EFFECT OF PHYTONCIDIN (GARLIC PREPARATION) ON CELLS OF MICE KIDNEY TISSUE IN CULTIVATION IN VITRO

Full Text

Повышение эффективности лечения воспалительных заболеваний пародонта является одной из актуальных проблем современной стоматологии [3, 5, 15]. Известно, что данные заболевания протекают с хроническим воспалительным компонентом, при этом важное место в комплексном патогенетическом лечении гингивита занимают антисептические, противовоспалительные и иммунокорригирующие средства [6, 7]. Однако в ходе использования этих препаратов возможно снижение иммунобиологической реактивности организма, возникновение аллергических реакций и других побочных эффектов [2, 16]. Поэтому заслуживают внимания лекарственные средства растительного происхождения, способствующие усилению общей неспецифической иммунорезистентности организма, не дающие выраженных побочных эффектов [1, 8]. Следует отметить, что среди лекарств растительного происхождения особое место занимают препараты из чеснока, в частности фитонцидин. Он имеет ряд преимуществ: не токсичен, не вызывает аллергии, не вступает во взаимодействие с другими препаратами и может с ними сочетаться [14]. Особый интерес представляют его антисептические свойства, модулирующее влияние на систему иммуноструктурного гомеостаза и повышение общей неспецифической резистентности организма [4]. Производится фитонцидин Северным государственным медицинским университетом (г. Архангельск) в качестве биологически активной добавки, автор способа изготовления фитонцидина М. Я. Спивак (патент РФ на изобретение № 2053787). Фитонцидин представляет собой водорастворимую фракцию чеснока, не содержит примесей и консервантов. В нем сохранены антимикробные, противовоспалительные, противоатеросклеротические и другие целебные свойства чеснока. Механизм действия фитонцидина изучен недостаточно, в частности, отсутствует углубленное исследование его воздействия на клетки организма. В связи с предполагаемым использованием фитонцидина для лечения тканей пародонта мы провели оценку его токсичности. Объектом исследования была культура тканей почек мышей как наиболее изученная и широко используемая для оценки токсических препаратов, поступающих в организм. Цель работы изучить особенности влияния различных концентраций фитонцидина на клетки ткани почек при культивировании in vitro, чтобы установить дозы его непосредственного действия на жизнеспособность клеток организма. Методы Брали стандартный раствор фитонцидина со сроком годности 6 месяцев и рН 6,6-7,0. Для оценки биологического действия препарата использовали ткани почек белых беспородных мышей весом 12-15 г. Из эксперимента животных выводили в соответствии с предусмотренными правилами экспериментальных исследований путем эвтаназии под глубоким эфирным наркозом. Почки грызунов извлекали и после удаления капсулы и фрагментов мозгового вещества измельчали ножницами в растворе Хенкса, содержащем по 200 ЕД пенициллина и стрептомицина. После этого фрагменты ткани переносили на перфорированные миллипоровые фильтры (Millipore, pore size: 0,22 ультрамикрона) диаметром 12 мм. Всего было размещено 63 микрофрагмента ткани диаметром 0,10—0,05 мм [9—13]. Культивирование эксплантированных на подложки микрофрагментов ткани осуществляли в одном миллилитре питательной среды 199 и 100 ЕД пенициллина и стрептомицина в стеклянных закрытых резиновыми пробками пробирках (объемом 20 мл), которые затем размещали в стационарном штативе под углом 3,5° относительно горизонта, находящемся в термостате при температуре 37,5 °С. Биологическое действие фитонцидина оценивали в двух сериях опытов. В первой серии при использовании эмбриональной сыворотки время культивирования составляло 6 дней, а во второй — без добавления сыворотки — 8 дней. Раствор вносили в среду 199 с помощью микродозатора (Hamilton Bonaduz AG) на весь срок культивирования. В первой серии опытов использовали концентрации фитонцидина 0,025, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 и 8,0 %. В опытах без сыворотки — 0,06, 0,25, 0,5, 1,0, 2,0 и 3,0 %. В контрольные и опытные пробы вносили по 0,03 мл раствора. После завершения культивирования миллипоровые фильтры с культурами промывали в физрастворе и фиксировали в смеси Буэна в течение минуты, промывали в двух 900 спиртах и окрашивали гематоксилином Караци (1 час) и эозином (30 сек.) Далее их промывали в этиловом спирте, обезвоживали, просветляли в ксилоле и на предметном стекле погружали в канадский бальзам, покрывая покровным стеклом (Canada Balsam, Schuchardt München). Влияние препарата на клетки оценивали по двум количественным параметрам роста культур: а) соотношению выросших клеточных колоний и исходного числа эксплантированных фрагментов ткани (в процентах); б) среднему размеру площадей зон роста культур, образовавшихся около первичных эксплантатов ткани за 5 дней культивирования. Эти зоны роста возникают в процессе культивирования как за счет миграции клеток из центрального эксплантата, так и за счет их деления в самой зоне. Полученные результаты сравнивали с контрольной пробой, куда фитонцидин не вносился. Площадь клеточной колонии определяли микрофотосьемкой культур (100х) и с помощью компьютерной программы [11]. Статистическую и графическую обработку результатов проводили с использованием пакетов прикладных программ Microsoft Ехсеї 2000 и Statistica 7. Для