EFFECT OF TRICLOSAN ON TESTEICULAR FUNCTIONS: AN EXPERIMENTAL AND AN OBSERVATIONAL STUDIES

Full Text

Мужское бесплодие и/или патозооспермию следует рассматривать, с одной стороны, как интегральный показатель нездоровья мужчин репродуктивного возраста, а с другой стороны, как лимитирующий фактор суммарного коэффициента рождаемости. Вместе с этим доля фактора мужского бесплодия составляет не менее 50 %. Среди причин мужского бесплодия неизвестной этиологии (30 - 40 %) упоминаются активные формы кислорода (ROS), генетические, эпигенетические факторы и эндокринные дизрапторы (endocrine disruptors, EDs) [9, 12, 15, 23]. В 1993 году впервые в литературу был введен 58 Экология человека 2019.12 Медицинская экология термин «эндокринные дизрапторы» (эндокринные дизрегуляторы, гормоноподобные ксенобиотики), к которым были отнесены химические соединения, способные нарушать функцию эндокринной системы [9]. На сегодняшний день значение эндокринных дизрапторов в регуляции деятельности систем жизнеобеспечения и размножения изучено не до конца. К наиболее известным нестойким убиквитарным эндокринным дизрапторам относятся: фталаты, бис-фенол А (ВРА), триклозан (TCS) и 4-нонилфенол (4-NP). Источником TCS являются средства личной гигиены: дезодоранты, зубная паста, крем для бритья, жидкость для полоскания рта, косметика, мыло для рук, а также бытовые чистящие средства [27, 35]. Допускается, что не менее 75 % населения США подвержены воздействию данного ксенобиотика [32]. После убедительных доказательств о негативном влиянии триклозана на микробиом животных и способность вызывать устойчивость микрофлоры к различным антимикробным средствам FDA (Food and Drug Administration) в сентябре 2016 года выносит запрет на его использование в составе мыла [20, 22]. Европейский союз выносит запрет на использование TCS во всех средствах личной гигиены с января 2017 года [16]. В организм человека TCS попадает главным образом через кожу и желудочно-кишечный тракт и может быть обнаружен в различных биологических жидкостях и тканях организма (Wang and Tian 2015; Geens et al., 2012) [6, 7, 14, 31]. Вместе с этим объем TCS, который попадает в сточные воды в США, был оценен более чем 1,1 х 105 кг/год. Данный факт имеет значение, так как известно, что TCS способен накапливаться в морепродуктах и растениях, попадая таким образом на стол человека [25, 28]. Считается, что TCS является потенциальным ED, который угнетает активность ферментов, участвующих в синтезе стероидных гормонов [11, 18]. Показано, что TCS может приводить к гипоплазии яичек, накапливаться в тканях придатка яичка и снижать концентрацию сперматозоидов у экспериментальных животных [19, 21]. В другом исследовании, проведенном на половозрелых самцах крыс, TCS не показал себя в роли эндокринного дизраптора и не ухудшал качество спермы и гистоморфометрические характеристики яичка [26]. Вместе с тем количество исследований по изучению эффекта TCS на репродуктивную функцию человека весьма ограничено, а результаты весьма противоречивы [8, 17]. Кроме того, эти немногочисленные исследования ограничены определением TCS исключительно в образцах мочи и/или сыворотке крови [10, 17, 35]. Однако Т. Geens и соавт. [13] показали, что ВРА, TCS и 4-NP неодинаково накапливаются в тканях организма человека, и поэтому измерение этих соединений в образцах мочи не может отражать истинного влияния их на репродуктивные органы и репродуктивное здоровье человека в целом. Цель исследования - изучить зависимость герминативной и эндокринной функций яичек у мужчин и