 мг/г сухого образца грубого помола на миксере KMS-50 до механоактивации. Сорбционная суточная емкость у образца «Ягель порошкообразный ультрадисперсный» составила 48,0 мг/г по органическому веществу на примере метиленового синего - аналога, в том числе эндотоксинов малой и средней молекулярной массы - интермедиатов воспалительных процессов любой этиологии, к которым, в частности, относятся токсины пептидно-белкового происхождения. Следует отметить, что это очень высокие показатели по сравнению с известными адсорбентами, такими как полифепан и глина белая, адсорбционная емкость которых по метиленовому синему составляет 10,0 и 11,4 мг/г соответственно [4, 6]. Скорость адсорбции также выше у механоакти-вированного препарата «Ягель порошкообразный ультрадисперсный»: в первые 20 минут адсорбция составила 92 % его суточной адсорбционной емкости, в отличие от ягеля грубого помола, где за этот же промежуток времени адсорбционная емкость была в 2 раза ниже, чем у механоактивированного образца и составила лишь 69 % суточной активности. Высокую сорбционную способность in vivo доказали на примере связывания «токсина усталости» - молочной кислоты (табл. 1), снижение уровня ее накопления в крови животных достигает 25 %. Таблица 1 Содержание лактата в крови животных Вводимый биопрепарат Лактат, ммоль/л 30 день 45 день Контроль 11,2+0,4 13,9±0,7 Порошок ягеля грубого помола 9,2±0,5 12,6±0,7 Ягель порошкообразный ультрадисперсный 8,4±0,4 11,4±1,3 Обсуждение результатов Анализ результатов в тесте «Плавание» экспериментальных животных выявил статистически значимое увеличение времени плавания в 3 и 4 раза на 30-е и 45-е сутки соответственно в группе, получавшей биокомплекс «ягель: родиола» механоактивированный относительно остальных исследуемых групп (рис. 1). Что свидетельствует об адаптогенных пролонгированных во времени свойствах биокомплекса в условиях повышенных физических нагрузок. На 30-е сутки исследования небольшое увеличение времени плавания проявилось и у группы животных, принимавших смесь «ягель: родиола», что можно объяснить низкой биодоступностью ДВ лекарственного растения. Наблюдения в тесте «AutoTrack» были разделены на две группы: «Двигательная активность» - прой 48 Экология человека 2015.05 Экологическая физиология Рис. 1. Динамика изменения времени плавания животных денное расстояние (рис. 2) и «Исследовательская активность» - количество стоек (табл. 2). Таблица 2 Исследовательская активность (количество стоек) животных Контроль № 1 (n=15) Родиола розовая официальная -контроль № 2 (n=15) Родиола и ягель в пропорции 1:10 День Смесь грубо-измельченная (n=15) Биокомплекс механоактивированный (n=15) 0 24,5±2,1 17,3±2,5 24,8±1,2 26,8±3,5 30 25,5±2,8 21,7±3,8 23,6±2,7 28,8±1,5 45 18,7±1,3 12,5±3,0 22,2±3,5 36,2±3,2 Физическая работоспособность в тесте «Двигательная активность» определялась путем выполнения предельной нагрузки. Предельной нагрузкой считался «бег до отказа», показателем отказа являлась неспособность животного продолжать бег против движущейся ленты, несмотря на электростимуляцию. Вся совокупность «AutoTrack» тестов характеризу ет целостное поведение, оценивающее действие на центральную нервную систему. Анализ результатов показал, что на 45-й день тестирования в группе, получавших биокомплекс «ягель: родиола», обнаружено статистически значимое увеличение двигательной активности в 2,5 раза относительно всех тестируемых групп. Важным показателем в исследовательской активности (эмоционально-стрессорная переносимость) является параметр «количество стоек» в тесте «AutoTrack». Количество стоек характеризует изменения эмоционально-стрессорного состояния экспериментального объекта. Увеличение параметра указывает на большую социальную заинтересованность объекта, адаптивность к окружающим объектам, увеличение поисковой активности. Снижение показателя - противоположный результат, скованность, низкая адаптация к условиям окружающей среды. Эти данные согласуются с классическими представлениями о том, что поисковая активность способствует успешному