RS8193036 POLYMORPHISM OF IL-17A GENE IN A KAZAKH POPULATION AND ITS ASSOCIATION WITH PLASMA IL-17A AMONG ERYSIPELAS PATIENTS

Full Text

Рожа - вызываемое ß-гемолитическим стрептококком группы А инфекционно-аллергическое заболевание, значительно снижающее качество жизни, имеющее социально-экономическую значимость и склонное к длительному рецидивирующему течению [13-14]. В прогнозировании клинического течения рожи не исключается участие генетических факторов, в частности полиморфизма генов некото рых цитокинов. В связи с этим поиск генетических маркеров восприимчивости и особенностей течения заболевания среди аллелей полиморфизмов генов цитокинов представляет существенный теоретический и практический интерес. Выявление генетических маркеров позволит не только значительно углубить существующие представления о патогенезе рожи, но и разработать наиболее эффективные методы опреде - 50 Экология человека 2016.4 Медицинская экология ления предрасположенности к развитию заболевания и прогнозированию его клинического течения. Среди факторов, обусловливающих рецидивирующее течение рожи, особое значение придают дисбалансу между про- и противовоспалительными цитокинами [6]. Установлено, что при рецидивирующем течении рожи содержание провоспалительных цитокинов в высоких концентрациях наблюдается не только в остром периоде, но и в период рекон-валесценции, что может являться прогностически неблагоприятным фактором [6]. Вероятность хронического рецидивирующего течения заболевания предположительно связывают с функциональным дисбалансом Т-хелперов 1 типа (Th-1) и Т-хелперов 2 типа (Th-2), проявляющимся преобладанием в остром периоде рожи активности Th-2, а в период реконвалесценции - Th-1 [5]. Известно, что новая субпопуляция Т-хелперов - Th-17 и Th-2 индуцируют разные биологические эффекты: дифференцировка Th-17 блокирует образование Th-2, а Th-2 продуцируют ИЛ-4, который тормозит процессы дифференцировки Th-17 [2]. Предполагается, что Th-17 во многом определяют иммунитет организма к возбудителям с внеклеточной локализацией. Установлено, что кожа и слизистые оболочки являются преимущественными зонами миграции Th-17-клеток [2], цитокины которых (в частности, ИЛ-17А) стимулируют барьерные функции эпителия. Интерлейкин - 17 А (ИЛ-17А) продуцируется Т-хелперами 17 типа (Th-17) и играет ключевую роль в развитии местного воспалительного процесса [2], доминирующего в клинике рожи. В нашем предыдущем исследовании [ 1] выявлено, что у больных рожей отмечается гиперпродукция ИЛ-17А по сравнению с лицами контрольной группы. Ген интерлейкина 17А (ИЛ-17А) локализован на 6 хромосоме: 6p12.2. Наиболее изученные два полиморфизма этого гена: rs2275913 и rs8193036 [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/3605]. В настоящее время предполагается связь полиморфизмов гена ИЛ-17А с предрасположенностью к ревматоидному артриту (rs2275913 [18]), раку желудка (rs2275913 [17]), язвенному колиту (rs2275913 [16]), бронхиальной астме (rs8193036 [21]) и некоторым другим аутоиммунным заболеваниям [16]. Полиморфизм генов цитокинов может оказывать влияние не только на предрасположенность к развитию заболевания, но и на интенсивность продукции самих цитокинов. Исследования, проведенные Костиной Е.