экспериментальных животных от уровня концентрации триклозана в семенной жидкости или в тканях яичка. Методы В обсервационном одноцентровом одномоментном (поперечном) исследовании, которое было проведено в ДНК-клинике (г. Челябинск) с ноября 2017 по июнь 2018 года, приняли участие 53 мужчины молодого возраста. Пациенты обратились в клинику для выполнения спермиологического анализа в связи с бесплодием в браке, невынашиванием беременности партнершей, а также планированием беременности или донорством спермы. При оценке качества 53 образцов эякулята испытуемые были разделены на две группы: 1-я группа (п = 19) - мужчины с нормозооспермией, планирующие беременность в супружеской паре, и доноры спермы; 2-я группа (n = 34) - мужчины с патозооспермией, идиопатической формой бесплодия. Спермиологическое исследование проводилось согласно рекомендациям ВОЗ (2010) с учетом оценки количества сперматозоидов, их подвижности и морфологии, а также индекса фрагментации их ДНК [33]. Заключение по спермограмме «нормо-зооспермия» или «патозооспермия» основывалось на критериях, изложенных в тех же рекомендациях ВОЗ (2010) [33]. Для оценки индекса фрагментации ДНК сперматозоидов использовался метод дисперсии хроматина спермы (sperm chromatin dispersion, SCD) с помощью набора GoldCyto DNA Assist Kit (laboratories AG, Германия). Нормативным значением степени фрагментации ДНК сперматозоидов считали 15 % и менее (низкий риск нарушения фертильности). Бисфенол А в семенной жидкости определяли на газовом хроматографе с масс-спектрометром Shimadzu GCMS- QP2010Ultra (Shimadzu Corporation, Япония). Данные обрабатывались с помощью программы GCMSsolution 4,3 (Shimadzu Corporation, Япония). Уровень общего тестостерона плазмы крови оценивался на приборе Immulite 1000 (США). С целью оценки морфофункциональных изменений в герминативном и эндокринном аппаратах яичек, обусловленных действием TCS, была выполнена экспериментальная часть работы на белых половозрелых лабораторных крысах самцах Вистар (n = 20). Экспериментальные животные были разделены на две группы: 1-я группа - контрольная, интактная (п = 10) и 2-я группа - опытная (п = 10). Крысы опытной группы в течение двух месяцев ежедневно получали с пищей TCS со степенью гомогенности > 97 % (Sigma-Aldrich, США) в количестве 200 мг/кг. Работа с лабораторными животными выполнялась в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ МЗ СССР №755 от 12.08.77). После взвешивания яичек зрелые сперматозоиды получали из придатка по общепринятой методике 59 Медицинская экология Экология человека 2019.12 [2] с оценкой общего их количества в 1 мл и подсчетом их атипичных форм и количества фертильных сперматозоидов [1, 3, 34]. Серийные срезы яичек окрашивали гематоксилин-эозином. При помощи лицензированного программного обеспечения «Видео Тест-Морфология 5.0» выполнялись морфометрические измерения диаметра и площади извитых семенных канальцев, площади паренхимы и стромы яичек, толщины сперматогенного эпителия, общего количества канальцев, количества канальцев со слущенным эпителием. Также подсчитывали общее количество и площадь клеток Лейдига с их ядерноцитоплазматическим отношением в десяти полях зрения (площадь одного поля зрения - 8,8 х 105 мкм2) с вычислением средних значений. Для измерения концентрации исследуемого EDs в тканях яичек левое яичко полностью гомогенизировалось в стеклянно-тефлоновом гомогенизаторе, а затем было подвергнуто центрифугированию при 700 х g в течение 10 минут при температуре 4 °С, чтобы удалить детрит и ядра. Образовавшаяся в результате