выходу из стрессовой ситуации. Родиола розовая 10 день □ 30 день Рис. 2. Динамика изменения двигательной активности животных 49 Экологическая физиология Экология человека 2015.05 Исследование выявило, что в контрольной группе есть тенденция к уменьшению количества стоек на 45-й день исследования. В группе, принимавшей чистый препарат родиола розовая можно увидеть увеличение количества стоек на 30-й день исследования с последующим их снижением к 45-му дню. Что можно объяснить повышением адаптивного потенциала на короткий срок с последующей истощенностью ресурсов организма. В группе, принимавшей смесь «ягель: родиола» заметна небольшая тенденция к снижению результатов на 30-й и последующий 45-й день. Анализ результатов показал, что на 30-й и 45-й день тестирования в группе, получавшей биокомплекс «ягель: родиола», обнаружено статистически значимое увеличение исследовательской активности относительно остальных исследуемых групп. На наш взгляд, объяснением физиологической активности биопрепарата может служить эффект комплексообразования ДВ (например, салидро-зида родиолы розовой) с активным наполнителем (рис. 3). В нашем случае спектр фармакологической активности наполнителя дополнен детоксикационной функцией, будучи активным сорбентом, он одновременно элиминирует из организма «токсин усталости» - молочную кислоту (см. табл. 1). Рис. 3. Схема межмолекулярных взаимодействий салидрозида и β-олигосахарида Присутствие природных БАВ (лишайниковые кислоты мягкого антибактериального действия, витамины, микроэлементы) в результате деиммобилизации из β-полисахаридного каркаса не ухудшает его сорбционных и комплексообразующих качеств. Вместе с тем они придают ему дополнительные лечебно-профилактические свойства. Бактерицидное действие лишайниковых кислот также способствует формированию здоровой микрофлоры за счет лизиса патогенных и условно-патогенных бактериальных клеток и сорбции (выведения из организма) продуктов их жизнедеятельности. Известно, что лихестериновая кислота и ее производные активны в отношении различных видов стафилококка. Протолихестериновая кислота в опытах in vitro обладала ингибирующим действием на 5-липоксигеназу. Эта активность была изучена на культуре клеток человека, включающих три злокачественных клеточных штамма в сравнении с нормальными фибробластами кожи и периферическими кровяными лимфоцитами. Протолихестериновая кислота вызывала значительное снижение синтеза ДНК во всех трех злокачественных штаммах. Средняя эффективная доза составила от 1,1 до 24,6 мкг/мл. Напротив, синтез ДНК, пролиферация и выживаемость нормальных фибробластов кожи не подвергались действию в дозах до 20 мкг/ мл. Имеются сведения о действии этой кислоты в опытах in vitro в отношении Helicobacterpylori. Минимальная ингибирующая концентрация лежит в пределах 16-64 мкг/мл [7]. Доказано, что биопрепараты на основе лишайникового сырья, основным активным веществом которых являются лишайниковые амино^-олигосахариды, обладают выраженной адсорбционной и детоксикаци-онной активностью по отношению к средне- и низкомолекулярным токсинам и солям тяжелых металлов. Твердофазный биокомплекс, полученный механохимической активацией растительных субстанций: слоевищ лишайников (Cladonia) и корней, корневищ родиолы розовой (Rhodiolarosea, сем. Crassulaceae) в массовом соотношении 10: 1, обладает повышенным в 2,5-3 раза адаптогенным действием при снижении дозы лекарственного растения в 10 раз за счет эффекта комплексообразования ДВ и деток-сикационной функции наполнителя - элиминации молочной кислоты. Созданный механохимический биокомплекс может быть использован в качестве лечебно-профилактического средства для повышения физической активности, выносливости, ускорения восстановления после физической нагрузки людей, ведущих активный образ жизни или проживающих в неблагоприятных экологических условиях.

About the authors

V V Anshakova

Email: anshakova_v@mail.ru

A V Stepanova

D M Uvarov

A Sh Smagulova

K N Naumova

P P Vasilev

B M Kershengolts

References

Supplementary files