М. и соавт. [8] у больных инфекционно-зависимой бронхиальной астмой, показали, что уровень ИЛ-17А оказался наиболее высоким у носителей гетерозиготного GA генотипа полиморфизма гена ИЛ-17А rs2275913. До настоящего времени исследований полиморфизма генов цитокинов, в том числе ИЛ-17А, и их связи с развитием или характером течения рожи в международной рецензируемой литературе не опубликовано. Кроме того, не изучалась распространенность полиморфизмов гена ИЛ-17А в казахской популяции. Целью нашего исследования является изучение полиморфизма (rs8193036) гена ИЛ-17А и его связи с содержанием ИЛ-17А в плазме крови у больных рожей и здоровых лиц в казахской популяции. Методы Дизайн исследования и выборка В исследование типа «случай - контроль» [4] было включено 95 больных рожей (случаи) и 383 человека с исключенным диагнозом рожи (кон-троли). Отбор в группу случаев с диагностированной рожей производился сплошным образом из поступивших в инфекционную больницу г. Семей больных последовательно за период с 1 сентября 2013 года по 31 августа 2014-го. Дополнительно набор больных производился из выявленных случаев рожи в семейноврачебных амбулаториях (№ 1, 2, 3, 9, 11, 16, 17) и поликлиниках (№ 4 смешанного типа, консультативно-диагностическая № 3, г. Семей, Казахстан) за тот же период. Контрольная группа была также сформирована из лиц, проходивших профилактические осмотры в вышеуказанных семейно-врачебных амбулаториях и поликлиниках, у которых диагноз рожи был исключен. Критериями включения в группу случаев являлись: установленный диагноз рожи, возраст 18 лет и старше, казахская национальность, эритематозная и эритематозно-буллезные формы заболевания, проживание на территории г. Семей. Критериями исключения были генетические заболевания в анамнезе, онкологические заболевания, хронические вирусные гепатиты, бруцеллез, иммунодефицитные состояния в анамнезе, заболевания почек, сердечно-сосудистой системы, печени, крови в терминальной стадии и гнойные осложнения рожи в виде абсцесса, флегмоны, некротического фасциита и другие заболевания, которые могут влиять на уровень цитокина ИЛ-17А. Критериями включения для контрольной группы были: исключенный диагноз рожи и отсутствие заболевания в анамнезе, возраст 18 лет и страше, казахская национальность, проживание на территории г. Семей. Критерии исключения были аналогичны таковым в группе случаев. Сбор данных У всех участников исследования было проведено генотипирование по полиморфизму гена ИЛ-17А rs8193036. Геномная ДНК выделялась из крови при помощи наборов QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Germany) в соответствии с инструкцией изготовителя. Концентрации ДНК были измерены при помощи Nanophotometer P330 (Implen). Генотипирование ДНК проводилось на амплификаторе CFX96™ Real-Time PCR (Bio-Rad). Программа амплификации включала предварительную денатурацию при 94 °С в течение 3 минут, далее 50 циклов 94 °С в течение 10 секунд и 58 °С в течение 50 секунд. Исследование проводилось на базе Республиканского государственного предприятия «Национальный центр биотехнологий», г. Астана. 51 Медицинская экология Экология человека 2016.4 У 90 больных рожей из 95 больных, у которых было проведено генотипирование, были определены уровни ИЛ-17А. У 5 пациентов из 95 в связи с отказом уровень ИЛ-17А не определялся. Из 383 лиц, вошедших в контрольную группу, для определения уровня ИЛ-17А отбирали случайным образом до достижения равного количества участников (90 человек). Уровень ИЛ-17А определялся методом иммуно-ферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем Вектор-Бест (Новосибирск, Россия) [8] на базе Объединенной учебно-научной лаборатории Государственного медицинского университета (ГМУ) г. Семей. У больных рожей производился забор крови в объеме 5 мл в пробирки с ЭДТА (этилендиамин-тетраацетат). Статистическая обработка данных Сравнение частот встречаемости генотипов между группой случаев и группой контролей проводили с помощью критерия X2 Пирсона и отношений шансов (ОШ) с 95 % доверительными интервалами (ДИ) [4]. Соотношение частот генотипов и аллельных вариантов генов проверялось на соответствие закону Харди -Вайнберга. Статистические расчеты проводились на калькуляторе для генетических расчетов по программе Ген Эксперт ( http://gen-exp.ru/calculator_or.php). Содержание ИЛ-17А в плазме