X-CHROMOSOME ABERRATIONS IN PERIPHERAL BLOOD T-LYMPHOCYTES IN CHRONICALLY EXPOSED WOMEN: PILOT STUDY

Full Text

Обоснование

В современном техногенном обществе повышается вероятность контактов населения и профессионалов с источниками ионизирующего излучения, обусловленная неконтролируемым использованием диагностических процедур в медицине, интенсивным использованием воздушного транспорта, аварийными ситуациями, проживанием на территориях, загрязненных радионуклидами, и повышенным фоновым уровнем радиации. Хроническое радиационное воздействие в результате проживания на загрязнённых радионуклидами территориях является серьёзной проблемой, поскольку это приводит к повышенной частоте соматического мутагенеза у населения. Длительное наблюдение за когортой жителей Южного Урала, проживавших на загрязненных радионуклидами территориях, выявило повышенные риски лейкозов и некоторых солидных ЗНО. В разные периоды наблюдений были отмечены изменения в состоянии гемопоэза, иммунитета и др. систем организма [1].

Известно, что соматические мутации начинают появляться в клетках человека с момента первого деления зиготы и продолжают накапливаться на протяжении всей жизни, порождая генетическую гетерогенность в тканях, известную, как соматический мозаицизм. В современных исследованиях показано, что накопление соматических мутаций в течение всей жизни может быть связано с повышенным риском развития рака и других возрастных заболеваний [2-4]. В ряде работ обсуждается, что важную роль в соматическом мутагенезе играют изменения половых хромосом. Например, показано, что потеря Y-хромосомы при раке мочевого пузыря способствует прогрессированию опухоли, худшему ответу опухоли на фармпрепараты, а также уклонению от противоопухолевого иммунитета [5-7].

Важные выводы были получены также из исследований, посвященных изменениям в Х-хромосоме. X-хромосома человека содержит около 150 миллионов пар оснований, что составляет примерно 5 % ДНК в клетках женщин, 2,5 % в клетках мужчин [8]. Важность Х-хромосомы трудно переоценить, ведь она содержит в себе 864 белок-кодирующих гена. Гены, сцепленные с Х-хромосомой, играют ключевую роль в функционировании и гомеостазе иммунной системы и в развитии аутоиммунных процессов [9].

В настоящее время внимание ученых направлено на изучение мозаичной потери Х-хромосомы, которую часто можно наблюдать в лейкоцитах у женщин. Биоинформатический анализ показал, что наиболее часто потери Х-хромосомы выявляют у женщин более старшего возраста, а также имеется положительная связь между потерей Х-хромосомы и риском развития миелоидного лейкоза и восприимчивости к некоторым инфекционным заболеваниям [10].

У жителей Южного Урала, подвергшихся хроническому радиационному воздействию, цитогенетические эффекты оценивали по частоте нестабильных и стабильных хромосомных аберраций, по частоте клеток с микроядрами, оценивали теломерные районы хромосом. [11]. Применение 24-х цветного FISH окрашивания позволило отметить, что у облученных женщин микроядра могут состоять из фрагментов более чем 6 разных хромосом что подтверждает способность ионизирующего излучения приводить к нестабильности генома в отдаленный период после облучения. Кроме того, анализ показал, что в микроядра у женщин наиболее часто попадает Х-хромосома по сравнению с другими хромосомами [12]. А в группе облученных женщин центромерные сигналы Х-хромосом в микроядрах встречались чаще, чем в группе сравнения, что отражает отдаленное влияние ионизирующего излучения на процесс нарушения сегрегации одной из Х хромосом в митозе[11].

Предметом исследования также является и радиочувствительность Х-хромосомы. Например, в исследовании [13] показано, что гамма-излучение ⁶⁰Co в дозах 2 и 4 Гр вызывает фрагментацию 7-ой и Х-хромосомы с одинаковой частотой. Но при этом Х-хромосома менее склонна взаимодействовать с аутосомами, чем хромосома 7. Авторы предположили, что неучастие Х-хромосомы в транслокациях с аутосомами может отражать более обособленное расположение Х-хромосомы в клеточном ядре.

В связи с выше изложенным было решено более детально изучить аберрации Х-хромосомы в Т-лимфоцитах периферической крови у облученных женщин, чтобы понять, с чем связана повышенная элиминация Х-хромосом в микроядра. Для оценки хромосомных перестроек в Х- хромосоме был выбран метод мультицветной флюоресцентной in situ гибридизации бэндов хромосом (mBand). Этот метод позволяет обнаружить внутрихромосомные и межхромосомные перестройки Х-хромосомы, как сложные для выявления другими методами инверсии, так и делеции, кольцевые, дицентрические хромосомы, изохромосомы, реципрокные транслокации.

.

