Activity of lipid peroxidation processes and metal content in blood serum of pubertal children living in areas with different degrees of anthropogenic load

Full Text

ВВЕДЕНИЕ. Способность к адаптации является важнейшим свойством живых систем. Адаптация, как приспособление организма к меняющимся условиям среды, осуществляется  системно и, в первую очередь, на клеточном уровне, поэтому адаптивный эффект реализуется, как правило, через мембранные системы клеток, а их состояние является стартовым звеном в цепи приспособительных реакций, при этом повреждающие эффекты неблагоприятных факторов неизбежно отражаются на целостности и устойчивости клеточных мембран, поэтому продукты окисления липидного слоя, попадая в плазму крови, формируют повышенный их уровень, легко оцениваемый в динамике [1].

В последние годы, возрос интерес к поиску маркёров популяционной дезадаптации, в частности, к процессам перекисного окисления липидов (ПОЛ), как универсального механизма повреждения биологических мембран [2, 3]. При этом уровень образующегося в результате малонового диальдегида (МДА), считается неспецифическим маркёром адаптационных возможностей организма, а отмеченная многими исследователями [4-8] тесная взаимосвязь между соотношением ряда металлов и балансом окислительной и антиоксидантной систем открывает возможности к получению биологических маркёров для практической реализации моделей популяционного контроля качества жизни населения крупных урбоэкосистем.

 

ЦЕЛЬ

Целью исследования явилось определение возможной взаимосвязи между статусом урбанизированной среды, активностью процессов ПОЛ и содержанием металлов в крови детей-подростков. Выявление такой взаимосвязи необходимо для построения единой системы маркёров адаптационного резерва организма человека, проживающего в условиях различной интенсивности факторов воздействия.

 

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служила сыворотка крови потенциально-здоровых (не имеющих хронических заболеваний на момент обследования) детей-подростков в пубертатном возрасте 12-14 лет, проживающих на территориях с различной антропогенной нагруженностью урбоэкосистем: городской среды (г. Казань) и сельской местности (Высокогорский и Арский районы Республики Татарстан).

Всего было обследовано 48 человек. Распределение обследуемых по участкам исследования и половой состав групп были представлены схожим образом: 25 подростков из города - 11 мальчиков и 14 девочек (44 и 56%); 23 подростка из сельской местности - 9 мальчиков и 14 девочек (39 и 61%). У детей фиксировался рост, вес и определялась площадь поверхности тела по Мостеллеру [9].

Забор крови проводился утром натощак из локтевой вены. Кровь центрифугировали до получения сыворотки, которую отбирали для анализа.

В настоящем исследовании использовался общепринятый способ определения концентрации малонового диальдегида (МДА) по реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) [10, 11]. Растворение ТБК проводят в присутствии тритона Х-100, препятствующего выпадению ТБК в осадок, для стабилизации триметинового комплекса добавляется трилон Б, а денатурированные сывороточные белки растворяются смесью этанола с хлороформом в соотношении (7:3)[12].

В основе метода лежит реакция между малоновым диальдегидом (МДА) и тиобарбитуровой кислотой (ТБК), которая при высокой температуре и в кислой среде протекает с образованием окрашенного в розовый цвет триметинового комплекса, содержащего одну молекулу МДА и две молекулы тиобарбитуровой кислоты. Максимум поглощения комплекса приходится на 532 нм.

Рабочий раствор ТБК готовили путем растворения навески ТБК 864 мг в 100 мл смеси, содержащей 1% раствор тритона Х-100 и 8,2 М раствор этанола. Остальные растворы готовили на бидистиллированной воде.

