Activity of lipid peroxidation processes and metal lipid peroxidation and serum metal levels in adolescents in regions with various degrees of man-induced load

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Способность к адаптации является важнейшим свойством живых систем. Адаптация как приспособление организма к меняющимся условиям среды осуществляется системно и, в первую очередь, на клеточном уровне, поэтому адаптивный эффект реализуется, как правило, через мембранные системы клеток, а их состояние является стартовым звеном в цепи приспособительных реакций, при этом повреждающие эффекты неблагоприятных факторов неизбежно отражаются на целостности и устойчивости клеточных мембран, поэтому продукты окисления липидного слоя, попадая в плазму крови, формируют повышенный их уровень, легко оцениваемый в динамике [1].

В последние годы возрос интерес к поиску маркёров популяционной дезадаптации, в частности, к процессам перекисного окисления липидов (ПОЛ) как универсального механизма повреждения биологических мембран [2, 3]. При этом уровень образующегося в результате малонового диальдегида (МДА) считается неспецифическим маркёром адаптационных возможностей организма, а отмеченная многими исследователями [4–8] тесная взаимосвязь между соотношением ряда металлов и балансом окислительной и антиоксидантной систем открывает возможности к получению биологических маркёров для практической реализации моделей популяционного контроля качества жизни населения на территориях с высокой степенью антропогенной нагрузки.

Цель исследования. Определение возможной взаимосвязи между статусом урбанизированной среды, активностью процессов ПОЛ и содержанием металлов в крови детей в пубертатном возрасте. Выявление такой взаимосвязи необходимо для построения единой системы маркёров адаптационного резерва организма человека, проживающего в условиях различной интенсивности факторов воздействия.

МЕТОДЫ

Объект исследования

Объектом исследования служила сыворотка крови потенциально здоровых (не имеющих хронических заболеваний на момент обследования) детей в пубертатном возрасте (12–14 лет), проживающих на территориях с различной антропогенной нагруженностью урбоэкосистем: в городской среде (Казань) и в сельской местности (Высокогорский и Арский районы Республики Татарстан).

Материал исследования

Обследовано 48 человек. Распределение обследуемых по территории проживания и половому составу представлено следующим образом: 25 детей из города (11 мальчиков и 14 девочек; 44 и 56% соответственно); 23 — из сельской местности (9 мальчиков и 14 девочек; 39 и 61% соответственно). У детей фиксировали рост, вес и определяли площадь поверхности тела по R.D. Mosteller [9]. Исследования проводили с ноября 2024 по февраль 2025. Для анализа использовали сыворотку крови.

При формировании групп учитывали следующие факторы: общая возрастная группа, разделение по полу (мальчики и девочки) и месту жительства (квартира в городе, частный сельский дом), обязательное отсутствие в анамнезе хронических заболеваний, полная семья. Исследование носило рекогносцировочный характер, поэтому подробного анкетирования не проводили.

Исследование одобрено локальным этическим комитетом Казанского (Приволжского) федерального университета (протокол № 50 от 26.09.2024).

Определение малонового диальдегида

В настоящем исследовании использовали общепринятый способ определения концентрации МДА по реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) [10, 11]. Растворение ТБК проводят в присутствии тритона Х-100, препятствующего выпадению ТБК в осадок, для стабилизации триметинового комплекса добавляется трилон Б, а денатурированные сывороточные белки растворяются смесью этанола с хлороформом в соотношении 7:3 [12].

В основе метода лежит реакция между МДА и ТБК, которая при высокой температуре и в кислой среде протекает с образованием окрашенного в розовый цвет триметинового комплекса, содержащего одну молекулу МДА и две молекулы ТБК. Максимум поглощения комплекса приходится на 532 нм.

Рабочий раствор ТБК готовили путём растворения навески ТБК 864 мг в 100 мл смеси, содержащей 1% раствора тритона Х-100 и 8,2 М раствора этанола. Остальные растворы готовили на бидистиллированной воде.

К 1,5 мл сыворотки последовательно добавляли 0,5 мл 1% раствора тритона Х-100, 0,2 мл 0,6 М раствора HCl и 0,8 мл 0,06 М рабочего раствора ТБК. Смесь нагревали в кипящей водяной бане в течение 10 мин. Охлаждение проводили при 15 °C в течение 30 мин. Для стабилизации окраски добавляли 0,2 мл 5 М раствора трилона Б и доводили объём до 10 мл смесью этанола с хлороформом в соотношении 7:3. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре СФ-46 при 532 нм в стеклянной кювете шириной 1 см. Контролем служил холостой образец, в который вместо сыворотки добавляли бидистиллированную воду. В расчётах МДА использовали молярный коэффициент экстинкции, равный 0,156 мкМ⁻¹·см⁻¹.