крови описывалось с помощью медиан и квартилей (Ме, Q1 и Q3 соответственно). Учитывая, что распределение ИЛ-17А в плазме отличалось от нормального, для межгрупповых сравнений применяли непараметрические критерии [3, 9]. С помощью критерия Краскела - Уоллеса [11] определяли межгрупповые различия в уровне цитокина ИЛ-17А среди трех генотипов (СС, СТ, ТТ). Затем, при наличии статистически значимых различий в предыдущем анализе, проводили три попарные сравнения групп (СС vs. CT, CC vs. TT, CT vs. CT) с помощью критерия Манна - Уитни с поправкой Бонферрони при критическом уровне значимости 0,017 [12]. Аналогичные сравнения производились и в группе здоровых лиц. Далее мы сравнивали уровень ИЛ-17А в пределах одного генотипа у больных рожей и здоровых лиц. Эти сравнения групп осуществляли с помощью критерия Манна - Уитни, а различия считали значимыми при р < 0,05. Данные обрабатывали с использованием пакета STATA 13 (Stata Corp. TX, USA) [10]. Величину эффекта для сравнений, проводимых с помощью критерия Манна - Уитни, рассчитывали по формуле: r = Z / VN. Протокол исследования был разработан и утвержден на заседании этического комитета ГМУ г. Семей (протокол № 2 от 13.11.2013 г.). Все участники исследования были информированы о цели и методах исследования и дали письменное согласие на участие. Результаты Средний возраст больных, генотипированных по полиморфизму гена ИЛ-17А rs8193036 (n = 95) составил 46,3 (95 % ДИ: 43,6-49,0) года. Средний возраст лиц контрольной группы (n = 383) составил 42,5 (95 % ДИ: 41,2-43,8) года. Распределение генотипов соответствовало равновесию Харди -Вайнберга (p = 0,55 для контрольной группы и p = 0,12 для группы случаев). Средний возраст случаев, которым определялся уровень ИЛ-17А (n = 90), был 47,1 (95 % ДИ 44,249,9) года, в то время как в группе контролей средний возраст был 45,3 (95 % ДИ 42,6-47,9) года. Статистически значимых различий в возрасте между группой случаев и группой контролей выявлено не было. У больных рожей шансы наличия дикого аллеля (референсный аллель) и генотипа СС были ниже по сравнению с контрольной группой. В же время шансы обнаружения полиморфного Т аллеля в группе больных был выше в 1,4 раза. Шансы обнаружения СТ и ТТ-генотипов в группе случаев по сравнению с группой контролей статистически не различались (табл. 1). Таблица 1 Связь полиморфизма гена ИЛ-17А rs8193036 с заболеванием рожей rs 8193036 Больные рожей (n=95) Здоровые лица (n=383) X2 р ОШ (95 % ДИ) Аллели С Т 36,3% 63,7% 44,5 % 55,5% 4.18 0.04 9) 5),9,9 0, 1, 1 1 Ю о (0, (1,,71,4 о" Генотипы СС СТ ТТ 9,5% 53,7% 36,8% 19,1% 50,9% 30,0% 4.40 0,04 0,44 (0,21-0,92) 1,12 (0,71-1,75) 1,36 (0,85-2,18) Примечание. X2 - значение Хи-квадрат Пирсона, р - достигнутый уровень значимости, ОШ - отношение шансов. У носителей СС-генотипа по сравнению с носителями СТ-генотипа уровень ИЛ-17А был значимо выше (р = 0,010. Величина эффекта (r = 0,86) свидетельствует не только о наличии значимой связи, но и о том, что около 86 % варибельности уровня ИЛ-17А может быть обусловлено генотипом (СС vs. CT ). При сравнении уровней ИЛ-17А у больных-носителей СТ-генотипа и больных-носителей ТТ-генотипа, а также у больных с СС и ТТ-генотипами статистически значимых различий не выявлено (табл. 2). Таблица 2 Связь полиморфизма rs8193036 гена ИЛ-17А с его уровнем у больных рожей Больные рожей (n=90) Уровень ИЛ-17А Значимость различий по содержанию ИЛ-17А между генотипами Количество больных с генотипом (n) Me Q1 Q3 рі р2 r СС 9 7,780 4,714 9,450 СС/СТ 0,010 0,86 СТ 48 4,477 2,860 6,535 СТ/ТТ 0,032 0,374 0,13 ТТ 33 5,000 2,938 7,780 СС/ТТ 0,042 0,35 Примечание. р1 - достигнутый уровень значимости различий по содержанию ИЛ-17А среди трех генотипов, р2 - достигнутый уровень значимости различий по содержанию ИЛ-17А при попарных сравнениях. Сравнение содержания уровней ИЛ-17А у носи- 52 Экология человека 2016.4 Медицинская экология телей различных генотипов проводилось у 90 лиц из 383, генотипированных по полиморфизму rs8193036. Уровни ИЛ-17А в плазме крови у носителей разных генотипов среди здоровых лиц значимо не отличались. Расчет величины эффекта показал, что отсутствие статистически значимых различий вызван скорее слабой связью, нежели недостаточной статистической мощностью (табл. 3). Таблица 3 Связь полиморфизма rs8193036 гена ИЛ-17А с его уровнем у лиц контрольной группы Примечание. рі - достигнутый уровень значимости различий по содержанию ИЛ-17А среди трех генотипов, р2 - достигнутый уровень значимости различий по содержанию ИЛ-17А при попарных сравнениях, r- величина эффекта для критерия Манна-Уитни, оценивающая силу связи между уровнем ИЛ-17 А и генотипами. При сравнении уровней ИЛ-17А в пределах одного генотипа установлены статистически значимые различия по уровню ИЛ-17А у случаев и у лиц контрольной группы с генотипами СС и СТ. У больных рожей уровень ИЛ-17А был выше по сравнению с контрольной группой как у носителей СС-генотипа, так и у носителей СТ-генотипа, что говорит о наличии и других механизмов в продукции ИЛ-17А (табл. 4). Таблица 4 Сравнение уровней ИЛ-17А у больных и здоровых лиц в зависимости от генотипов rs8193036 Количество больных и здоровых лиц с генотипом Me Q1 Q3 p r СС Случаи 9 7,780 4,714 9,450 0,023 0,50 Контроля 12 2,969 1,618 6,903 СТ Случаи 48 4,477 2,860 6,535 0,020 0,24 Контроли 47 3,330 0,600 6,544 ТТ Случаи 33 5,000 2,938 7,780 0,428 0,10 Контроли 31 5,551 1,800 7,426 Обсуждение результатов В результате нашего исследования было выявлено, что аллель С полиморфизма rs8193036 гена ИЛ-17А встречается у случаев реже, чем у контролей. Аллель Т встречается у случаев чаще, чем у контролей. Также наши результаты предполагают, что имеется связь СС-генотипа rs8193036 у больных рожей с уровнем продукции ИЛ-17А. Связи полиморфизма rs8193036 гена ИЛ-17А с его уровнем у здоровых лиц установлено не было. Учитывая, что наше исследование является первой попыткой оценить связь генетических полиморфизмов гена ИЛ-17А и рожи, которая является одним из редкоизучаемых заболеваний, результаты должны интерпретироваться с учетом потенциальных недостатков, связанных с дизайном исследования. В исследованиях типа «случай - контроль» существенную роль могут играть систематические ошибки [4]. Во-первых, отбор группы случаев и контрольной группы проводился в пределах г. Семей. Поэтому мы не можем экстраполировать наши результаты на всю казахстанскую популяцию. Во-вторых, из-за «ошибок памяти», некоторые лица контрольной группы могли не вспомнить о перенесенной ранее (в детском возрасте) роже. Однако в таком случае связь между зависимой и независимой переменной в нашем исследовании может быть занижена, а значит, выявленные значимые связи могут потенциально быть и более выраженными. В третьих, в данном исследовании не учитывалось воздействие других факторов риска, то есть не учитывался эффект потенциальных конфаундеров. В нашем исследовании мы не учитывали экологические и другие факторы, которые тоже могут иметь связь с заболеванием. Однако их связь с изучаемыми генотипами маловероятна, поэтому конфаундинг-эффект можно считать незначительным. Также к недостаткам нашего исследования можно отнести малый объем выборки, который позволяет выявить только относительно сильные связи. Но даже этот объем выборки позволил нам выявить статистически значимые различия. Научная новизна исследования заключается в том, что нами впервые определен полиморфизм rs8193036 гена ИЛ-17А в казахской популяции. По данным базы SNP http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref. cgi?rs=8193036, частота встречаемости дикого аллеля С