ANTIMUTAGENIC EFFECT OF IMUNOFAN WITH COMBINED EFFECTS OF CD (II), PB (II) IONS AND CEFTRIAXONE ANTIBIOTICS

Abstract


The aim is to study the combined effects of heavy metals and antibiotics on the genetic cell apparatus, to assess the possibility of correction of the genotoxic effect of the immunomodulator. Using Ford-Hamerton method the cytogenetic effects of the antibiotic Ceftriaxone (450 mg / kg) on the background of cadmium chloride (1 х 10-3M), lead acetate (1 х 10-3 M) and imunofan (0.004 mg/kg) were estimated on marrow cells of 102 male rats of Wistar population. Results. Imunofan showed antimutagenic effect: the number of chromosomal aberrations compared with the negative control (1.5 ± 0.50) % decreased 3 times (0.50 ± 0.29) %; the genome protection coefficient (Fp) was 66.67 %. The expression coefficient of the mutagenic effect of Cd (II) is 3.5 units, the number of chromosomal aberrations - (5.3 ± 0.91)%; the expression coefficient of the mutagenic effect Pb (II) was 3 units; the number of chromosomal aberrations - (4.5 ± 0.85) %; p < 0.001. Ceftriaxone in the maximum therapeutic dose had mild mutagenic properties: the expression coefficient of the mutagenic effect -2.2 units; the number of chromosomal aberrations (3.3 ± 0.73) %. In the variants [Pb (II) + ceftriaxone] and [Cd (II) + ceftriaxone], the mutagenic effect increased in comparison with the mono-effect of substances: the expression coefficient of the mutagenic effect, respectively 3.9 and 4.1 units; the number of chromosomal aberrations - (5.86 ± 0.95) %; p <0.001 and (6.2 ± 0.98) %; p < 0.001. The maximum antimutagenic protection by imunofan was observed relative to Cd (II) in the variants simulating prophylaxis (Fp 58.5 %) and treatment (Fp 56.6 %). For Pb (II) and on the background of ceftriaxone - in the variants of "prophylaxis" - (Fp 44.4; 60.6 %). With the combined effect of ions Pb (II), Cd (II) and ceftriaxone Fp varies from 39.7 to 51.7 %. Conclusions: The increase in chromosomal aberrations when combined with Pb (II), Cd (II) and ceftriaxone ions, in comparison with separate treatment, results in increasment of model "chemical pressure" on the genetic cell apparatus. For the purpose of antimutagenic correction, the use of immunomodulator imunofan is possible.