надосадочная жидкость использовалась для измерения концентрации TCS методом газовой хроматографии с масс-спектрометрией (GC-MS). Проведение исследования одобрено Локальным комитетом по этике ФГБОУ ВО «ЮУГМУ» Минздрава России 21.11.2017 года (выписка из протокола № 9). Размер выборки предварительно не рассчитывался. Статистический анализ полученных данных выполнялся с помощью программы IBM SPSS Statistics v.21 (IBM Corp., Armonk, NY, США). Проверка нормальности распределения переменных проводилась с учетом объема выборки с использованием критерия Колмогорова - Смирнова. Результаты исследования представлены как медиана с интерквартильным размахом Me (Q; Q3) или как средняя со стандартным отклонением (M ± с) при нормальном распределении. Для определения статистически значимых различий между группами использовался U-критерий Манна - Уитни. Для установления связи между показателями вычислялся коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Различия между группами считались статистически значимыми при р < 0,05. Результаты Средний возраст пациентов (±с) составил (30,8 ± 3,6) года, средний индекс массы тела (ИМТ; ± с) - (25,4 ± 2,9) кг/м2, при этом 42 % мужчин были с избыточной массой тела (ИМТ 25-30) и 11 % -с ожирением I степени (ИМТ > 30). Группы сравнительного анализа были сопоставимы по возрасту, периоду воздержания от семяизвержений, ИМТ, курению и приему алкоголя (табл. 1). При этом частота патозооспермии среди курящих и употребляющих алкоголь составила 53,8 и 55,6 %, среди некурящих и не употребляющих алкоголь - 56,0 и 55,6 % соответственно. В 84,9 % образцов эякулята был обнаружен TCS со срединной концентрацией 0,13 (0,05-0,22) нг/мл. Таблица 1 Сопоставление групп по возрасту, индексу массы тела, периоду воздержания, статусу курения и употребления алкоголя Параметры 1 группа (n = 19) нормозоо-спермия 2 группа (n = 34) патозоо-спермия Р Me (Q1-Q3) Me (Q1-Q3) Возраст, лет 32,0 (29,534,0) 31,0 (28,033,0) 0,157 Период воздержания, сут. 3,0 (3,0-4,0) 4,0 (3,0-4,0) 0,105 ИМТ, кг/м2 25,1 (22,426,7) 25,5 (24,226,8) 0,356 Курение Некурящие 11 (44 %) 14 (56 %) 0,901 Курящие 6 (46,2 %) 7 (53,8 %) Алкоголь Непьющие 8 (44,4 %) 10 (55,6 %) 1,0 Пьющие 8 (44,4 %) 10 (55,6 %) Примечание. *р < 0,05. Группа мужчин с патозооспермией (64 %) была представлена следующим образом: частота встречаемости тератозооспермии - 30 % (n = 16), астенотератозоо-спермии - 22,5 % (n = 12), олиготератозооспермии - 7,5 % (n = 4), олигоастенотератозооспермии (ОАТ-синдром) - 4 % (n = 2). Группы пациентов, включенных в исследование, статистически значимо различались по концентрации TCS в семенной жидкости (р = 0,045), а также индексу фрагментации ДНК сперматозоидов (р = 0,004). Так, у мужчин с нормозооспермией концентрация TCS в семенной жидкости 0,09 (0,0-0,19) нг/мл оказалась меньше, чем у мужчин с патозооспермией 0,20 (0,11-0,36) нг/мл, то же самое было справедливо и в отношении индекса фрагментации ДНК сперматозоидов - 14,0 (9,0-18,0) против 18,5 % (16,0-25,0) (рис. 1, 2). В отношении концентрации тестостерона в крови статистически значимых различий не обнаружено. С помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена между концентрацией триклозана в семенной жидкости и параметрами эякулята, а также уровнем общего тестостерона в плазме крови были Рис. 1. Сравнение групп по концентрации триклозана в семенной жидкости 60 Экология человека 2019.12 Медицинская экология Рис. 2. Сравнение групп по степени фрагментации сперматозоидов обнаружены статистически значимые корреляционные связи: прямая с