COMPARATIVE CHARACTERISTICS OF BIOLOGICAL PROPERTIES OF S. AUREUS ISOLATED FROM HUMANS AND BIRDS

Full Text

Стафилококки являются одними из самых распространенных микроорганизмов. Они могут быть причиной различных заболеваний человека, начиная от банальных гнойничковых процессов и заканчивая инфекциями, связанными с оказанием медицинской помощи. Эти микроорганизмы, и прежде всего S. aureus, издавна служат объектом изучения различных исследований. Как следствие их биологические свойства, в том числе и факторы патогенности, описаны достаточно полно. В то же время биологические свойства S. aureus, колонизирующих птиц, изучены недостаточно. Тем не менее, по данным Andrea T. Febler et al. [5], различные виды стафило кокков широко циркулируют в условиях птицефабрики. Инфицированность метициллинрезистентными S. aureus выявлена в 25 % проб куриного мяса. Об особенностях колонизации и выживания стафилококков на всех этапах переработки мяса птицы сообщают Geert Huys et al. [6]. Представляется, что в условиях птицефабрики штаммы, изолированные от птиц, обладающие набором факторов вирулентности, могут инфицировать человека. Цель настоящей работы - изучение в сравнительном аспекте биологических свойств S. aureus, изолированных от кур и сотрудников птицефабрики. Задачи исследования: определение частоты встреча 52 Экология человека 2015.05 Эндоэкология емости S. aureus у сотрудников птицефабрик и птиц; определение частоты бактерионосительства S. aureus у практически здоровых лиц, не связанных в своей профессиональной деятельности с птицами; изучение в сравнительном аспекте основных биологических свойств штаммов S. aureus, изолированных от сотрудников птицефабрики, птиц и бактерионосителей. Методы Проведено бактериологическое обследование на стафилококковое бактерионосительство 47 сотрудников птицефабрики (группа изучения), непосредственно контактирующих с птицей, и 29 практически здоровых студентов Пермского медицинского университета (группа сравнения). Материал забирали стерильными ватными тампонами со слизистых носа и зева, исследовали также смывы с рук всех обследуемых лиц. Исследование проводили в соответствии со стандартами Хельсинкской декларации 1975 года и ее пересмотра 1983-го с положительным заключением комитета по этике при ГБОУ ВПО «Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера» (ПГМУ). Выполнено также бактериологическое исследование 153 образцов внутренних органов птиц: печени, сердца, селезенки, легких. Материал получали от бройлеров различных возрастов (от 2 до 45 суток) в процессе санитарного забоя. Посевы осуществляли традиционным методом с использованием желточно-солевого агара в соответствии с Приказом МЗ СССР № 535 [3]. Выделенные культуры стафилококков идентифицировали главным образом на основании изучения биохимических свойств, используя « Staphytest 24» (ERBA LACHEMA, Чехия). Оценку результатов осуществляли с помощью компьютерной программы «Микроб-2». Для изучения биологических свойств в исследование включены все выделенные штаммы S. aureus независимо от источника. Гемолитическую активность выделенных культур определяли на кровяном агаре, лецитовителлазную (ЛВ) - на желточно-солевом [3]. Изучение ДНК-азной активности проводили на DNAse Test Agar, производства Испании, в соответствии с инструкцией производителя. Биопленкообразующую способность штаммов S. aureus изучали в 96-луночных полистироловых планшетах для иммуноферментного анализа (Мед-полимер, Россия). В 6 лунок каждого ряда планшета вносили по 100 мкл инокулума определенного штамма S. aureus, содержащего 107 КОЕ/мл, после чего планшеты инкубировали в течение 24 часов в термостате (37 °С). Через сутки планктонную культуру из всех лунок удаляли, биопленки дважды аккуратно промывали 10 мМ фосфатным буфером (рН 7,2), затем окрашивали 0,1 % раствором генцианвиолета с последующей спиртовой экстракцией связавшегося красителя для оценки общей биомассы образовавшихся пленок. Детекцию окрашенных экстрактов биопленок осуществляли на ридере Benchmark Plus (BioRad, США) при длине волны 570 нм (O'Toole G., 2011). Антибиотикочувствительность изолированных штаммов определяли диско-диффузионным методом в соответствии с МУК 2004 года [2]. В качестве тестируемых использовали препараты, рекомендованные МУК для определения антибиотикочувствительности стафилококков, а также с учетом частоты их применения в лечебной практике и на предприятиях птицепрома: бета-лактамные препараты (оксациллин, цефокситин), тетрациклины (доксициклин), фторхино-лоны (левофлоксацин), аминогликозиды (амикацин), линкозамиды (линкомицин). Фаготипирование осуществляли с помощью международного набора «Стафилококковые бактериофаги типовые диагностические сухие» (набор «Ч»), производства Медгамал (филиал ГУ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН) в