Full Text

Сегодня экологические условия человека нарушаются посредством одновременного соприкосновения индивидуума с многочисленными экополлютантами в различных жизненных условиях. Поэтому важнейшей задачей в медико-биологической оценке состояния здоровья человека, живущего в условиях антропогенного пресса, является изучение комбинированного воздействия глобальных загрязнителей на живые организмы [7, 9, 14]. Тяжелые металлы, пестициды, ядохимикаты, фармацевтические препараты, новые химические вещества при трансформации в окружающей среде создают постоянно нарастающий «химический прессинг» [1, 16, 23]. Экологообусловленные и экологозависимые заболевания носят региональный характер и формируются соответственно особенностям экологического прессинга, сложившегося на данной территории [11]. Для Республики Северная Осетия - Алания основой «химического пресса» являются выбросы и отходы металлургических предприятий [2]. Экологозависимыми для региона являются болезни сердечно-сосудистой, иммунной, костно-суставной, мочеполовой систем, болезни органов дыхания. Изучение спектра врожденных пороков развития за период от 2008 до 2012 года по республике выявило, что аномалии системы кровообращения составляют 43,34 %, аномалии половых органов - 9,88 %, нервной системы - 3,24 %, органов пищеварения - 2,29 %. Хромосомный анализ женщин с отягощенным акушерским анамнезом свидетельствовал о повышении уровня аберраций (выше 4 %) у 64,7 % обследованных. В целом 48,5 % популяции жителей Северной Осетии имеют частоту хромосомных аберраций (ХА) выше нормы (от 3,1 до 7,6 %) [24]. По данным из научной литературы, ксенобиотики обладают иммунотоксическим эффектом, вызывая гипоактивные или гиперактивные состояния. Соединения кадмия и свинца в токсических дозах снижают функцию Т- и В-клеток, в невысоких дозах проявляют иммуномодулирующий эффект, повреждают ДНК, РНК клеток. Нарушение иммунокомпетентных клеток возникает вследствие инициации токсикантом пере-кисного окисления липидов клеточных мембран [4]. Таким образом, сформированный под воздействием «химического фактора» экозависимый иммунодефицит обусловливает высокий уровень соматической заболеваемости, включая увеличение частоты возникновения и периода реабилитации инфекционных болезней. Для населения возникает необходимость в применении лекарственных препаратов, которые, в свою очередь, могут выступать в роли экополлю-тантов, возвращаясь к человеку и животным в виде химически устойчивых метаболитов по трофическим цепям из окружающей среды. Половина производимых антибиотиков используется в сельском хозяйстве (животноводство, растениеводство, садоводство) и по цепи питания попадает в организм человека. При этом запускаются процессы эволюционирования сообщества госпитальных микроорганизмов, включающие горизонтальный перенос генов, мутации, мобильные генетические элементы [27]. Приобретенная антибио-тикорезистентность микроорганизмов способствует поиску новых способов борьбы с инфекционными заболеваниями, в том числе - повышения дозирования препарата. На фоне снижения иммунологической резистентности населения в условиях антропогенного загрязнения окружающей среды применение антибиотиков и других фармацевтических препаратов оказывается малоэффективным. Известно, что действие антибактериальных препаратов направлено на подавление возбудителей заболеваний, окончательная элиминация которых зависит от факторов иммунитета. Следовательно, возникает необходимость применения препаратов, обладающих иммунокорректирующей активностью. В литературе имеются данные по цитогенетическим последствиям комплексного воздействия тяжелых металлов и лекарственных препаратов на организм человека и способы их антимутагенной коррекции [10, 17-20]. Но таких исследований недостаточно. Не случайно пленум Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды Российской Федерации (2014) в качестве приоритетных инновационных направлений научно-исследовательской работы определил изучение цитогенетического, цитологического, биохимического и иммунологического статуса и генетической предрасположенности к развитию патологии при изучении влияния факторов окружающей среды [14]. Учитывая актуальность и необходимость подобных исследований, в нашем эксперименте создана модельная ситуация, при которой в организме сочетаются тяжелый металл, антибиотик и иммуномодулятор. Каков же результирующий итог столь многогранного комплексного влияния на наследственный аппарат? Цель и задачи настоящего исследования: методом Форда - Хамертона на клетках костного мозга млекопитающих дать оценку цитогенетическим последствиям воздействия действующего вещества бета-лактамногоантибитикацефалоспоринового ряда - цефтриаксона, на фоне хлорида кадмия и ацетата свинца; изучить возможность антимутагенной коррекции генотоксического эффекта иммуномодулятором тимического происхождения имунофаном. Методы Экспериментальное исследование проводили на 102 генетически однородных самцах крыс популяции Wistar весом (250 ± 10) г. Каждая экспериментальная группа состояла из 6 животных. Общее количество групп - 17. Лабораторные животные содержались при 12-часовом световом режиме в условиях свободного доступа к пище и воде на стандартном рационе вивария. Работа с животными соответствовала этическим нормам и правилам содержания и ухода, прописанным в руководстве NationalResearchCouncil, 2011 и ГОСТ Р53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики». Эвтаназию крыс осущест 50 Экология человека 2019.07 Медицинская экология вляли в затравочной