Цель Таким образом, целью исследования являлось изучение аберраций с участием Х-хромосом в Т-лимфоцитах периферической крови у женщин, подвергшихся хроническому радиационному воздействию на Южном Урале.

Материалы и Методы

Характеристика обследованных лиц

Критериями включения облученных лиц в цитогенетическое исследование является отсутствие аутоиммунных, онкологических, острых или хронических в период обострения воспалительных заболеваний; отсутствие приема антибиотиков, глюкокортикоидов и цитостатиков в течение 6 месяцев, предшествующих исследованию, отсутствие рентгенологических обследований в течение 3 месяцев, предшествующих исследованию.

Исследование аберраций Х-хромосомы являлось пилотным и проводилось в ФГБУН УНПЦ РМ ФМБА России впервые.

В пилотное исследование было включено 5 женщин, подвергшихся хроническому радиационному воздействию на Южном Урале. Их средний возраст составил 74,0±0,8 лет (диапазон 72 – 77 лет), средняя кумулятивная доза на ККМ составила 1,35±0,30 Гр (диапазон 0,8 – 2,4 Гр). В группу сравнения вошли 5 женщин, средний возраст которых составил 66,3±1,2 лет, средняя кумулятивная доза на ККМ составила 0,01±0,006 Гр (диапазон 0 - 0,03 Гр). Группа сравнения представлена лицами, проживавшими в сходных социально-экономических условиях, с накопленной дозой облучения на ККМ менее 70 мГр за весь период наблюдения.

Выбор облученных людей, которые могут войти в группу обследованных лиц был произведен при помощи программного комплекса «REGISTR» Единой информационной системы ФГБУН УНПЦ РМ ФМБА России [14]. Индивидуальные дозы облучения на ККМ были рассчитаны по TRDS-2016 сотрудниками биофизической лаборатории [15].

Соблюдение этических стандартов: исследование одобрено этическим комитетом УНПЦ РМ. У лиц, участвующих в цитогенетических исследованиях, было получено информированное согласие на забор образцов крови и дальнейшие исследования.

Получение метафазных хромосом из Т-лимфоцитов периферической крови человека

Забор венозной крови производили из локтевой вены в вакутейнер с гепарином. Цитогенетические препараты из Т-лимфоцитов периферической крови доноров получали согласно протоколу, который включает четыре последовательных этапа: культивирование клеток до стадии метафазы, гипотоническую обработку метафазных клеток, фиксацию метафазных пластинок и собственно приготовление препаратов хромосом. Культивирование Т-клеток проводили в стерильных бакпечатках. Клетки культивировали в СО₂ инкубаторе при 37,5⁰С в течение 54 часов. За 3 часа до окончания культивирования в культуру вводили раствор колцемида в итоговой концентрации 0,03 мг/мл (ПанЭко).

Для гипотонической обработки клеток приливали теплый 37⁰С раствор КСl (0,55 %), ресуспендировали осадок и оставляли на 30 мин в термостате при 37⁰С. Затем смесь центрифугировали, осторожно удаляли супернатант, ресуспендировали осадок и приливали холодный 4⁰С свежеприготовленный фиксатор (3 части спирт этиловый и 1 часть ледяная уксусная кислота. Клетки проводили через фиксатор три или четыре раза.

Для получения препаратов хромосом пипеткой раскапывали смесь на охлажденное стекло (2 капли). Стекло сушили на термоплато при 40 ⁰С. Качество препарата проверяли при фазово-контрастной микроскопии. После высыхания препаратов проводили флуоресцентную гибридизацию in situ.

Флуоресцентная гибридизация in situ

Для окраски препаратов с целью идентификации аберраций с участием Х-хромосомы использовали зонды производства компании MetaSystems - XCyte X, Chromosome X mBAND probe (кат. Номер D-0223-030-DI).

Метод mBAND (multicolor banding) основан на гибридизации частей хромосомы зондами, меченых различными флуорохромами, вдоль длины хромосомы, таким образом, что зонды гибридизуются частично перекрываясь на отдельных участках хромосом. Характерная многоцветная полосчатая картина mBAND создается путем количественной оценки соотношения интенсивности флуоресценции вдоль хромосомы. Эти соотношения уникальны и визуализируются в виде псевдоцветов, специфичных для каждой полосы (рис 1). mBAND предоставляет информацию, которая позволяет проводить точный анализ даже очень сложных меж- и внутрихромосомных аберраций [16].

Окрашивание препаратов происходило в соответствии с протоколом производителя. Проводилась денатурация ДНК на хромосомных препаратах, денатурация и гибридизация ДНК-зондов, постгибридизационная отмывка и контр-окрашивание DAPI/antifade. Получение оцифрованных изображений метафазных клеток

Препараты оцифровывались с помощью автоматической системы для поиска и съемки метафаз Metafer (Metasystems, Германия). Получали изображения качественных метафаз с использованием иммерсионного объектива х63.