соответствии с прилагаемой инструкцией. Определение эковариантов S. aureus проводили на среде с кристаллическим фиолетовым [1]. Для статистической обработки полученных данных использовали программу Statistica 6.0. Если количественные данные подчинялись закону нормального распределения, то рассчитывали среднее арифметическое значение признака (М), а также стандартное отклонение (SD) и выражали в виде M ± SD. Сравнивание бинарных признаков осуществляли с помощью точного критерия Фишера однонаправленного (р) при построении четырехпольной таблицы сопряженности. В случае, если распределение признака по критерию Шапиро - Уилкса не было нормальным, сравнение величин полученных значений проводили с помощью критерия Манна - Уитни (р). О статистически значимых различиях полученных результатов в сравниваемых группах судили по величине цифровых значений р. Критическим уровнем значимости принимался в данном исследовании 0,05. Результаты В результате бактериологического исследования 141 пробы биологического материала от сотрудников, 87 - от студентов и 612 образцов патматериала птиц всего было выделено 40 штаммов S. aureus, в том числе 10 от сотрудников, 13 от студентов (бактерионосителей) и 17 от птиц. В серии специальных наблюдений изучены факторы вирулентности всех изолированных штаммов S. aureus (табл. 1). Независимо от источника выделения изоляты обладали определенным набором факторов вирулентности. Практически все штаммы, изолированные от студентов, проявляли гемолитическую и ДНК-азную активности. Штаммы S. aueus, выделенные от сотрудников, и особенно от птиц, реже обусловливали гемолиз. Последние статистически значимо чаще обладали лецитовителлазной активностью. Большинство 53 Эндоэкология Экология человека 2015.05 Таблица 1 Факторы вирулентности штаммов S. aureus, выделенных из различных источников Источник (количество штаммов) Частота встречаемости признака Гемолитическая активность ЛВ активность ДНК-азная активность Абс. (%) р Абс. (%) р Абс. (%) р Птицы (n = 17) 5 (29,41 ± 7,13) - 14 (82,35 ± 19,92) - 14 (82,35 ± 19,92) - Сотрудники 6 0,121 4 0,032 8 0,612 (n = 10) (60,00 ± 16,04) (40,00 ± 10,69) (80,00 ± 21,38) Студенты 12 <0,001 5 0,024 12 0,432 (n = 13) (92,31 ± 25,60) (38,46 ± 10,67) (92,31 ± 25,60) Примечание. р - значимость различий со штаммами S. aureus, выделенными от птиц. изолированных штаммов, независимо от источника получения, характеризовались наличием ДНК-азы. В качестве одного из факторов персистенции исследовали биопленкообразующую способность стафилококков. Образование биопленок регистрировали у всех 40 штаммов S. aureus (табл. 2). Таблица 2 Биопленкообразование штаммов S. aureus, выделенных из различных источников Источник (количество штаммов) Средние значения толщины биопленки, единицы оптической плотности р Птицы (n= 17) 0,525±0,127 - Сотрудники (n = 10) 0,517±0,164 0,844 Студенты (n = 13) 0,416±0,034 0,171 Примечание. р - значимость различий со штаммами S. aureus, выделенными от птиц. Спектр полученных значений у разных штаммов S. aureus варьировал в широких пределах от 0,167 до 0,994. При сопоставлении средних значений толщины биопленки установлено, что они были более выражены у «птичьих» штаммов S. aureus, однако различия между степенью выраженности биопленки штаммов из различных источников не были статистически значимы. Изучена антибиотикочувствительность изолированных культур S. aureus (рисунок). Независимо от источника выделения все штаммы были чувствительны к бета-лактамным антибиотикам, а также к аминогликозидам (амикацин). В то же время если все культуры, изолированные от сотрудников и студентов были чувствительны к фторхинолонам (левофлоксацин), то (10,00 ± 0,54) % штаммов птиц были к ним резистентны. Аналогичная закономерность выявлена в отношении чувствительности к тетрациклинам (доксициклин). Отмечен также высокий удельный вес резистентных штаммов S. aureus к линкозамидам, а именно к лин-комицину (90,00 ± 4,87) % «птичьих» и (40,00 ± 3,27) % от сотрудников, тогда как все культуры S. aureus, выделенные от бактерионосителей, были к нему чувствительны. Проведено фаготипирование выделенных штаммов S. aureus (табл. 3). Из представленных данных следует, что практически 65 % культур птиц не были чувствительны к действию бактериофага, тогда как подавляющее число штаммов, изолированных от бактерионосителей, лизировались данными бактериофагами (II фа-гогруппа). Среди штаммов S. aureus, выделенных от птиц и от сотрудников птицефабрики, преобладали I и III фагогруппы. При этом чаще регистрировали I фагогруппу (30 % штаммов от сотрудников, 30 % «птичьих»). Распределение штаммов S. aureus, выделенных из различных источников, по чувствительности к анализируемым антибактериальным препаратам 54 Экология человека 2015.05 Эндоэкология Таблица 3 Распределение штаммов S. aureus, выделенных из различных источников, по фагогруппам Источники S. aureus, количество штаммов Фагогруппа Птицы (n = 17) Сотрудники (n = 10) Студенты (n = 13) Абс % Абс % Абс % I 5 29,41 ± 7,13 3 30,00 ± 9,49 1 7,69 ± 2,13 II - - - - 9 ± 0 32 ,2 9, 91 6 III 1 5,88 ± 1,43 2 20,00 ± 6,32 2 15,38 ± 4,27 IV - - - - - - Нетипируемые 11 64,71 ± 15,69 5 50,00 ± 15,81 1 7,29 ± 2,13 В последующем определены эковарианты изолированных культур S. aureus. За основу были взяты результаты изучения гемолитической активности, способности коагулировать цитратную плазму кролика, отношение к бактериофагам и типы колоний на среде с кристаллическим фиолетовым (табл. 4). Таблица 4 Эковарианты штаммов S. aureus, выделенных из различных источников Источники S. aureus, количество штаммов Экова риант Птицы (П = 17) Сотрудники (n = 10) Студенты (n = 13) Абс. % Абс. % Абс. % A 6 35,29 ± 8,56 5 50,00 ± 15,81 9 69,23 ± 19,20 B 9 52,94 ± 12,84 5 50,00 ± 15,81 - - C - - - - - - D 2 11,76 ± 2,85 - - - Прочие - - - - 4 30,77 ± 4,87 Как можно было ожидать, практически все штаммы, изолированные от бактерионосителей, относились к биотипу А («человеческий»); 50 % штаммов аналогичного типа было изолировано от сотрудников. Следует отметить, что более трети штаммов S. aureus, выделенных от птиц, также относились к этому биотипу. Более половины изолятов птиц принадлежали к эковарианту В («куриный»). К этому же эковарианту было отнесено и 50 % штаммов, изолированных от сотрудников. Обсуждение результатов Как уже указывалось, от сотрудников птицефабрики из различных локусов, главным образом полости носа и зева, было изолировано 10 штаммов S. aureus (инфицированность 21,3 %). Среди 29 практически здоровых лиц (студентов ПГМУ) выявлено 13 (инфицированность 44,8 %). Пробы внутренних органов кур были контамини-рованы S. aureus в 11,1 % случаев. Сравнительная характеристика основных факторов вирулентности у изолированных культур показала, что все изученные штаммы обладали этими свойствами. В то же время не было выявлено четких закономерностей в отношении наличия тех или иных факторов вирулентности в зависимости от источника получения S. aureus. Что касается биопленкообразования, то, по существу, все изученные штаммы обладали этим признаком, причем различия между степенью его выраженности у штаммов, изолированных из различных источников, не были статистически значимы. При изучении антибиотикочувствительности обнаружено, что большинство изолятов S. aureus, выделенных от сотрудников и птиц, по своей анти-биотикограмме были близки друг к другу. На резистентность этих штаммов, особенно «птичьих», существенно влияло их перманентное использование в условиях птицефабрики. Так, линкомицин, к которому отмечена наибольшая устойчивость, входит в состав комбинированных препаратов, применяемых в птицеводстве (в частности, «Акваприм»). Полученные данные отражают причину формирования резистентности «птичьих» штаммов к данным антибактериальным препаратам. Следует также отметить, что у отдельных штаммов S. aureus, выделенных от сотрудников, регистрировали аналогичную антибио-тикорезистентность, что свидетельствует о возможной контаминации сотрудников «птичьими» штаммами S. aureus. Штаммы S. aureus, изолированные от бактерионосителей, были чувствительны к действию бактериофагов II группы. В то же время штаммы, изолированные от птиц, в основном были чувствительны к иным бактериофагам (I и III фагогруппы). К этим же группам бактериофагов была чувствительна часть штаммов, изолированных от сотрудников. В этой связи следует подчеркнуть, что использованный набор бактериофагов предназначен для типирования стафилококков, колонизирующих человека. Часть штаммов, как и следовало ожидать, были не чувствительны к действию данных бактериофагов. В заключение были определены эковарианты выделенных штаммов S. aureus. Практически все изо-ляты от бактерионосителей отнесены к эковарианту А («человеческий»). К этому же эковару были отнесены и 35 % штаммов от птиц, тогда как их большая часть принадлежала к биовару В («куриный»). Среди штаммов, изолированных от сотрудников птицефабрики, встречались как эковариант А, так и эковариант В. Следовательно, анализ изученных биологических свойств выделенных культур S. aureus, а также их антибиотикочувствительности, определение фаголи-забельности и эковариантов показал, что в условиях птицефабрики между сотрудниками и птицами происходит обмен штаммами S. aureus. Наличие ряда факторов вирулентности у «птичьих» культур может представлять потенциальную угрозу для здоровья сотрудников. Особый интерес представляют данные, 55 Эндоэкология Экология человека 2015.05 указывающие на наличие у птиц штаммов, по своим характеристикам близких к штаммам человека.

About the authors

E M Gordina

Email: kate_alex.07@mail.ru

E S Gorovitz

References

Supplementary files