камере методом ингаляции 80 % углекислым газом в кислороде. Проведение экспериментального исследования одобрено на заседании Комитета по этике при ФГБОУ ВО СОГМА Минздрава России (протокол № 7.17 от 30.11.2017 г.) Цитогенетическое исследование проводили методом учета ХА в клетках костного мозга крыс. Использовали стандартный метод Форда - Хамертона (1956) в модификации лаборатории П. Я. Шварцмана [8]. Костный мозг выделяли из диафиза бедренных костей крыс популяции, вымывая его в центрифужную пробирку теплым физиологическим раствором. Пробирки с выделенной тканью центрифугировали в течение 5 минут (1 000 оборотов в минуту). Надосадочную жидкость сливали, осадок ресуспензировали пастеровскими пипетками разного диаметра. В полученную суспензию вводили гипотонический раствор 0,55 % KCl. Выдерживали в течение 20 минут при температуре 37 °С. Затем, по окончании центрифугирования (5 минут, 1 000 об/ мин), проводили фиксацию материала путем добавления свежеприготовленного фиксатора, состоящего из 3 частей метанола и 1 части ледяной уксусной кислоты. Время фиксации - 10 минут при t +4 °С, после чего осуществляли центрифугирование (5 минут, 1 000 об/мин). Надосадочную жидкость сливали, добавляли вторую порцию фиксатора, осадок ресу-спензировали, выдерживали при t +4 °С 15 минут. Смену фиксатора осуществляли трехкратно. Время последней фиксации при t +4 °С - 40 минут. В третьей порции фиксатора клеточную суспензию раскапывали на обезжиренные предметные стекла с высоты 20 см. Фиксатор выжигали в пламени спиртовки. Сухой препарат окрашивали рутинно, по методу Романовского - Гимза 5 % раствором азур-эозина по Романовскому. Для эффективного окрашивания в приготовленный рабочий раствор красителя добавляли 5-10 капель 0,1 % раствора №^О3 (для достижения нейтральной реакции красителя). Препараты помещали в химические стаканы, выдерживали 30 минут, после чего промывали в проточной воде и высушивали. Готовые препараты по 2 от каждого животного шифровали, а затем подвергали микроскопическому анализу (увеличение в 1 000 раз). Анализу подвергали ме-тафазные пластинки с модальным числом хромосом 42 XY, без наложений, по 100 метафаз от каждого животного. Учитывали наличие одиночных и парных фрагментов, хроматидных и хромосомных обменов, ахроматических пробелов, число клеток с множественными повреждениями (мультиаберрантные клетки) [12]. В ходе эксперимента проанализировали 1 0 200 метафазных пластинок по 600 на каждую контрольную и опытные группы. Исследуемые вещества: 1. Ацетат свинца применяли в концентрации 1 х 10-3 M, из расчета 0,2 мл раствора на 100 г веса животного. Способ введения - внутрибрюшинные инъекции 1 раз в день, длительность - 5 суток. 2. Хлорид кадмия применяли в концентрации 1 х 10-3 M. Доза рассчитывалась в соответствии с весом животного, исходя из пропорции 0,2 мл раствора на 100 г веса животного. Введение внутрибрюшинное, 1 раз в день. Длительность - 5 суток. 3. Цефтриаксон - бета-лактамный антибиотик III поколения из группы цефалоспоринов. Торговое название препарата: цефтриаксон, международное непатентованное: цефтриаксон. Экспериментальную дозу, длительность применения, используемый растворитель для инъекций, объем вводимого раствора, способ введения рассчитывали согласно инструкции по применению препарата и в соответствии с методическими указаниями, представленными в справочниках Фисенко В. П. и Хабриева Р. У. [12, 13]. Максимальная суточная терапевтическая доза для человека массой тела 50 кг не должна превышать 4 г, то есть 80 мг/кг. С пересчетом дозы на поверхность тела животного (по Фисенко В. П.) экспериментальная доза для крыс составила 450 мг/кг, длительность воздействия 5 суток. Способ введения внутрибрюшинный, по 0,4 мл раствора цефтриаксо-на на животное, растворитель - дистиллированная вода. Применяли цефтриаксон (1 г). (ОАО Синтез, Акционерное Курганское общество медицинских препаратов и изделий). 4. Имунофан -относится к группе иммуномодулирующих лекарственных средств. Торговое название препарата Имунофан (Imunofan). Действующее вещество: аргинил-альфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин. Исходя из инструкции по применению препарата, осуществлен пересчет доз на поверхность тела экспериментального животного по Фисенко В. П. [12] с использованием указанных коэффициентов. Учитывая методические рекомендации [13], получили применяемые в эксперименте дозы препарата: 0,004 мг/кг веса животного (или 0,02 мл препарата на 1 крысу). Введение внутрибрюшинное, 1 раз в сутки, с интервалом 1 сутки. Длительность воздействия 7 суток (4 инъекции). В эксперименте использовали Имунофан для инъекций (50 мкг в 1 мл), производитель БИОНОКС НПП ООО (Россия). 5. Контроль негативный - внутрибрюшинные инъекции в течение 14 суток по 0,4 мл воды для инъекций. Дизайн эксперимента предполагает изучение анти-мутагенной коррекции иммуномодулятором возможных цитогенетических эффектов кадмия (II) и свинца (II), цефтриаксона и комплекса [?Ь(П)+цефтриаксон], [^(П)+цефтриаксон]. Предобработка имунофаном моделировала «профилактику», а постобработка -«лечение» генотоксических эффектов исследуемых веществ в костном мозге млекопитающих. Статистическая обработка результатов,согласно методическим рекомендациям [8, 13], проводилась стандартным методом вариационной статистики медико-биологического профиля (t-критерий Стъюдента), путем сопоставления долей аберрантных метафаз в контрольной и опытной сериях эксперимента. 