Анализ препаратов

Работа с оцифрованными изображениями проводилась с помощью программного обеспечения Isis (Metasystems, Германия). Для исследования выбирались метафазы, содержащие Х - хромосомы без артефактов. Анализировали Х-хромосомы в соответствии с расположением спектров возбуждения флюорохромов, как показано на рис.1. На рисунке 2 представлены Х-хромосомы, окрашенные методом mBAND (без аберраций).

В работе учитывали инверсии хромосом (хромосомные и хроматидные), простые транслокации – реципрокные и нереципрокные, дицентрические хромосомы, изохромосомы, а также делеции. На рисунке 3б одна из гомологичных Х-хромосом содержит перицентрическую инверсию 46 XX, inv X (p11.4; q26). На рисунке 3в представлена хроматидная инверсия. На рисунке 4 представлена дицентрическая Х - хромосома (скорее всего образованная из 2-х гомологичных Х-хромосом). На рисунке 5 представлена реципрокная аберрация с участием Х-хромосомы.

Также в работе было проанализировано количество анеуплоидных метафаз по Х-хромосоме: норма (XX) или анеуплоидия по Х-хромосоме (Х или ХХХ).

Статистическая обработка данных

Для описания частоты хромосомных аберраций с участием X-хромосомы использовались стандартные методы описательной и сравнительной статистики. Для описания данных использовались средние частоты и ошибка среднего. Для сравнения групп использовался U-критерий Манна-Уитни. Различия признавали статистически значимыми при p <0,05.

Частота хромосомных аберраций рассчитывалась на число геном-эквивалентов (GE). Оценка коэффициента перехода от числа просчитанных клеток к геномным эквивалентам рассчитывалась стандартным образом, который подробно описан в работе [17]. Для этого использовалась формула (1):

                                                                                         (1)

где f_x– доля в геноме окрашенной пары хромосом.

Доля ДНК в Х-хромосоме в женском геноме человека представлена в работе [17] и составляет 0,0508.

Также на частоту транслокаций оказывает влияние возраст. Мета-анализ фоновых частот транслокаций в зависимости от возраста был приведен в работе [18]. Для оценок использовались данные по здоровым донорам. Расчетные значения фоновых частот транслокаций на 1 GE для доноров различного возраста рассчитывались по формуле (2):

)                                                                        (2)

Для статистического анализа использовалась статистическая программа Past 4.01 (Oyvind Hammer; Великобритания).

 

Результаты

В таблице 1 представлены индивидуальные частоты аберраций Х-хромосом. Как видно из таблицы, частота инверсий Х-хромосомы низкая: у большинства доноров (90%), хромосомных инверсий не выявлено. У одной облученной женщины с самой высокой дозой на ККМ из выборки - 2,44 Гр, встретилось 3 инверсии Х-хромосомы: 2 из них были определены как клональные и были посчитаны за одну, т.к. имели одинаковые точки разрыва inv (X) (p11.4; q26), то есть итого было обнаружено 2 разные хромосомные инверсии (точки разрыва второй – inv(X) (p11.2; q24). Также у облученных женщин были отмечены инверсии хроматидного типа, которые выглядели как переворот одной из хроматид относительно центромеры на 180°.

В группе сравнения хромосомные аберрации были представлены простыми транслокациями у 2-х доноров. В группе облученных лиц хромосомные аберрации были представлены простыми транслокациями (4 донора), изохромосомой (1 донор) (рис. 6), дицентриком (1 донор), делеции (2 донора), кольцевой хромосомой (рис. 7)– 1 донор. Средняя частота всех аберраций в группе облученных лиц составила 0,100±0,036, что статистически значимо выше, чем в группе сравнения – 0,019±0,011 (U=3, р=0,0476).

Также при анализе препаратов у одной облученной женщины встретилась клетка с измененной Х-хромосомой, похожей на хромотрипсис (рис. 8). На рисунке видно, что одна из гомологичных Х-хромосом нормальная. А другая изменена по своей морфологии, и с учетом распределения спектров окрашивания флюорохромов, как будто была фрагментирована и беспорядочно собрана.

В таблице 2 представлена частота анеуплоидных клеток по Х-хромосоме. Из таблицы 2 видно, что имеется вариабельность в меж индивидуальных значениях частоты встречаемости анеуплоидных клеток по Х-хромосоме. Средняя частота анеуплоидии по Х-хромосоме у облученных женщин несколько выше, но не достигает статистически значимых различий (р<0,05).