Расчёт концентрации МДА в сыворотке крови проводят по формуле:

$С{}_{МДА}=\frac{D_1–D_2)\times U_2}{\in \times L\times U1}$,

где D₁ — оптическая плотность образца с сывороткой; D₂ — оптическая плотность контроля; U₁ — объём сыворотки, взятой на определение, 1,5 мл; U₂ — конечный объём смеси, 10 мл; L — длина кюветы, 1 см; ∈=0,156 — коэффициент молярной экстинкции комплекса МДА–ТБК в л/мкмоль/см. Результат представлен в мкмоль/л.

Определение содержания металлов

В полученной сыворотке крови методом атомно-абсорбционной спектроскопии на приборе AAnalyst 400 (Perkin Elmer, США) определяли содержание железа (Fe), меди (Cu), цинка (Zn), стронция (Sr) и свинца (Pb).

Zn определяли по резонансной линии 213,9 нм с пределом обнаружения 1,5 мкг/л, Cu — 324,8 нм с пределом обнаружения 1 мкг/л, Fe — 248,3 нм с пределом обнаружения 5 мкг/л, Sr — 460,7 нм с пределом обнаружения 3 мкг/л, Pb — 283,3 нм с пределом обнаружения 7 мкг/л. Свинец определяли на безэлектродной высокочастотной лампе, остальные металлы — на лампах с полым катодом.

Калибровочные растворы готовили соответствующим разведением государственного стандартного образца. Измерение концентраций Zn, Cu, Fe, Sr осуществляли непосредственно в сыворотке крови с предварительным разведением 1:2 бидистиллированной водой. Свинец определяли после осаждения белков. Для этого к 1,5 мл сыворотки крови добавляли 0,75 мл 1,5% раствора HCl и инкубировали в течение 1 ч при 37 °С. После гидролиза белков их осаждали 0,75 мл 20% трихлоруксусной кислотой и центрифугировали в течение 10 мин при 1500 об/мин, разведение при этом также составило 1:2. Надосадочную жидкость использовали для анализа [13]. Результат представлен в мг/л.

Статистические методы

Распределение полученных значений МДА и концентраций металлов оценивали статистически (Statistica 6): по группам исследования рассчитывали средние значения (M) и стандартные отклонения (SD), статистическую значимость различий оценивали по U-критерию Манна–Уитни, корреляционные взаимосвязи — методом Пирсона. Для оценки значимости отдельных показателей провели дискриминантный анализ, использовали метод множественной линейной регрессии.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Полученные результаты исследования уровней МДА и металлов в сыворотке крови представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Результат исследования содержаний малонового диальдегида (мкмоль/л) и металлов (мг/л) в сыворотке крови (M±SD)

Table 1. Serum malondialdehyde (µmol/L) and metal (mg/L) levels (M±SD)

Группа исследования	Малоновый диальдегид	Zn	Cu	Fe	Sr	Pb
Городская территория
Девочки	1,371±0,395*	0,645±0,123	1,064±0,400	1,759±0,5221	0,112±0,049	0,053±0,013
Мальчики	0,993±0,282	0,808±0,164*	0,876±0,168	1,283±0,441	0,117±0,040	0,049±0,013
Вся группа	1,235±0,398**	0,704±0,157	0,996±0,343	1,588±0,601	0,114±0,045	0,052±0,0122
Сельская территория
Девочки	0,933±0,230	0,820±0,181	0,882±0,214	1,524±0,761*	0,125±0,062	0,039±0,011
Мальчики	0,797±0,162	0,938±0,161	0,790±0,252	0,983±0,415	0,117±0,051	0,036±0,014
Вся группа	0,868±0,208	0,877±0,178**	0,838±0,232	1,266±0,666	0,121±0,056	0,037±0,012

Примечание. * Статистически значимые (p <0,05) более высокие значения при внутригрупповом сравнении мальчиков и девочек; ** статистически значимые (p <0,01) более высокие значения при межгрупповом сравнении жителей городской и сельской местности.