51 Медицинская экология Экология человека 2019.07 Данный метод выбран нами в связи с равномерным распределением показателей в группах и равенством генеральных дисперсий. Рассчитывали среднюю арифметическую доли аберрантных метафаз (M) и ошибку средней арифметической (±m). Доказательством наличия цитогенетического эффекта исследуемого вещества в клетках костного мозга является статистически значимое превышение доли ХА выборочного среднего в эксперименте по сравнению с выборочным средним негативного контроля; наличие антимута-генного эффекта - со средним соответствующего позитивного контроля. Для оценки статистической значимости различий средних в случаях двух выборок использовали t-критерий Стъюдента для парных наблюдений. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали меньшим или равным 0,05. Выраженность мутагенного эффекта (ВМЭ) вычисляется по формуле: ВМЭ = М1 / М2, где М1 - % ХА в эксперименте; М2 - % ХА в негативном контроле [17]. Коэффициент защиты (Кз) генома антимутагеном рассчитывали по формуле: К = 100 - (% ХА 1 / % ХА 2) х 100, где % ХА 1 - доля ХА в варианте с антимутагеном; % ХА 2 - доля ХА в соответствующем позитивном контроле. Результаты Результаты эксперимента представлены в табл. 1 и 2. Настоящее исследование показало: 1. Иммуномодулятор имунофан проявил в клетках костного мозга крыс популяции Wistar анти-мутагенный эффект: количество ХА по сравнению с негативным контролем уменьшилось в 3 раза и составило (0,5 ± 0,29) % (негативный контроль (1,5 ± 0,50) %). Коэффициент защиты генома 66,67 %. 2. Наибольшей мутагенной активностью обладал хлорид кадмия. Коэффициент ВМЭ - 3,5 единицы. 3. Генотоксический эффект ацетата свинца составил 3 единицы, что в 3 раза выше относительно негативного контроля. 4. Цефтриаксон в максимально возможной терапевтической дозе обладал менее выраженным коэффициентом ВМЭ (2,2 единицы), что соответствует слабо выраженным мутагенным свойствам. 5. При комплексном воздействии [Pb(II) + цефтриаксон] и [Cd(II) + цефтриаксон] мутагенный эффект возрастал по сравнению с моновоздействием каждого из веществ (ВМЭ соответственно 3,9 и 4,1 единицы). 6. Максимальная антимутагенная защита наблюдалась относительно хлорида кадмия и возможна в вариантах, имитирующих как «профилактику» (Кз - 58,5 %), так и «лечение» (К - 56,6 %). Для ацетата свинца наиболее эффективная защита отмечена в варианте предобработки (Кз - 44,4 %). Таблица 1 Коррекция имунофаномгенотоксического эффекта цефтриаксона, ацетата свинца, хлорида кадмия и комплекса [тяжелый металл + цефтриаксон] № Вариант эксперимента Общее количество аберраций Доля аберрантных метафаз (%) M±m Критерий Стьюдента p< Коэффициент защиты Кз % Коэффициент выраженности мутагенного эффекта ВМЭ 1 Контроль негативный 9 1,5±0,50 - - - 1 2 Имунофан 3 0,50±0,29 2,439 0,05 66,7 0,3 3 Контроль позитивный 1 Pb(II) 27 4,5±0,85 4,367 0,001 - 3 4 Контроль позитивный 2 Cd(II) 32 5,3±0,91 5,000 0,001 - 3,5 5 Контроль позитивный 3 цефтри-аксон 20 3,3±0,73 3,396 0,001 - 2,2 6 Контроль позитивный 4 [Pb(II)+цефтриаксон] 35 5,8±0,95 5,322 0,001 - 3,9 7 Контроль позитивный 5 [И(П)+цефтриаксон] 37 6,2±0,98 5,595 0,001 - 4,1 8 [Pb(II)+имунофан] 18 3,0±0,70 3,125 0,01 33,3 2 9 [Имунофан+Pb(II)] 15 2,5±0,64 3,571 0,001 44,4 1,7 10 [И(П)+имунофан] 14 2,3±0,61 4,412 0,001 56,6 1,5 11 [Имунофан+М(П)] 13 2,2±0,60 4,493 0,001 58,5 1,5 12 [Pb+цефтриаксо^+имунофан 21 3,5±0,56 2,987 0,01 39,7 2,3 13 Имунофан+[Pb+цефтриаксон] 17 2,8±0,45 3,571 0,001 51,7 1,9 14 [И(П)+цефтриаксон]+имунофан 20 3,3±0,73 4,394 0,001 46,8 2,2 15 Имунофан+[М(П)+цефтриаксон] 19 3,2±0,72 4,545 0,001 48,4 2,1 16 Цефтриаксон+имунофан 11 1,8±0,54 3,061 0,01 45,5 1,2 17 Имунофан+цефтриаксон 8 1,3±0,46 3,571 0,001 60,6 0,9 52 Экология человека 2019.07 Медицинская экология Таблица 2 Спектр аберраций в клетках костного мозга крыс линии Wistar на фоне цефтриаксона, ацетата свинца, хлорида кадмия, комплекса [тяжелый металл + цефтриаксон] и иммуномодулятора - имунофана Спекрт аберраций № Вариант эксперимента Одиночные фрагменты, % Парные фрагменты, % Обмены (ССХ, транслокации, кольцевые хромосомы) Метафазы с множественными аберрациями, % 1 Контроль негативный 44,4 55,6 - - 2 Имунофан 66,7 33,3 - - 3 Контроль позитивный 1 Pb(II) 48,2 40,7 11,1 11,1 4 Контроль позитивный 2 Cd(II) 37,5 50 12,5 6,3 5 Контроль позитивный 3 цефтриаксон 65 35 - - 6 Контроль позитивный 4 [Pb(II)+цефтриаксон] 40 45,7 14,3 11,4 7 Контроль позитивный 5 51,4 40,5 8,1 13,5 [И(П)+цефтриаксон] 8 [PЬ(II)+имунофан] 50 38,9 11,1 - 9 [Имунофан+ Pb(II)] 46,7 46,7 6,6 - 10 [И(П)+имунофан] 42,9 57,1 - - 11 [Имунофан+И(П)] 38,5 61,5 - - 12 [Pb+цефтриаксо^+имунофан 42,9 47,6 9,5 - 13 Имунофан+[Pb+цефтриаксон] 47,1 47,1 5,8 - 14 [И(П)+цефтриаксон]+имунофан 60 40 - - 15 Имунофан+[И(П)+цефтриаксон] 42,1 57,9 - 5,3 16 Цефтриаксон+имунофан 54,5 45,5 - - 17 Имунофан+цефтриаксон 50 50 7. Пред- и постобработка имунофаном комплекса [^(П)+цефтриаксон] оказалась одинаково эффективной (К - 48,4 %; 46,8 %). 8. Для комплекса [?Ь(П)+цефтриаксон] максимальная коррекция имунофаном отмечена в варианте предобработки (К - 51,7 %). 