индексом фрагментации ДНК сперматозоидов (г = 604; р < 0,001) и обратная с долей сперматозоидов с нормальной морфологией (г = -0,420; р = 0,004) (табл. 2). Таблица 2 Корреляционные связи между концентрацией триклозана в семенной жидкости и параметрами эякулята, уровнем общего тестостерона крови Параметр Триклозан, нг/мл г Р Общее количество сперматозоидов, млн -0,188 0,211 Концентрация сперматозоидов, млн/мл -0,206 0,170 Прогрессивно подвижные сперматозоиды (а + b), % -0,237 0,113 Сперматозоиды с нормальной морфологией, % -0,420 0,004* Индекс ДНК фрагментации сперматозоидов, % 0,604 < 0,001* Уровень общего тестостерона крови, нмоль/л -0,019 0,926 Примечание. *р < 0,05. В экспериментальной части работы было обнаружено, что различие между группами сравнения (опытной и интактной) по концентрации TCS в тканях яичек было статистически значимым (р < 0,001). Полученные результаты убедительно свидетельствуют о снижении абсолютной массы яичек в опытной группе по сравнению с группой контроля. Опытная группа крыс, подвергшихся воздействию TCS, продемонстрировала снижение доли фертильных сперматозоидов (прогрессивно и слабо подвижные) по сравнению с группой интактных животных (табл. 3). Вместе с тем группы существенно различались по гистоморфологическому состоянию яичек (площадь паренхимы и стромы, количество извитых семенных канальцев со слущенным эпителием, диаметр и площадь извитых семенных канальцев, толщина сперматогенного эпителия, а также общее количество клеток Лейдига и их ядерно-цитоплазматическое отношение) (табл. 4). Таблица 3 Сопоставление групп по концентрации триклозана в тканях яичка, массе яичек и параметрам спермы Параметр Контроль (п = 10) Опыт (TCS) (п = 10) р Me (Q-Q3) Me (Q-Q3) TCS, нг/мл 0,01 (0,000,03) 0,27 (0,230,46) <0,001* Масса правого яичка, г 1,61 (1,551,78) 1,45 (1,421,49) 0,001* Масса правого яичка/ масса тела, % 0,93 (0,840,94) 0,88 (0,840,91) 0,284 Общее количество сперматозоидов, млн 15,90 (14,7017,40) 15,30 (12,1517,00) 0,475 Прогрессивно подвижные сперматозоиды, % 58,0 (56,561,5) 53,0 (50,556,0) 0,011* Слабо подвижные сперматозоиды, % 26,5 (23,527,0) 34,0 (30,537,0) 0,001* Атипичные формы сперматозоидов, % 12,0 (9,012,0) 12,5 (11,013,5) 0,202 Примечание. * р < 0,05. Таблица 4 Сопоставление групп по концентрации триклозана в тканях яичка и морфофункциональным характеристикам сперматогенеза Параметр Контроль (п = 10) Опыт (TCS) (п = 10) р Me (Q-Q3) Me (Q-Q3) Площадь паренхимы яичка, мкм2 4035478,48 (4027847,89 4060018,02) 3998191,98 (3974000,13 4013347,12) 0,012* Площадь стромы яичка, мкм2 380064,82 (355525,28 387695,41) 417351,33 (402196,19 441543,17) 0,012* Общее количество канальцев, n 133 (132-139) 131 (129132) 0,069 Количество канальцев со слущенным эпителием, n 2 (1-4) 4 (3-6) 0,046* Толщина сперматогенного эпителия, мкм 98,43 (97,42100,20) 93,22 (92,1194,29) <0,001* Диаметр извитых семенных канальцев, мкм 284,99 (284,45 285,29) 306,28 (302,64 309,63) <0,001* Площадь извитых семенных канальцев, мкм2 67233,10 (67126,58 67497,53) 73122,14 (72888,35 74024,35) <0,001* Общее количество клеток Лейдига (п) 154,8 (149,8159,2) 142,1 (137,2146,6) 0,001* Площадь клеток Лейдига, мкм2 1410,65 (1396,87 1431,13) 1363,55 (1340,54 1401,58) 0,153 Ядерно-цитоплазма-тич. отношение 0,48 (0,480,49) 0,54 (0,530,58) <0,001* Примечание. * р < 0,05. С использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена между концентрацией TCS в тканях яичка и морфометрическими показателями сперматогенеза и клетками Лейдига были обнаружены следующие корреляционные связи: прямая, высокой тесноты (по шкале Чеддока) с диаметром извитых семенных канальцев (г = 0,866; р = 0,001); долей 61 Медицинская экология Экология человека 2019.12 слабо подвижных сперматозоидов (0,883; р < 0,001); ядерно-цитоплазматическим индексом (ЯЦИ) клеток Лейдига (r = 0,866; р < 0,001); обратная высокой тесноты с толщиной сперматогенного эпителия (г = -0,866; р < 0,001); общим количеством клеток Лейдига (r = -0,779; р < 0,001) (табл. 5). Таблица 5 Корреляционные связи между концентрацией триклозана в тканях яичка и морфофункциональными характеристиками сперматогенеза Параметр Триклозан, нг/мл r p Масса правого яичка, г -0,779 < 0,001* Масса правого яичка/масса тела, % -0,260 0,298 Общее количество сперматозоидов, млн - 0,173 0,492 Доля прогрессивно подвижных сперматозоидов, % -0,655 0,006* Доля слабо подвижных сперматозоидов, % 0,883 < 0,001* Атипичные формы сперматозоидов, % 0,310 0,211 Площадь паренхимы яичка, мкм2 -0,606 0,008* Площадь стромы яичка, мкм2 0,606 0,008* Общее количество канальцев, n -0,440 0,067 Количество канальцев со слущенным эпителием, n 0,484 0,042* Толщина сперматогенного эпителия, мкм -0,866 < 0,001* Паренхима/строма яичка, % -0,606 0,008* Диаметр извитых семенных канальцев, мкм 0,866 0,001* Площадь извитых семенных канальцев, мкм2 0,866 0,001* Общее количество клеток Лейдига (n) -0,779 < 0,001* Площадь клеток Лейдига, мкм2 -0,346 0,159 Ядерно-цитоплазматический индекс 0,866 < 0,001* Примечание. * р < 0,05. Вместе с этим установлено, что исследуемый дизраптор имеет склонность накапливаться в тканях яичек, о чем свидетельствует шестикратное увеличение его концентрации в тканях яичка у опытных животных по сравнению с группой контроля. Обсуждение результатов В данном исследовании были установлены корреляционные связи между концентрацией TCS в семенной жидкости и параметрами эякулята (морфология и фрагментация ДНК сперматозоидов) у мужчин. Кроме того, выявили, что данный эндокринный дизраптор вызывает нарушение генеративного (уменьшение размеров яичек, площади паренхимы яичка, толщины сперматогенного эпителия на фоне увеличения диаметра извитых семенных канальцев и ухудшение параметров спермы), а также эндокринного аппаратов (уменьшение количества и размеров клеток Лейдига с увеличением их ЯЦИ) яичек половозрелых крыс. Впервые в данном исследовании была оценена концентрация TCS непосредственно в семенной жидкости у мужчин и яичках животных и показано его влияние на качество спермы, а также тестикулярные гистоморфометрические характеристики в эксперименте. По нашему мнению, обнаружение TCS именно в семенной жидкости и в тканях яичка в условиях эксперимента может отражать прямое токсическое действие данного эндокринного дизрапто-ра на сперматогенез и эндокринную функцию яичка. Так, ранее нами была установлена точка разделения (cut-off) уровня концентрации TCS в семенной жидкости между нормозооспермией и патозооспермией у мужчин с идиопатической формой бесплодия [4]. Jurewicz и соавт. [17] показали корреляционную зависимость морфологии сперматозоидов от концентрации TCS выше 50-го и 75-го процентилей в моче. Результаты исследования, полученные Zhu и соавт. [35], свидетельствуют о наличии статистически значимой связи между концентрацией TCS в нижнем квартиле (< 0,66 нг/мг) в моче и параметрами эякулята (концентрация, подвижность и морфология сперматозоидов). Результаты нашего эксперимента согласуются с этими данными и подтверждают наличие статистически значимой корреляционной связи между концентрацией TCS в семенной жидкости и морфологией сперматозоидов (р = 0,004). В многочисленных исследованиях in vitro были убедительно продемонстрированы проапоптотиче-ский и цитотоксический эффекты TCS на культуре опухолевых и здоровых клеток человека и животных [5, 24]. Считается, что проявлением апоптоза сперматозоидов является фрагментация их ДНК, что и было показано в нашем исследовании. Анти-андрогенная или андрогенная активность TCS была продемонстрирована исключительно in vitro или in vivo у эспериментальных животных [19, 29]. В данном исследовании нам не удалось обнаружить корреляционную зависимость уровня общего тестостерона у мужчин от концентрации TCS в семенной жидкости. Однако в эксперименте было продемонстрировано влияние TCS на эндокринный аппарат яичек крыс в виде снижения общего количества клеток Лейдига и увеличения их ядерно-цитоплазматического отношения, последнее мы расценили как преходящий адаптивный процесс к действию ксенобиотика. Предсказать действие эндокринного дизраптора на эндокринную функцию достаточно проблематично из-за существующего немонотонного ответа на дозу EDs (NMDR, non-monotonic dose-response) - это означает, что ответ (негативный) не всегда повышается/снижается при повышении/снижении дозы и имеет форму U-образной или перевернутой U-образной кривой [30]. Так, Pernoncini и соав. [26] в эксперименте на крысах при использовании низких доз TCS (0,8 -8,0 мг/кг) не выявили негативного эффекта TCS на фертильность, что противоречит результатам данного исследования и исследований других авторов [21, 36], в которых TCS применялся в больших дозах 50-200 мг/кг. 62 Экология человека 2019.12 Медицинская экология Основным фактором, который может значимо повлиять на результаты данного эксперимента, является воздействие на репродуктивное здоровье мужчин других эндокринных дизрапторов («коктейль» репротоксикантов), в частности сравнительно высокая общая токсическая нагрузка на испытуемых пациентов. Исследование было ограничено оценкой влияния одного эндокринного дизраптора на репродуктивную функцию, поэтому не позволило анализировать эффект синергизма репротоксикантов, воздействующих на организм человека, особенно в крупных промышленных городах. Следует сказать, что недостаточный объем выборки пациентов, а также лабораторных животных, у которых изучали содержание TCS в семенной жидкости или тканях яичек, связан с трудоемкостью и финансовой затратностью данной процедуры. Выводы Триклозан в семенной жидкости нарушает спер-матогенную и эндокринную функции яичка в условиях клиники и эксперимента, что подтверждено снижением параметров спермы и ухудшением гисто-морфологических характеристик яичек. Кроме того, отмечено повышение индекса фрагментации ДНК сперматозоидов. Вместе с этим показано избирательное накопление репротоксиканта (TCS) в тканях яичка в эксперименте и в семенной жидкости у мужчин, что создает необходимые условия для его прямого и длительного токсического действия. Таким образом, анализ полученных результатов позволяет рассматривать повышенный уровень концентрации TCS в семенной жидкости как один из причинных факторов идиопатической формы инфер-тильности/субфертильности у мужчин. В связи с этим данный показатель, на наш взгляд, можно рекомендовать для включения в алгоритм диагностического поиска причин при идиопатической форме бесплодия.

About the authors

S. V. Chigrinets

South-Ural State Medical University of Russian Ministry of Health; DNA clinic

Email: chigrinstas@gmail.com

G. V. Bryukhin

South-Ural State Medical University of Russian Ministry of Health

References

Supplementary files