К 1,5 мл сыворотки последовательно добавляли 0,5 мл 1% раствора тритона Х-100, 0,2 мл 0,6 М раствор HCl и 0,8 мл 0,06 М рабочий раствор ТБК. Смесь нагревали в кипящей водяной бане в течение 10 мин. Охлаждение проводили при 15^oC в течение 30 мин. Для стабилизации окраски добавляли 0,2 мл 5 мМ раствор трилона Б и доводили объем до 10 мл смесью этанола с хлороформом в соотношении 7:3. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре СФ-46 при 532 нм, в стеклянной кювете шириной 1 см. Контролем служил холостой образец, в котором вместо сыворотки добавляли бидистиллированную воду. В расчетах МДА использовали молярный коэффициент экстинкции, равный 0,156 мкМ^-1 см^-1.

Расчет концентрации малонового диальдегида в сыворотке крови проводят по формуле:

 

где D₁ - оптическая плотность образца с сывороткой; D₂ - оптическая плотность контроля; U₁ - объем сыворотки, взятой на определение, 1,5 мл; U₂ - конечный объем смеси, 10 мл; L - длина кюветы, 1 см; ϵ=0,156 коэффициент молярной экстинкции комплекса малоновый диальдегид-ТБК в л/мкмоль/см. Результат представлен в мкмоль/л.

В полученной сыворотке крови методом атомно-абсорбционной спектроскопии определялось содержание железа (Fe), меди (Cu), цинка (Zn), стронция (Sr) и свинца (Pb).

Zn определялся по резонансной линии 213,9 нм с пределом обнаружения 1,5 мкг/л, Cu – 324,8 нм с пределом обнаружения 1 мкг/л, Fe – 248,3  нм с пределом обнаружения 5 мкг/л, Sr – 460,7 нм с пределом обнаружения 3 мкг/л, Pb – 283,3 нм с пределом обнаружения 7 мкг/л. Свинец определялся на безэлектродной высокочастотной лампе, остальные металлы – на лампах с полым катодом.

Калибровочные растворы готовились на основе ГСО общепринятым методом. Измерение концентраций Zn, Cu, Fe, Sr осуществлялось непосредственно в сыворотке крови с предварительным разведением 1:2 бидистиллированной водой. Определение свинца осуществлялось после осаждения белков. Для этого к 1,5 мл сыворотки крови добавляли 0,75 мл 1,5% раствор HCl и инкубировали в течение 1 ч при 37^oС. После гидролиза белков их осаждали 0,75 мл 20% ТХУ (трихлоруксусной кислотой) и центрифугировали в течение 10 мин при 1500 об/мин, разведение при этом также составило 1:2. Надосадочную жидкость использовали для анализа [13]. Результат представлен в мг/л.

Распределение полученных значений МДА и концентраций металлов оценивалось статистически (Statistica 6): по группам исследования рассчитывались средние значения (M) и стандартные отклонения (SD), статистическая значимость различий оценивалась по U-критерию Манна-Уитни (Mann–Whitney U test), корреляционные взаимосвязи оценивались методом Пирсона. Для оценки значимости отдельных показателей был проведен дискриминантный анализ и использован метод множественной регрессии.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ

Полученные результаты исследования уровней МДА и металлов в сыворотке крови, распределенные по участкам и группам исследования, представлены в Таблице 1.

Содержание МДА по всем наблюдениям колебалось в пределах 0,629-1,995 мкмоль/л, составив в среднем 1,059±0,368 мкмоль/л (M±SD); cодержание Zn - в пределах 0,444-1,310 мг/л, в среднем 0,787±0,187 мг/л; содержание Cu - 0,413-1,811 мг/л, среднее содержание составило 0,921±0,303 мг/л; концентрации Fe - в пределах 0,417-2,900 мг/л, среднее содержание 1,434±0,647 мг/л; концентрации Sr - 0,053-0,222 мг/л, среднее содержание Sr в сыворотке крови составило 0,117±0,050 мг/л; концентрации свинца изменялись в пределах 0,010-0,071 мг/л, составив в среднем 0,045±0,014 мг/л.

Оценка нормальности распределения показала, что распределение рассматриваемых значений близко к нормальному (критерий Шапиро-Уилка для всех показателей W>0,9).