9. Антимутагенные свойства имунофана на фоне цефтриаксона достигали максимальных значений в варианте, имитирующем «профилактику», - К - 60,6 %. Обсуждение результатов Результаты эмпирического исследования комплексного воздействия ионов свинца, кадмия и антибиотика цефтриаксона указывают на увеличение выхода ХА по сравнению с раздельной обработкой каждым из исследуемых веществ. С целью антимутагенной коррекции выявленного генетического эффекта возможно применение иммуномодулятора имунофана. Анализируя результаты эксперимента, представленные в табл. 1 и 2, отмечаем, что уровень ХА в негативном контроле составлял (1,5 ± 0,50) % (см. табл. 1, вар. 1). Спектр аберраций включал структурные нарушения на уровне одной хроматиды (одиночные фрагменты 44,4 %, табл. 2, вар. 1) и на уровне идентичных локусов обеих хроматид (парные фрагменты 55,6 %, табл. 2, вар. 1). Эти показатели характеризовали уровень спонтанного мутирования крыс популяции Wistar, что позволило принять коэффициент ВМЭ равным единице (табл. 1, вар. 1). Во всех вариантах эксперимента количество ахроматиновых пробелов существенно не разнилось и составляло 1,2-1,3 %, вследствие чего данное явление можно отнести к особенностям окрашивания хромосом. В варианте 2 (табл. 1) иммуномодулятор имунофан проявил антимутагенные свойства - доля аберраций (0,5 ± 0,29) %, коэффициент защиты генома (К^) - 66,67 %, ВМЭ - 0,3. Данное событие ожидаемо и, вероятно, достигалось за счет усиления антиоксидант-ной защиты организма, о чем заявлено в инструкции по применению препарата. Преобладающим являлись аберрации хроматидного типа - 66,7 %, на фоне парных фрагментов - 33,3 % (табл. 2, вар. 2). Сопоставляя данные вариантов 3-5 табл. 1, представлявших позитивные контроли, находим, что наибольшей мутагенной активностью обладала соль CdCl2. Доля аберрантных метафаз составляла (5,3 ± 0,91) %, а коэффициент ВМЭ по сравнению с негативным контролем вырастал в 3,5 раза. Преобладали аберрации хромосомного типа (50 %); 12,5 % ХА приходилось на хромосомные и хроматидные обмены, которые не наблюдались в негативном контроле, как и клетки с множественными поломками (6,3 % от общего количества аберрантных метафаз, табл. 2, вар. 4). Генотоксический эффект ацетата свинца (позитивный контроль 1) соответствовал (4,5 ± 0,85) % доле аберрантных метафаз с коэффициентом ВМЭ, равным 3. В спектре ХА преобладали поломки хроматидного типа (48,2 %), количество обменов - 11,1 %, метафаз с множественными поломками 11,1 % (табл. 2, 53 Медицинская экология Экология человека 2019.07 вар. 3). Лекарственный препарат цефтриаксон (позитивный контроль 3) обладал менее выраженным коэффициентом ВМЭ (2,2 единицы). Количество ХА составляло (3,3 ± 0,73) %. В спектре аберраций присутствовали одиночные (65 %) и парные (35 %) фрагменты. Клетки с множественными аберрациями не обнаружены. Механизм действия цефалоспоринов основан на торможении синтеза пептидогликана, который составляет основу микробной стенки. Антибиотический эффект цефтриаксона, как и всех цефалоспоринов, направлен и реализуется только в отношении делящихся микроорганизмов, тогда как «покоящиеся» клетки остаются неуязвимыми. Цефалоспорины превосходят другие антибиотики не только по фармакокинетике и спектру антибактериального действия, но и по безопасности [15]. Тем не менее наличие повышенного уровня поломок хроматидного типа (в 1,5 выше, чем в негативном контроле) свидетельствовало о повреждении хромосом преимущественно на стадии двух нитей в S и G2 фазе митоза, когда клетка вступает в фазу активного деления. Этот факт указывает на возможное влияние цефтриаксона в максимальной терапевтической дозе не только на микроорганизмы, но и на делящиеся соматические клетки человека (слабовыраженный мутагенный эффект). Результаты, представленные в вариантах 6 и 7 табл. 1, показывают, что мутагенный эффект при комплексном воздействии [Pb(II) + цефтриаксон] (вар. 6), [^(П)+цефтриаксон] (вар. 7) возрастал по сравнению с моновоздействием каждого из исследуемых веществ. Выраженность мутагенного эффекта соответственно составила 3,9 и 4,1 единицы с преобладанием цитогенетического эффекта в комплексе [^(П)+цефтриаксон]. В варианте рЬ(П)+цефтриаксон] доля ХА (5,8 ± 0,95) %, в варианте [^(П)+цефтриаксон] - (6,2 ± 0,98) %. Спектр хромосомных аберраций в вариантах 6 и 7 табл. 2 представлен аберрациями хромосомного и хроматидного типа. Обмены составляют соответственно 14,3 и 8,1 %; одиночные фрагменты - 40 и 51,4 %, мультиаберрантные клетки - 11,4 и 13,5 %. То есть ХА возникали на протяжении всего клеточного цикла, как в пресинтетической стадии G1, когда хромосома реагировала на воздействие свободных радикалов как однониточная структура (аберрации хромосомного типа), так и на стадии двух нитей в S и G2 стадиях (аберрации хроматидного типа) [21]. Все указанные выше события подтверждены статистическими данными: разница средних (M) между вариантами 2 и 1 значима при р < 0,05; 1 и 3 - при р < 0,001; 1 и 4 - при р < 0,001; 1 и 5 - при р < 0,001; 1 и 6 - при р < 0,001; 1 и 7 - при р < 0,001 (см. табл. 1). Недостатком данного исследования явилась невозможность создать в рамках эксперимента модельную ситуацию, полностью соответствующую многофакторному воздействию химических веществ на живой организм. Схема наших исследований - попытка отразить ситуацию, наиболее характерную для жителей регионов, где в качестве основных загрязнителей выступают тяжелые металлы. Дизайн эксперимента позволил оценить антимутагенный эффект иммуномодулятора имунофана, имитируя либо «профилактическую» защиту генома от воздействия генотоксикантов различного происхождения (предобработка), либо «лечение» (постобработка). Рассматривая данные, представленные в вариантах 8-11 табл. 1, следует отметить, что в постобработке имунофаном ацетата свинца [Pb(II)+имунофан] коэффициент ВМЭ снизился по сравнению с позитивным контролем 1 в 1,5 раза, при коэффициенте защиты генома в 33,3 %, (3,0 ± 0,70) % ХА; р < 0,001. Более эффективным оказался вариант предобработки [имунофан+Pb(II)]: снижение ВМЭ в 1,8 раза; возрастание коэффициента защиты до 44,4 %, (2,5 ± 0,64) % ХА; р < 0,001. По данным литературы, свинец взаимодействует с нуклеотидами, особенно цитидином, накапливается в митохондриях, эндоплазматическом ретикулуме, ядре. Связываясь с сульфидгидрильными фосфатными и карбоксильными группами мембраны, блокирует кальциевые каналы. При этом жесткость клеточной мембраны усиливается, что способствует снижению ее осмотической устойчивости. Рядом авторов отмечается влияние ацетата свинца на гуморальный и клеточный иммунитет [4]. В то же время естественные антитела способны изменять и активно регулировать характер ионных потоков через мембраны, тем самым влияя на функции мембранных ионных каналов. Кроме того, некоторые естественные антитела здоровых доноров обладают ферментативной активностью, вызывая в результате продукции H2O2 антитело-опосредованную клеточную гибель и снижение уровня активных форм кислорода в организме [22, 25, 26]. Возможно, что максимальный антимутагенный эффект имунофана относительно ионов Pb(II), проявленный в варианте предобработки [имунофан + Pb(II)], обусловлен в первую очередь стимуляцией последним выработки лактоферрина, который принимает участие в восстановлении показателей нарушенного гуморального иммунитета. Вероятно, что антимутагенный эффект достигается и за счет стимуляции продукции церу-лоплазмина, активности каталазы, ингибирования распада фосфолипидов (согласно инструкции по применению иммуномодулятора). В вариантах пред- и постобработки - [имунофан + Cd(II)] и [Cd(II) + имунофан] коэффициенты защиты генома одинаково высоки - 58,5 и 56,6 % соответственно. ВМЭ ниже позитивного контроля 2 (вар. 4, табл. 1) в 2,3 раза в обоих случаях; количество ХА (2,2 ± 0,60) и (2,3 ± 0,61) % соответственно. Разница анализируемых показателей статистически значима при р < 0,001 (вар. 10, 11, табл. 1). В результате антимутагенного эффекта, присущего имунофану, в спектре аберраций во всех вариантах (вар. 8-11, табл. 2) мультиаберрантные клетки не обнаруживаются, а в варианте с пред- и постобра 54 Экология человека 2019.07 Медицинская экология боткой имунофаном Cd(II) - не обнаруживаются и клетки с обменами. По литературным данным, кадмий ингибирует ДНК-полимеразу, нарушает синтез ДНК, инактивирует серосодержащие энзимы, является антиметаболитом цинка, замещая его в щелочной фосфатазе, обладает выраженной иммунотоксичностью [4]. Высокий уровень коэффициента защиты, полученный в пред- и постобработке имунофаном кадмия, возможно, обусловлен следующим: во-первых, известно, что тимусные производные потенциируют синтез белка и нуклеиновых кислот в клетках различных органов [5], во-вторых, имунофан является синтетическим гексапептидом, представляющим аналог биологически активного участка 32-36 тимопоэтина, стимулирующего продукцию тимулина (сывороточный фактор). Гормон тимулин продуцируется исключительно тимическими эпителиальными клетками. Это металлопротеидный комплекс, состоящий из неактивного нанопептидного компонента, связанного в эквимолярном отношении с катионом цинка, который и обеспечивает биологическую активность молекулы [6]. С учетом того, что кадмий является антиметаболитом цинка и способен занимать его место и изменять ход процесса обмена веществ, при этом не обеспечивая нормального течения биохимических реакций, вполне возможно, что активность тимулина нарушается. Следовательно, нарушается созревание Т-лимфоцитов, распознавание антигенов, интенсивность фагоцитоза и регенерации ткани. При применении имунофана стимулируется выработка тимулина, что приводит к усилению не только иммунной системы, но и антиоксидантной защиты организма. И как следствие, коэффициент антимутагенной защиты генома имунофаном на фоне хлорида кадмия в 1,3-1,7 раза выше, чем на фоне ацетата свинца. Варианты 12 -15 моделируют ситуацию, когда в клетке встречаются одновременно два генотоксических вещества и иммуномодулятор. Причем в вариантах 12 и 14, представляющих постобработку имунофаном комплексного воздействия тяжелых металлов и цефтриаксона, показана возможность коррекции генотоксического эффекта - «лечение» иммуномодулятором. Анализируя результаты экспериментов, наблюдали ярко выраженный антимутагенный эффект имунофана. Так, коэффициент защиты генома в варианте 12 [?Ь(И)+цефтриаксон] + имунофан, составлял 39,7 % (доля аберрантных метафаз (3,5 ± 0,56) %; р < 0,01), а коэффициент ВМЭ принимал значение 2,3, что 1,7 раза ниже по сравнению с соответствующим позитивным контролем (вар. 6 табл. 1). В варианте 14 [^(П)+цефтриаксон] + имунофан, доля аберрантных метафаз составляла (3,3 ± 0,73) % при р < 0,001, а коэффициент защиты генома на фоне позитивного контроля 7 составил 46,8 %, коэффициент ВМЭ - 2,2, что в 1,9 раза ниже, чем в варианте [^(П)+цефтриаксон]. Таким образом, постобработка имунофаном наиболее эффективна в случае с хлоридом кадмия. Вместе с тем в случае с ацетатом свинца показатели коэффициента защиты генома и ВМЭ достаточно высоки. Возможность «профилактических» мероприятий по антимутагенной коррекции имунофаномгено-токсических эффектов комбинированного воздействия генотоксикантов аргументируют данные, представленные в вариантах 13 и 15 табл. 1. Снижение хромосомных аберраций в вариантах имунофан + [Г^Щ + цефтриаксон] и имунофан + [^(П)+цефтриаксон] наиболее ярко выражено для ацетата свинца - (2,8 ± 0,45) %, при р < 0,001 и (3,2 ± 0,72) %, при р < 0,001 соответственно. Коэффициенты защиты и коэффициенты ВМЭ также послужили подтверждением данного факта: для варианта