 

Обсуждение

В настоящей работе мы оценили частоту аберраций с участием Х-хромосомы у женщин, подвергшихся хроническому радиационному воздействию вследствие проживания на загрязненных радионуклидами территориях. В исследовании применяли высокотехнологичный цитогенетический метод mBAND, позволяющий выявлять внутри и межхромосомные аберрации. Результаты исследований показали, что у облученных женщин частота аберраций с участием Х-хромосомы выше, чем в группе сравнения. Также отмечено, что у облученных женщин более разнообразен качественный состав аберраций: инверсии, простые транслокации, кольцевая хромосома, изохромосома, дицентрическая хромосома и делеции, тогда как в группе сравнения встретились только простые транслокации. Интересной находкой является то, что у одной из женщин предположительно найдена клетка с хромотрипсисом Х-хромосомы. Полученные в данном исследовании результаты могут указывать на более интенсивный мутационный процесс у женщин, подвергшихся хроническому радиационному воздействию.

Также у облученных женщин были отмечены инверсии хроматидного типа, которые выглядели как переворот одной из хроматид относительно центромеры на 180°. Это явление не описано в литературе и сложно сказать является ли это инверсией или нарушением сцепления хроматид центромерным белковым комплексом. Механизм таких переворотов также является неочевидным, и, возможно, связан с когезией хроматина во время репликации ДНК. Также отметим, что подобные инверсии нечастое явление, поскольку встретились по 1 разу у 2-х облученных доноров (2 переворота на 3118 проанализированных клеток – 0,064%).

Частота анеуплоидных клеток по Х-хромосоме у облученных женщин не отличается от группы сравнения, но даже на такой небольшой выборке видно, что имеются межиндивидуальные различия. Поэтому для того, чтобы понять процент людей с повышенной анеуплоидией соматических клеток необходимо расширить выборку. 

Полученные результаты сопоставимы с литературными данными, указывающими на повышенную частоту хромосомных аберраций у облученного населения [19-21]. Считается, что хромосомные аберрации возникают непосредственно в ранние сроки после радиационного воздействия, часть из них (нестабильные аберрации) элиминируется в результате нарушения прохождения клеткой митоза, а другая часть (стабильные аберрации) менее подвержена элиминации и остается в клетках. На основе нестабильных хромосомных аберраций проводится биоиндикации радиационного воздействия в ранний период облучения, а на основе стабильных хромосомных аберраций проводится ретроспективная биоиндикации радиационного воздействия [17]. Еще одной причиной, вносящий вклад в повышенный уровень хромосомных аберраций у облученного населения в отдаленные сроки, может быть радиационно-индуцированная нестабильность генома. Механизмы формирования радиационно-индуцированной нестабильности генома остаются не изучеными, но в литературе обсуждается, что причиной могут быть некие предмутационные состояния, связанные с эпигенетическими изменениями хроматина [22].

Как показано, радиационное воздействие способствует накоплению хромосомных мутаций в клетках. В тоже время некоторые мутации могут дать относительное преимущество в приспособленности одной стволовой клетке и ее потомству по сравнению с окружающими клетками, что может привести к прогрессирующей экспансии клона, что является фактором риска для дальнейшего приобретения мутаций и клональной эволюции клеток. Известно, что клональное кроветворение, и в целом соматический мозаицизм характерны для стареющего организма [23]. В настоящее время с соматическим мозаицизмом связывают многие возраст-зависимые заболевания, такие как онкологические, сердечно-сосудистые, нейродегеративные, аутоиммунные [24-26].

Таким образом, исследование аберраций с участием Х-хромосом в Т-лимфоцитах периферической крови у женщин, подвергшихся хроническому радиационному воздействию на Южном Урале является перспективным, т.к. изучение влияния ионизирующей радиации на клетки является актуальной научной проблемой, которая может стать основой для решения прикладных задач, напрямую касающихся здоровья нации.

 

Заключение

Таким образом, исследование аберраций с участием Х-хромосом в Т-лимфоцитах периферической крови у женщин, подвергшихся хроническому радиационному воздействию на Южном Урале является перспективным, т.к. изучение влияния ионизирующей радиации на клетки является актуальной научной проблемой, которая может стать основой для решения прикладных задач, напрямую касающихся здоровья нации.

About the authors

Iana Krivoshchapova

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Уральский научно-практический центр радиационной медицины

Author for correspondence.
Email: yana_ho@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2555-2616
SPIN-code: 9194-3604
Scopus Author ID: 58854545300

лаборатория радиационной генетики, младший научный сотрудник

Russian Federation

Yulia Akhmadullina

Urals Research Center for Radiation Medicine of FMBA of Russia

Email: akhmadullina.yul@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-4394-2228
SPIN-code: 3511-3838
Scopus Author ID: 57211487594

кандидат биологических наук, и.о. зав. лабораторией радиационной генетики

Russian Federation, г. Челябинск, ул. Воровского, 68-А

References

Supplementary files