 

Содержание МДА по всем наблюдениям колебалось в пределах 0,629–1,995 мкмоль/л, составив в среднем 1,059±0,368 мкмоль/л, Zn — в пределах 0,444– 1,310 мг/л, в среднем — 0,787±0,187 мг/л, Cu — в пределах 0,413–1,811 мг/л, в среднем — 0,921±0,303 мг/л, Fe — в пределах 0,417–2,900 мг/л, в среднем — 1,434±0,647 мг/л, Sr — в пределах 0,053–0,222 мг/л, в среднем — 0,117±0,050 мг/л, Pb — в пределах 0,010–0,071 мг/л, в среднем 0,045±0,014 мг/л.

Оценка нормальности распределения показала, что распределение рассматриваемых значений близко к нормальному (критерий Шапиро–Уилка для всех показателей W >0,9).

Оценивая результаты, представленные в табл. 1, следует отметить более высокие значения концентраций МДА у детей, проживающих на территориях с высокой степенью антропогенной нагрузки, вне зависимости от пола. При этом общая тенденция такова, что у девочек всегда отмечались более высокие значения МДА по сравнению с мальчиками, однако статистически значимые различия были только среди городских детей.

По-видимому, одним из факторов повышения активности ПОЛ у девочек является их бо́льшая физиологическая зрелось, сопровождаемая увеличением площади тела (1,53 м² против 1,42 м² у мальчиков), при этом отмечена корреляционная взаимосвязь между МДА и площадью тела (r=0,32; p <0,05). Следует отметить, что средний возраст девочек и мальчиков был примерно одинаковым: 12,70±0,89 года у девочек и 12,80±0,93 года у мальчиков. Корреляционные взаимосвязи оценивали методом Спирмена (табл. 2).

 

Таблица 2. Корреляционная матрица Спирмена, отражающая взаимосвязи между различными показателями

Table 2. Spearman correlation matrix for associations between various parameters

Переменные	Площадь тела	Малоновый диальдегид	Zn	Fe	Cu	Sr	Pb
Площадь тела	1,00	0,23	−0,28	0,12	0,07	0,11	0,28
Малоновый диальдегид	0,23	1,00	−0,94	0,59	0,42	0,04	0,70
Zn	−0,28	−0,94	1,00	−0,59	−0,31	−0,05	−0,67
Fe	0,12	0,59	−0,59	1,00	0,32	0,14	0,32
Cu	0,07	0,42	−0,31	0,32	1,00	0,21	0,28
Sr	0,11	0,04	−0,05	0,14	0,21	1,00	0,12
Pb	0,28	0,70	−0,67	0,32	0,28	0,12	1,00

Примечание. Выделены полужирным статистически значимые коэффициенты, p <0,05.

 

Ещё одной интересной закономерностью является более низкое содержание Zn в группе детей, проживающих на территориях с высокой степенью антропогенной нагрузки, то есть при высоких уровнях МДА. Корреляционный анализ подтверждает эту взаимосвязь, отмечая наличие высокой статистически значимой отрицательной корреляции между концентрациями Zn и содержанием МДА в сыворотке крови (см. табл. 2).

При этом именно для девочек характерны низкие концентрации Zn и более высокие концентрации Fe при высоких значениях МДА. Таким образом, низкие значения концентрации Zn, сопровождающиеся высоким уровнем сывороточного Fe, возможно, также являются фактором повышения активности ПОЛ. Относительно небольшая выборка обследуемых не даёт возможности однозначно интерпретировать качество полученных взаимосвязей, в связи с чем мы указываем на них как на констатацию статистических закономерностей в конкретном наборе данных.

Обобщённая картина изменчивости концентраций МДА в сыворотке крови в зависимости от участка исследования, пола подростков и концентраций Zn в крови представлена на рис. 1. На рисунке следует обратить внимание на более выраженное снижение МДА при увеличении концентраций Zn у городских детей.

 

Рис 1. Изменчивость концентраций малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови подростков в разных экспериментальных группах в зависимости от содержания цинка.

Fig. 1. Variability of serum malondialdehyde (MDA) levels in adolescents in different study groups depending on zinc levels.

 

Другой важной особенностью является повышенное содержание Pb в сыворотке крови детей, проживающих на территориях с высокой степенью антропогенной нагрузки, статистически более высокое, чем в крови детей, проживающих в сельской местности (см. табл. 1). Кроме того, отмечена высокая прямая корреляционная взаимосвязь между концентрациями этого металла и МДА, а также высокая обратная корреляция с концентрациями Zn, что позволяет рассматривать высокие уровни Pb в качестве одного из элементов активации ПОЛ. Так как статистически значимых различий по содержанию Pb между мальчиками и девочками отмечено не было, можно предположить, что содержание этого металла обусловлено только особенностями формирующейся на территории проживания урбоэкосистемы.