Оценивая результаты, представленные в табл. 1, следует отметить более высокие значения концентраций МДА у городских детей, вне зависимости от пола. При этом общая тенденция такова, что у девочек всегда отмечались более высокие значения МДА по сравнению с мальчиками, однако статистически значимые различия были только среди городских детей.

Таблица 1. Результат исследования содержаний МДА (мкмоль/л) и металлов (мг/л) в сыворотке крови (M±SD)

Table 1. Result of MDA (μmol/L) and metals (mg/L) content in serum (M±SD)

Примечание: выделенные и отмеченные «¹» указывают на статистически значимые (p<0,05) более высокие значения при внутригрупповом сравнении мальчиков и девочек; отмеченные «²» - (p<0,01) при межгрупповом сравнении городской и сельской местности

 

По-видимому, одним из факторов повышения активности ПОЛ у девочек является их большая физиологическая зрелось, сопровождаемая увеличением площади тела (1,53 м² против 1,42 м² у мальчиков), при этом нами отмечена корреляционная взаимосвязь между МДА и площадью тела (r=0,32; p<0,05) (табл. 2). Следует отметить, что средний возраст девочек и мальчиков был примерно одинаковым: 12,7±0,89 лет у девочек и 12,8±0,93 лет у мальчиков.

Таблица 2.  Корреляционная матрица, отражающая взаимосвязи между различными показателями (выделены статистически значимые коэффициенты, p<0,05)

Table 2. Correlation matrix reflecting interrelations between different indicators (statistically significant coefficients are highlighted, p<0,05)

Еще одной интересной закономерностью является более низкое содержание Zn в группе городских детей, т.е. при высоких уровнях МДА. Корреляционный анализ подтверждает эту взаимосвязь, отмечая наличие высокой статистически значимой отрицательной корреляции между концентрациями Zn и содержанием МДА в сыворотке крови (табл. 2).

При этом, именно для девочек характерны низкие концентрации Zn и более высокие концентрации Fe при высоких значениях МДА. Таким образом, низкие значения концентрации Zn, сопровождающиеся высоким уровнем сывороточного Fe, являются вторым фактором повышения активности ПОЛ.

Обобщенная картина изменчивости концентраций МДА в сыворотке крови в зависимости от участка исследования, пола подростков и концентраций Zn в крови, представлена на рис. 1. На рисунке следует обратить внимание на более выраженное снижение МДА при увеличении концентраций Zn у городских подростков.

Рис 1. Изменчивость концентраций МДА в сыворотке крови подростков в разных экспериментальных группах

Fig. 1. Variability of MDA concentrations in adolescent serum in different experimental groups

 

Другой важной особенностью является повышенное содержание Pb в сыворотке крови городских детей, статистически более высокое, чем в крови сельских подростков (табл. 1). Кроме того, отмечена высокая прямая корреляционная взаимосвязь между концентрациями этого металла и МДА, а также высокая обратная корреляция с концентрациями Zn, что позволяет рассматривать высокие уровни Pb в качестве одного из элементов активации ПОЛ.  Так как, статистически значимых различий по содержанию Pb между мальчиками и девочками отмечено не было, можно предположить, что содержание этого металла обусловлено только особенностями урбоэкосистемы.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

По результатам нашего исследования, совершенно неактивным металлом, как в контексте взаимосвязи с МДА, так и в связи с содержанием других металлов, является Sr. Не отмечено никаких значимых изменений его концентраций. В то же время, для Cu отмечены достаточно заметные корреляции, как с уровнями МДА, так и со многими металлами, хотя статистически значимых различий средних значений концентраций в разных группах отмечено не было. Общая тенденция такова, что изменчивость концентраций Cu повторяет изменчивость Fe, но выражена значительно слабее. Возможно, что это обусловлено сочетанием известного антагонизма Cu и Zn, с синергизмом Cu и Fe, в результате чего формируется сложная картина взаимосвязей, трудно интерпретируемая на небольших рядах наблюдений.

Тем не менее, при построении модели множественной регрессии с пошаговым включением признаков (Forward stepwise) именно значения Cu, вместе с Zn и площадью тела представляют наибольшую статистическую значимость (табл. 3).