полиморфизма rs8193036 среди здоровой популяции азиатов составляет 48,6 %, а аллеля Т - 51,4 %. В нашем исследовании также выявлено, что аллель Т встречается у казахов (по данным контрольной группы) чаще по сравнению с аллелем С - 44,5 и 55,5 % соответственно. Stappers M и соавт. [20] считают, что полиморфизм rs8193036 гена ИЛ-17А и полиморфизмы генов других цитокинов могут влиять на предрасположенность к заболеваниям кожи инфекционного генеза, в том числе вызванных ß-гемолитическим стрептококком. Исследования, проведенные на Тайване [22], показали, что СС-генотип полиморфизма rs8193036 увеличивает восприимчивость к бронхиальной астме. Однако наши результаты показали, что СС-генотип реже встречается у больных рожей, чем у контрольной группы. Предположительно, он может быть фактором резистентности к заболеванию рожей. Возможно, данные различия были обусловлены этническими особенностями, а также различным генезом заболеваний. Известно, что одноточечные мутации (SNP-замены), в частности аллели и генотипы полимор Здоровые лица(n = 90) Уровень ИЛ-17А Значимость различий по содержанию ИЛ-17А между генотипами Количество здоровых лиц с генотипом (n) Me Q1 Q3 рі р2 r СС 12 2,969 1,618 6,903 СС/ СТ 0,631 0,06 СТ 47 3,330 0,600 6,544 СТ/ ТТ 0,291 0,118 0,17 ТТ 31 5,551 1,800 7,426 СС/ ТТ 0,524 0,09 53 Медицинская экология Экология человека 2016.4 физмов генов цитокинов, могут влиять на скорость транскрипции генов и приводить к повышению или снижению активности синтезируемого белка [9]. Наши результаты не противоречат результатам исследований зарубежных авторов, которые предполагают [21], что С аллель полиморфизма rs8193036 гена ИЛ-17А может повышать экспрессию ИЛ-17А за счет выработки ДНК-связывающего домена для транскрипционного фактора GATA 3. В нашем исследовании обнаружено, что полиморфизм rs8193036 гена ИЛ-17А, в частности СС генотип, может быть связан с гиперпродукцией ИЛ-17А. Han R. и со-авт. [16] предполагают, что аллель Т полиморфизма rs8193036 в 5'кодирующей белок области ассоциирован со снижением транскрипционной активности гена ИЛ-17А. Низкая транскрипционная активность, в свою очередь, может быть причиной замедленного синтеза белка, в данном случае ИЛ-17А. По результатам данного исследования можем предположить, что носители разных генотипов среди больных рожей и здоровых лиц могут иметь разные концентрации ИЛ-17А. У больных с СС-генотипом наблюдались более высокие концентрации ИЛ-17А по сравнению с лицами контрольной группы. В результате нашего исследования мы определили, что Т аллель чаще встречается у больных рожей, что может являться возможным генетическим критерием предрасположенности к развитию рожи, а С аллель и СС-генотип, которые встречались реже у случаев, чем у лиц контрольной группы, могут быть факторами резистентности. Также выявлена связь генотипов (СС, СТ) с иммунологическими показателями крови, в частности цитокинами (ИЛ-17А), которые играют немаловажную роль в развитии заболевания. Полученные результаты дают основание предположить, что rs8193036 полиморфизм гена ИЛ-17А может быть связан с заболеванием рожей и с уровнем ИЛ-17А. Полученные результаты должны быть реплицированы в ходе дальнейших исследований для уточнения роли полиморфизмов гена ИЛ-17А в этиологии рожи.

About the authors

N B Bekenova

Semey State Medical University

Semey, Kazakhstan

A M Grjibovski

Norwegian Institute of Public Health; Northern State Medical University; International Kazakh-Turkish University; North-Eastern Federal University

Email: Andrej.Grjibovski@gmail.com
Semey, Kazakhstan

L A Mukovozova

Semey State Medical University

Semey, Kazakhstan

E V Smail

Semey State Medical University

Semey, Kazakhstan

A Z Tokaeva

Semey State Medical University

Semey, Kazakhstan

References

Supplementary files