При построении модели множественной регрессии с пошаговым включением признаков (Forward stepwise) значения Cu вместе с Zn и площадью тела представляют наибольшую статистическую значимость (табл. 3).

 

Таблица 3. Параметры множественной линейной регрессии, объединяющей значения концентраций Zn, Cu и величину площади поверхности тела с уровнем значений малонового диальдегида в сыворотке крови

Table 3. Multiple linear regression parameters for associations between Zn levels, Cu levels, body surface area, and serum malondialdehyde levels

Параметры уравнения	Beta	Ошибка Beta	B	Ошибка B	Критерий t Стьюдента	Уровень значимости p
Свободный член	—	—	1,43511	0,227954	6,29560	<0,001
Zn	−0,626427	0,080363	−1,22925	0,157697	−7,79497	<0,001
Cu	0,354623	0,077370	0,43074	0,093977	4,58350	<0,001
Площадь тела	0,145617	0,071194	0,13051	0,063809	2,04535	0,047

Примечание. Коэффициент корреляции R=0,89; коэффициент детерминации R²=0,79; критерий F=57,483; уровень значимости p <0,001; Beta — нормализованные весовые коэффициенты; B — абсолютные весовые коэффициенты.

 

Из табл. 3 следует, что нормализованные весовые коэффициенты (Beta) значений Cu превышают даже показатель площади тела при сопоставимой ошибке, в большей степени уравновешивая в модели влияние изменчивости Zn.

Для оценки классифицирующего вклада тех или иных показателей при сопоставлении их распределения между двумя группами обследуемых с территорий с различной степенью антропогенной нагрузки использовали дискриминантный анализ, который в режиме пошагового включения признаков позволил выделить два главных показателя, наиболее сильно влияющих на классификацию наблюдений (их отнесение к той или иной урбоэкосистеме): значения МДА и Pb (табл. 4).

 

Таблица 4. Главные классифицирующие показатели, выделенные дискриминантным анализом

Table 4. Primary classifying parameters identified by the discriminant analysis

Показатель (n=48)	Лямбда Уилкса	Критерий F-remove	Уровень значимости p	Коэффициент детерминации R2
Малоновый диальдегид	0,747561	3,768241	0,049	0,253051
Pb	0,747254	3,748199	0,049	0,253051

Примечание. Критерий F=10,118; уровень значимости p <0,0002.

 

Значения именно этих показателей способны с высокой долей вероятности указать, к какой территории проживания относится то или иное наблюдение. Соответственно, подтверждается предположение о том, что содержание Pb обусловлено особенностями урбоэкосистемы, а активность процессов ПОЛ у детей может значительно меняться в зависимости от степени урбанизированности окружающей среды, статистически значимо возрастая в условиях урбоэкосистем с высокой степенью антропогенной нагрузки.

ОБСУЖДЕНИЕ

Совершенно неактивным металлом в контексте взаимосвязи с МДА и в связи с содержанием других металлов является Sr. Не отмечено никаких значимых изменений его концентраций. В то же время для Cu отмечены достаточно заметные корреляции как с уровнями МДА, так и со многими металлами, хотя статистически значимых различий средних значений концентраций в разных группах отмечено не было. Общая тенденция такова, что изменчивость концентраций Cu повторяет изменчивость Fe, но выражена значительно слабее. Возможно, это обусловлено сочетанием известного антагонизма Cu и Zn с синергизмом Cu и Fe, в результате чего формируется сложная картина взаимосвязей, трудно интерпретируемая на небольших рядах наблюдений.

Отмеченная закономерность более низкого содержания цинка в сыворотке крови девочек по сравнению с мальчиками, возможно, связана с особенностями развития женского и мужского организмов. Например, с участием цинка в половом созревании мальчиков [14], а также с участием меди и цинка в функционировании супероксиддисмутазы, при этом медь и цинк находятся в конкурентных отношениях, что сказывается на активности супероксиддисмутазы [15]. По всей видимости, такая чувствительность антиоксидантных систем организма к содержанию отдельных металлов требует более критичной оценки роли продуктов ПОЛ, в частности МДА, в качестве маркёров окислительного стресса.

Проведённое исследование позволяет отметить наличие взаимосвязи между концентрациями МДА и некоторых металлов (Zn, Fe, Cu) в сыворотке крови. Отмечены более высокие концентрации МДА в сыворотке крови детей, проживающих на территориях с высокой степенью антропогенной нагрузки, по сравнению с проживающими в сельской местности (p <0,01).

Факторами повышения активности ПОЛ у подростков являются относительно более высокие значения площади поверхности тела, относительно низкие концентрации Zn и более высокие концентрации Cu и Fe в сыворотке крови, а также проживание в городской урбоэкосистеме при повышенных концентрациях свинца в сыворотке крови. Взаимосвязь активности процессов ПОЛ с уровнем содержания металлов особенно ярко проявляется в группе детей, проживающих на территориях с высокой степенью антропогенной нагрузки, при этом у девочек пубертатного возраста отмеченные тенденции выражены ещё сильнее, что позволяет рассматривать их как таргетную группу при проведении скрининговых исследований оксидативного стресса популяции в целом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате исследования выявлен ряд закономерностей, позволяющих актуализировать важные взаимосвязи между металлами и МДА в рамках общей системы маркёров адаптационного резерва организма человека, проживающего в условиях различной интенсивности факторов воздействия.

В связи с относительно небольшой аналитической выборкой полноценное обобщение результатов представляется затруднительным. Однако наличие выраженных статистически значимых различий между группами исследования констатирует определённую детерминированность наблюдаемых характеристик и предполагает наличие закономерностей в явлениях, что актуализирует проведение в будущем более масштабного и репрезентативного исследования.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Ю.А. Тунакова — подготовка протокола исследования, подготовка первого варианта статьи; Р.И. Файзуллин — подготовка обзора литературы, правки текста; В.С. Валиев — сбор и анализ данных, статистический анализ, интерпретация результатов. Все авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты работы, гарантируя надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

Этическая экспертиза. Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом Казанского (Приволжского) федерального университета (протокол № 50 от 24.09.2024).

Источники финансирования. Исследование выполнено в рамках реализации темы государственного задания, научные исследования проведены при финансовой поддержке Минобрнауки России в рамках исполнения обязательств по соглашению номер № 075-03-2025-335 от 16.01.2025 г., тема № FZSU-2023-0005 (рег. № 123030100016-5).

Раскрытие интересов. Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Оригинальность. При создании настоящей работы авторы не использовали ранее опубликованные сведения (текст, иллюстрации, данные).

Доступ к данным. Редакционная политика в отношении совместного использования данных к настоящей работе не применима, новые данные не собирали и не создавали.

Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовали.

Рассмотрение и рецензирование. Настоящая работа подана в журнал в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре. В рецензировании участвовали два внешних рецензента, член редакционной коллегии и научный редактор издания.

ADDITIONAL INFORMATION

Author сontributions: Yu.A. Tunakova: methodology, writing—original draft; R.I. Faizullin: investigation, writing—review & editing; V.S. Valiev: investigation, formal analysis. All the authors approved the version of the manuscript to be published and agreed to be accountable for all aspects of the work, ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately investigated and resolved.

Ethics approval: The study was approved by the Local Ethics Committee of Kazan (Volga Region) Federal University (Protocol No. 50 dated September 24, 2024).

Funding sources: The study was conducted as part of a state assignment; research were supported by the Ministry of Education and Science of Russia under agreement No. 075-03-2025-335 of January 16, 2025, topic No. FZSU-2023-0005 (registration number: 123030100016-5).

Disclosure of interests: The authors have no relationships, activities, or interests for the last three years related to for-profit or not-for-profit third parties whose interests may be affected by the content of the article.

Statement of originality: No previously published material (text, images, or data) was used in this work.

Data availability statement: The editorial policy regarding data sharing does not apply to this work, as no new data was collected or created.

Generative AI: No generative artificial intelligence technologies were used to prepare this article.

Provenance and peer-review: This paper was submitted unsolicited and reviewed following the standard procedure. The peer review process involved two external reviewers, a member of the editorial board, and the in-house science editor.

About the authors

Yulia A. Tunakova

Kazan National Research Technical University n.a. A.N. Tupolev-KAI

Author for correspondence.
Email: juliaprof@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8826-8639
SPIN-code: 5247-9698

Dr. Sci. (Chemistry), Professor

Russian Federation, Kazan

Rashat I. Faizullin

Kazan (Volga Region) Federal University

Email: RIFajzullin@kpfu.ru
ORCID iD: 0000-0001-6033-6356
SPIN-code: 4818-6504

MD, Cand. Sci. (Medicine), Associate Professor

Russian Federation, Kazan

Vsevolod S. Valiev

Institute of Ecology and Subsoil Use of the Academy of Sciences of Republic of Tatarstan

Email: podrost@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8848-5326
SPIN-code: 6871-9839
Russian Federation, Kazan

References

Supplementary files