Таблица 3. Параметры множественной регрессии, объединяющей значения концентраций Zn, Cu и величину площади поверхности тела с уровнем значений МДА в сыворотке крови

Table 3. Parameters of multiple regression combining Zn, Cu concentrations and body surface area with serum MDA levels

Из табл. 3 следует, что нормализованные весовые коэффициенты (Beta) значений Cu превышают даже показатель площади тела, при сопоставимой ошибке, в большей степени уравновешивая в модели влияние изменчивости Zn.

Для оценки классифицирующего вклада тех или иных показателей при сопоставлении их распределения между двумя группами обследуемых - из города и сельской местности, был использован дискриминантный анализ, который в режиме пошагового включения признаков позволил выделить два главных показателя, наиболее сильно влияющих на классификацию наблюдений (их отнесение к той или иной урбоэкосистеме): значения МДА и Pb (табл 4).

Таблица 4. Главные классифицирующие показатели, выделенные дискриминантным анализом

Table 4. Main classifying indicators highlighted by discriminant analysis

Значения именно этих показателей способны с высокой долей вероятности указать, к какой группе (городские или сельские подростки) относится то или иное наблюдение. Соответственно, подтверждается предположение о том, что содержание Pb обусловлено особенностями урбоэкосистемы, а активность процессов ПОЛ у детей-подростков может значительно меняться в зависимости от степени урбанизированности окружающей среды, статистически значимо возрастая в городских условиях.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, проведенное исследование позволяет отметить наличие взаимосвязи между концентрациями МДА и некоторых металлов (Zn, Fe, Cu) в сыворотке крови. Отмечены более высокие концентрации МДА в сыворотке крови детей, проживающих в городской среде, по сравнению с сельскими жителями (p<0,01).

Факторами повышения активности ПОЛ у подростков являются более высокие значения площади поверхности тела, низкие концентрации Zn и более высокие концентрации Cu и Fe в сыворотке крови, а также проживание в городской урбоэкосистеме и/или при повышенных концентрациях свинца в сыворотке крови. Взаимосвязь активности процессов ПОЛ с уровнем содержания металлов особенно ярко проявляется в группе городских подростков, при этом, у девочек-подростков отмеченные тенденции выражены еще сильнее, что позволяет рассматривать их как таргетную группу при проведении скрининговых исследований оксидативного стресса популяции в целом.

В результате проведенного исследования выявлен ряд закономерностей, позволяющих актуализировать важные взаимосвязи между металлами и МДА в рамках общей системы маркёров адаптационного резерва организма человека, проживающего в условиях различной интенсивности факторов воздействия.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирование. Исследование выполнено в рамках реализации темы государственного задания Научные исследования проведены при финансовой поддержке Минобрнауки России в рамках исполнения обязательств по Соглашению номер № 075-03-2025-335 от «16» января 2025 г., номер темы FZSU–2023–0005, (рег. номер 123030100016-5).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: Ю.А. Тунакова – подготовка протокола исследования, , подготовка первого варианта статьи; В.С. Валиев – сбор и анализ данных, статистический анализ, интерпретация результатов; Р.И. Файзуллин -  подготовка обзора литературы, правки текста. Все авторы – утверждение окончательной редакции статьи.

About the authors

Yulia Alekseevna Tunakova

Author for correspondence.
Email: juliaprof@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8826-8639
SPIN-code: 5247-9698

Ph.D. in Chemistry, Professor, Head of the Department of General Chemistry and Ecology

Russian Federation

Rashat Iskandarovich Faizullin

Email: RIFajzullin@kpfu.ru
ORCID iD: 0000-0001-6033-6356
SPIN-code: 4818-6504

Candidate of Medical Sciences, Associate Professor, Deputy Director for Scientific Activity

Vsevolod Sergeyevich Valiev

Email: podrost@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8848-5326
SPIN-code: 6871-9839

Senior Researcher of the Laboratory of Biogeochemistry

References

Supplementary files