имунофан + [PЬ(II)+цефтриаксон] К равен 51,7 %, ВМЭ 1,9, что в 2,1 раза ниже позитивного контроля 4; для варианта имунофан + [^(П)+цефтриаксон] К - 48,4 %, ВМЭ снизился и составил 2,1 единицы, что меньше по сравнению с позитивным контролем 5 в 1,9 раза. Таким образом, пред- и постобработка имунофаном комплекса [^(П)+цефтриаксон] оказалась одинаково эффективной, с высокой степенью коэффициента защиты (48,4; 46,8 %) и снижением ВМЭ. Для комплекса [Г^Щ+цефтриаксон] наиболее выраженная коррекция генотоксического эффекта достигалась в варианте предобработки имунофаном (Кз 51,7 %). Анализируя данные табл. 2 (вар. 12-15), замечаем, что коррекция мутагенного эффекта имунофаном комплексов способствовала сокращению в спектре аберраций доли клеток с хромосомными обменами. Так, в вариантах [Г^Щ+цефтриаксо^+имунофан и имунофан + ^^Щ + цефтриаксон] доля клеток с хромосомными обменами снижалась (9,5; 5,8 %) против соответствующего позитивного контроля [Г^Щ + цефтриаксон] (14,3 %). А в случае с пред- и постобработкой имунофаном комплекса [^(П)+цефтриаксон] метафазы с хромосомными обменами отсутствовали вовсе. Количество мультиаберрантных клеток в варианте имунофан+[^(П) + цефтриаксон] сократилось до 5,3 % на фоне 13,5 % в позитивном контроле 5. Во всех остальных случаях мультиаберрантных метафаз не обнаружено. В научной литературе имеются данные о том, что к побочным действиям, вызванным цефалоспоринами, относится возникновение минимально или умеренно выраженных признаков повышения активности аминотрансфераз и щелочной фосфатазы, что свидетельствует о гепатотоксичности препарата [15]. В то же время известно, что тактивин - препарат, представляющий собой комплекс тимических пептидов, экстрагированных из тимуса крупного рогатого скота, обладает способностью снижать до нормы активность АСАТ и АЛАТ, щелочной фосфотазы, исходно увеличенного уровня глюкозы, холестерина, железа (всего 13 параметров) [5]. Как указано выше, имунофан наряду с иммунорегулирующими антиоксидантными свойствами обладает гепатопротекторным действием, 55 Медицинская экология Экология человека 2019.07 вызывает снижение активности трансаминаз и уровень билирубина в сыворотке крови. Положительный эффект от совместного применения антибиотиков и иммуномодулятора выражается также в повышении чувствительности микробной клетки к антибиотику, в результате чего возможно понижение терапевтически эффективной дозы последнего [3]. Результаты, полученные нами в ходе исследования антимутагенного эффекта имунофана на фоне цефтриаксона (вар. 16, 17, табл. 1), могут послужить еще одним аргументом в подтверждение к целесообразности совместного назначения антибиотика и иммуномодулятора при антимикробной терапии. Коэффициент защиты генома при предобработке имунофаном крыс, инъецируемых цефтриаксоном, достигает максимальных значений, полученных в ходе всей серии опытов (60,6 %), в постобработке - 45,5 %. Коэффициент ВМЭ соответственно составил 0,9 и 1,2 единицы, что в первом случае в 2,4 раза ниже, чем в позитивном контроле 3, во втором - в 1,8 раза. Доля аберрантных метафаз составила в предобработке (1,3 ± 0,46) % при р < 0,001, что ниже, чем в негативном контроле; в постобработке - (1,8 ± 0,54) % при р < 0,01. В спектре аберраций обменов мультиаберрантных клеток не зарегистрировано (табл. 2, вар. 16, 17), аберраций хроматидного типа - 54,5 % в варианте постобработки, в варианте с предобработкой - 50,0 %, ХА составили 45,5 и 50,0 % соответственно. Таким образом, статистически значимые результаты, полученные в ходе эксперимента, свидетельствуют о возможности назначения иммуномодулятора имунофана не только в качестве иммуномодулирующего средства, повышающего эффективность антибактериальной терапии, снижения гепатотоксических эффектов, но и с целью антимутагенной коррекции генома при применении антибиотиков. Вывод Увеличение выхода ХА в костном мозге крыс популяции Wistar при комплексном воздействии ионов Pb(II), Œ(II) и антибиотика цефтриаксона по сравнению с раздельной обработкой каждым из исследуемых веществ является результатом нарастания «химического прессинга» на наследственный аппарат клетки. Установлено, что с целью антимутагенной коррекции генотоксического эффекта возможно применение иммуномодулятора имунофана. Известный науке положительный эффект от совместного применения антибиотика и иммуномодулятора, выражающийся в повышении чувствительности микробной клетки к антибиотику, дополнился еще одним аргументом в пользу целесообразности данного тандема - высокая степень антимутагенной коррекции генома имунофаном на фоне цефтриаксона. Результаты эксперимента могут быть использованы при разработке методов защиты цитогенетического здоровья населения, проживающего в экологически неблагоприятных условиях и терапии экологозависимых заболеваний. Авторство Пухаева Е. Г. подготовила первый вариант статьи, участвовала в формировании концепции и дизайна исследования, осуществляла анализ данных вариантов 5, 16 и 17 эксперимента; Скупневский С. В. внес определенный вклад в концепцию исследования и утвердил окончательный вариант статьи, осуществлял анализ данных вариантов 7, 14 и 15 эксперимента; Руруа Ф. К. участвовала в разработке концепции дизайна эксперимента, осуществляла анализ данных вариантов 8, 9, 10 и 11 эксперимента; Фарниева Ж. Г. участвовала в разработке дизайна эксперимента, осуществляла анализ данных вариантов 6, 12 и 13 эксперимента; Бадтиев А. К. участвовал в разработке дизайна эксперимента, осуществлял анализ данных вариантов 1-4 эксперимента.