сопоставления значимости различия полученных результатов применяли непараметрический критерий Wilcoxone. Различия между сравниваемыми параметрами считали значимыми при уровне р < 0,05. Результаты В серии исследований было установлено выраженное влияние фитонцидина на культивируемые клетки ткани почек мышей при содержании его в питательной среде 1—8 % (рисунок). При концентрации препарата 0,5 % отмечается слабая тенденция к увеличению числа растущих культур. Выраженная (на 27 %) тенденция к уменьшению числа клеточных колоний наблюдалась при содержании фитонцидина в среде 1 %. Статистически значимое уменьшение (на 46 %, p = 0,051) числа выросших культур отмечалось при концентрации 2,5 %. Полное подавление способности клеток к образованию колоний, но с сохранением их миграции из микрофрагментов тканей почек в культуре было выявлено при 8 % содержания фитонцидина. Оценка влияния препарата на суммарную площадь зоны роста культур на фильтре при использовании сыворотки и культивирования микрофрагментов ткани почек в течение шести дней представлена в табл. 1. Изменение количества выросших культур при различном содержании фитонцидина в питательной среде, содержащей эмбриональную сыворотку Таблица 1 Влияние фитонцидина на размер площади зоны роста ткани почек на фильтре при культивировании в течение 6 дней в среде с использованием сыворотки Содержание фитонцидина 1 2 3 4 5 6 7 в среде, % Контроль 0,025 0,5 1,0 2,5 5,0 8,0 Количество исследований, n 116 87 41 39 85 114 62 М, мм 2 4,97 5,71 3,28 1,76 0,889 0,347 0,049 p p1 p1-2 = 0,004 p1-3 = 0,882 p1-4 =0,001 p1-5 =0,001 p 1—6 =0,001 p1-7 = 0,001 Примечание для табл. 1, 2. М — средняя величина зоны роста клеточной колонии при данной концентрации фитонцидина. 18 Экология человека 2013.09 Экологическая морфология Таблица 2 Влияние фитонцидина на средний размер площади зоны роста ткани почек на фильтре при культивировании в течение 8 дней в среде без использования сыворотки Содержание фитонцидина 1 2 3 4 5 6 7 в среде, % Контроль 0,06 0,25 0,5 1 2 3 Количество исследований, n 23 2 6 8 23 12 6 М, мм2 3,54 4,15 2,65 1,96 1,857 1,05 0,13 p p1 p1-2 = 0,915 p1-3 = 1,000 p1-4 = 0,013 p1-5 = 0,009 p1-6 = 0,046 p1-7 = 0,043 Из данных таблицы можно сделать заключение, что диапазон доз фитонцидина, вызывающих подавление образования и задерживающих рост клеточных колоний, составляет 0,5-8,0 %. При более низких концентрациях, 0,025 %, возможно слабо выраженное увеличение роста культур, а при 8 % и более значительное и почти полное угнетение способности к делению клеток и образованию упорядоченных клеточных зон роста. Чтобы оценить влияние условий культивирования на способность препарата угнетать жизнеспособность клеток, культивируемых in vitro, мы провели аналогичные опыты, но без использования эмбриональной сыворотки. Результаты представлены в табл. 2 При культивировании ткани в питательной среде без использования сыворотки фитонцидин больше влияет на жизнеспособность клеток культивируемых тканей почки, вызывая значительное подавление роста уже при концентрации 3 %. Полученный результат, вероятно, связан с более неблагоприятными для клеток условиями культивирования (в бессывороточной среде) и более продолжительным его сроком (8 дней). Диапазон доз, оказывающих тормозящее влияние на способность клеток к репродуктивной активности, в этом случае составил 0,5-3,0 %. Обсуждение результатов Исследования с использованием фитонцидина с разным сроком хранения нами проводились неоднократно. Результаты во всех случаях были идентичные, что свидетельствует о том, что активность препарата в течение рекомендуемых сроков хранения изменяется незначительно. Фитонцидин in vitro обладает слабой токсичностью. Он оказывает выраженное непосредственное угнетающее действие на жизнеспособность культивируемых клеток при содержании 1-5 %. Более высокая чувствительность клеток к препарату при культивировании тканей без использования эмбриональной сыворотки связана с отсутствием стимулирующего влияния эмбриональной сыворотки на жизнеспособность клеток и более длительным сроком культивирования. Возможно, при более низкой концентрации 0,2-0,5 % отмечается некоторая стимуляция фитонцидином роста культур. Тканевые культуры могут применяться для количественного тестирования свойств этого препарата. Опыты подтверждают, что фитонцидин в указанных нами концентрациях может использоваться для непосредственного воздействия на клетки и нанесения на слизистые ткани на длительное время. Выводы: 1. Препарат из чеснока фитонцидин в опытах по культивированию in vitro при концентрациях от 0,5 до 8,0 % оказывает выраженное биологическое действие, вызывая угнетение роста культур. 2. При 1-3 % содержания препарата без сыворотки в питательной среде чувствительность клеток ткани почек к нему увеличивается более чем в два раза и наблюдается эффект угнетения образования и роста культур от значительной задержки образования до его полного подавления. 3. Тканевые культуры могут использоваться для количественного тестирования биологических свойств фитонцидина.

About the authors

V P Pashchenko

Northern State Medical University

Email: paschenkow@mail.ru
Arkhangelsk, Russia

L E Gromova

Northern State Medical University

Arkhangelsk, Russia

E E Chernyshova

Northern State Medical University

Arkhangelsk, Russia

References

Supplementary files