About the authors

E. G. Pukhaeva

Institute of Biomedical Research, Russian Academy of Sciences; North-Ossetian State University

Email: medgenetika435@yandex.ru
Vladikavkaz, Russia

S. V. Skupnevskii

Institute of Biomedical Research, Russian Academy of Sciences; North-Ossetian State University; North-Ossetian State Medical Academy

Vladikavkaz, Russia

F. K. Rurua

Institute of Biomedical Research, Russian Academy of Sciences

Vladikavkaz, Russia

Zh. G. Farnieva

Institute of Biomedical Research, Russian Academy of Sciences

Vladikavkaz, Russia

A. K. Badtiev

Institute of Biomedical Research, Russian Academy of Sciences

Vladikavkaz, Russia

References

  1. Абилев С. К. Полиморфизм генов как индикатор чувствительности человека к факторам окружающей среды // Материалы объединенного пленума научных советов Минздравсоцразвития Российской Федерации и РАМН по экологии человека и гигиене окружающей среды и по медико-экологическим проблемам здоровья работающих / ред.: Ю.А. Рахманин, Н. Ф. Измеров, г. Москва, 2010. С. 27.
  2. Алборов И. Д., Харебов Г. З., Гасинов С. А. и др. Влияние отходов цветной металлургии на экологию региона // Вестник Международной академии наук экологии, безопасности человека и природы (Вестник МАНЭБ) Herald of the International Academyof Ecology, Manand Nature (Journal MANEB). 2013. Т. 18, № 4. С. 9-13.
  3. Афанасьев С. С., Караулов А. В., Алешкин В. А. и др. Мониторинг антибиотикорезистентности как объективный диагностический и эпидемиологический критерий инфекционного процесса // Иммунология, аллергология, инфектология. 2014. №4. С. 61-69.
  4. Забродский П. Ф., Мандыч В. Г. Иммунотоксикология ксенобиотиков: монография. Саратов: СВИБХБ, 2007. 420 с.
  5. Земсков А. М., Земсков В. М., Земскова В. А., Золоедов В. И. Общеорганизменные эффекты модуляторов иммунитета // Иммунология, аллергология, инфектология. 2015. № 3. С. 14-24.
  6. Зимина И. В., Белова О. В., Торховская Т. И., Арион В. Я., Новоселецкая А. В., Киселева Н. М., Крючкова А. В., Иноземцев А. Н., Сергиенко В. И. Взаимосвязь тимуса и тимических пептидов с нервной и эндокринной системами // Иммунология, аллергология, инфектология. 2015. № 1. С. 18-29.
  7. Малышева А. Г., Рахманин Ю. В., Растянников Е. Г., Козлова Н. Ю. Химико-аналитические аспекты исследования комплексного действия факторов окружающей среды на здоровье населения // Гигиена и санитария. 2015. Т. 94, № 7. С. 5-10.
  8. Орлов В. Н., Чудиновская Г. А., Крюкова Е. Л. Исследование хромосомных наборов млекопитающих: методическое руководство. М.: Наука, 1976. С. 31.
  9. Ракитский В. Н. Проблемы современной гигиены // Гигиена и санитария. 2015. Т. 94, № 15. С. 4-7.
  10. Рамонова Р. А., Чопикашвили Л. В., Пухаева Е. Г., Бобылева Л. А. Цитогенетические эффекты Pb (CH3COO)2 и лекарственного препарата циклофосфана в клетках костного мозга млекопитающих и их коррекция биологически активными веществами настоя Trifoliumpretense // Владикавказский медико-биологический вестник. 2012. Т. 14, № 22. С. 68-73.
  11. Рахманин Ю.А. Актуализация методологических проблем регламентирования химического загрязнения окружающей среды // Гигиена и санитария. 2016. Т. 95, № 8. С. 701-707.
  12. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под ред. Фисенко В. П. М.: Медицина, 2000. С. 98.
  13. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под ред. Хабриева Р У. М.: Медицина, 2005. С. 100-122.
  14. Русаков Н. В. Методологические проблемы неинфекционной эпидемиологии и гигиены при химическом загрязнении окружающей среды // Гигиена и санитария. 2016. Т. 95, № 9. С. 797-800.
  15. Синопальников А. И., Фесенко О. В. Цефалоспорины: спектр активности, направления клинического применения // Российские медицинские вести. 1997. Т. 2, № 3. С. 1-11.
  16. Скупневский С. В., Чопикашвили Л. В., Пухаева Е. Г., Руруа Ф. К. Изучение прооксидантных свойств цианидных комплексов цинка (II) в эксперименте // Владикавказский медико-биологический вестник. 2015. Т. 21, № 32. С. 23-27.
  17. Чопикашвили Л. В., Пухаева Е. Г., Руруа Ф. К., Фарниева Ж. Г., Скупневский С. В. Цитогенетические последствия комплексного воздействия на организм лекарственных препаратов и генотоксикантов окружающей среды и возможность их антимутагенной коррекции // Гигиена и санитария. 2017. Т. 96, № 5. С. 446-451.
  18. Чопикашвили Л. В., Пухаева Е. Г., Руруа Ф. К., Фарниева Ж. Г., Скупневский С. В. Антимутагенный и промутагенный эффекты биологически активных веществ (БАВ) настойки Гинкго билоба, проявленный на фоне воздействия производного 5-нитромидазола «Орнидазол» и ацетата свинца // Владикавказский медико-биологический вестник. 2014. Т.19, № 28. С. 32-36.
  19. Чопикашвили Л. В., Пухаева Е. Г., Руруа Ф. К., Фарниева Ж. Г., Скупневский С. В. Оценка мутагенного эффекта лекарственного препарата немозола на фоне ацетата свинца(П) в тест-системе Drosophilamelanogaster и его коррекция извлечением из листьев Гинкго билоба // Владикавказский медико-биологический вестник. 2013. Т. 16, № 24-25. С. 51.
  20. Чопикашвили Л. В., Рамонова Р. А., Пухаева Е. Г., Руруа Ф. К., Фарниева Ж. Г. Оценка органной специфичности мутагенного эффекта циклофосфана на фоне ацетата свинца и антимутагенной активности настоя клевера лугового (Trifoliumpretense) микроядерным методом // Известия Горского государственного аграрного университета. 2014. Т. 51, № 3. С. 334-341.
  21. Buckton K. E., Evans H. J. (Eds.) Methods for the analysis of human chromosome aberrations // WHO Report. Geneva, 1973.
  22. Guilbert B., Dighiero G., Avrameas S. Naturally occuring antibodies against nine common antigens in normal human sera. I. Detection, isolation, and characterization // J Immunol. 1982. Vol. 128 (6). P. 2779-2787.
  23. Kovacs G., Soudah B., Hoene E. Binucleate cells in a human renal cell carcinoma with 34 chromosomes // Cancer Genet. Cytogenet. 1988. Vol. 31, N 2. P. 211-215.
  24. Lydia V. Chopikashvili, Tatiana I. Tsidaeva, Sergey V. Skupnevsky, Elena G. Pukhaeva, Larissa A. Bobyleva, Fatima K. Rurua. Genetic health of the human population as a reflection of the environment: cytogenetic analysis // Temperate crop science and breading. Pt. 3. Peculiarities of ecology in mountain and foothill areas of North Caucasus and Cytogenetic abnomalities in the human population. U.S., Canada, Central & South America etc.: Apple Academic Phess, Inc.2016. P. 287-302.
  25. Nevinsky G. A., Buneva V. N. Cataiytic antibodies in healthy hummans and patients with autoimmune and viral diseases // J Cell Mol Med. 2003. Vol. 7, N 3. P 265-276.
  26. Poletaev A. B., Stepanyuk V. L., Gershwin M. E. Integrating immunity: the immunculus and self-reactivity // J Autoimmun. 2008. Vol. 30, N 1-2. P 68-73.
  27. Stokes H. W., Gillings M. R. Gene flow, mobile genetic elements and recruitment of antibiotic resistance genes into Gram-negative pathogens // FEMS Microbiol Rev. 2011. Vol. 35, N 5. P 790-819. doi: 10.1111/j.1574-6976.201 1.00273.x.

Statistics

Views

Abstract - 52

Cited-By


PlumX

Dimensions

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2019 Pukhaeva E.G., Skupnevskii S.V., Rurua F.K., Farnieva Z.G., Badtiev A.K.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies