Цитокиновая регуляция пролиферативной активности клеток периферической крови

Полный текст

Цитокиновая сеть обеспечивает всеобщую взаимосвязь систем организма посредством своих рецепторов, расположенных на мембране практически всех клеток. Цитокины, в том числе провоспалительные, секретируются любыми клетками. Многие цитокины имеют общие рецепторы, в связи с чем оказывают синергичное действие или дублируют друг друга. Цитокины регулируют пролиферативную активность иммунокомпетентных клеток, активируя Т- и В-лимфоциты посредством экспрессии гена рецепторов к цитокину и самого цитокина [6, 7, 9, 14, 15, 18, 20]. Провоспалительные цитокины могут и снижать функциональную активность клеток, возможно, путем индукции экспрессии ингибиторных молекул или посредством активизации тирозинкиназ [1, 10, 12, 16, 20]. Механизмы прямо противоположного влияния цитокинов по принципу обратной связи в достаточной степени не ясны. Известно, что IFN-y и IL-4 индуцируют экспрессию циклинзависимой киназы (Cdk) ингибитора p21Waf1, который требуется для IL- 4-зависимой ингибиции пролиферации макрофагов. IL-4 ингибирует M-CSF-зависимую Cdk-2 и Cdk-4 активацию, которые необходимы для прохождения 5-фазы клеточного цикла [11]. IL-4 макрофагов, увеличивая продукцию противовоспалительных ци-токинов натуральными киллерами Т-происхождения, обеспечивает противовоспалительное действие [19]. Повышенные концентрации провоспалительных ци- 28 Экология человека 2015.12 Экологическая физиология токинов установлены при воспалительных процессах, опухолях, гиперчувствительности замедленного и немедленного типов, метаболическом синдроме и аутосенсибилизации [7, 12, 20]. Таким образом, цитокины могут оказывать различное влияние на иммунокомпетентные клетки. Однако не установлено, что является определяющим в направлении развития пролиферативных реакций, уровень цитокина в крови, способ его влияния на клетки местный или системный, либо способность выполнять роль посредника для каких-либо других факторов активизации. Методы Проведено изучение иммунологического статуса и пролиферативной активности лейкоцитов периферической крови у 234 практически здоровых людей в возрасте от 20 до 50 лет. Забор крови для исследования проводился из локтевой вены в утренние часы. Определяли содержание фенотипов лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+, CD10+, CD16+, CD25+, CD71 + , CD95+, HLA-DR+, CD23+) методом непрямой иммунопероксидазной реакции с применением моноклональных антител (НПЦ «МедБиоСпектр» и ООО «Сорбент», г. Москва). Количество и соотношение клеток гемограммы, нейтрограммы, моноцитограммы [3] и лимфоцитограммы [5] подсчитывали в мазках крови, окрашенных по методу Романовского - Гимза. Содержание цитокинов (IL-6, IL-4, IL-10, TNF-a и IFN-y), онкомаркеров (раково-эмбриональный антиген - РЭА и альфа-фетопротеин - АФП) определяли в сыворотке и плазме крови иммуноферментным методом с использованием тест-наборов производства Bender MedSystems, Fujirebio Diagnostics. Inc, измерение оптической плотности проводили на фотометре Multiscan MS. Результаты исследования для каждого цитокина были разделены на группы. Первая и вторая группы выделены относительно медианы содержания цитокинов в выборке, третья - с повышенными их концентрациями. Полученные результаты были подвергнуты статистической обработке с применением пакета прикладных программ Statistica 10. Результаты непараметрических методов обработки представлены в виде медианы (Me) и интерквартильного размаха в виде 25 и 75 перцентилей (Q1-Q3). Статистическая значимость различий определялась с помощью непараметрического критерия Манна - Уитни и медианного теста. Корреляционный анализ проведен с использованием ранговой корреляции Спирмена (р < 0,05). Критический уровень значимости (p) в работе принимался равным 0,05. Результаты Для изучения влияния IL-6 на пролиферативную активность лимфоцитов, нейтрофилов и моноцитов результаты исследования были разделены на три группы: первая - с содержанием IL-6 в сыворотке крови менее 8 пг/мл (3,21-4,79-6,98), вторая - с содержанием IL-6 до 20 пг/мл (9,35-10,74-13,26) и третья - с повышенной концентрацией цитокина более 20 пг/мл (25,19-26,76-31,41). В возрастном аспекте группы статистически не различаются (х2 = 3,83, df = 2, p = 0,15), средний возраст в выборке составил (34,11 ± 1,97) года. Показано, что повышение концентрации провос-палительного цитокина IL-6 более 20 пг/мл не связано с увеличением общего содержания лейкоцитов в периферической крови: 6,40 (5,10-7,70) - в первой группе; 7,50 (6,30-10,10) х 109кл/л - в третьей. Концентрации нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов статистически значимых различий не имели. Структуры моноцитограммы и нейтрограммы были также практически одинаковыми у лиц обследуемых групп. Увеличение концентрации IL-6 ассоциировано с более высоким содержанием малых лимфоцитов, концентрация которых фактически в 2 раза выше у лиц третьей группы, и значительным сокращение средних форм (табл. 1). Повышение уровня малых лимфоцитов под влиянием IL-6 косвенным образом свидетельствует об усилении выхода лимфоцитов из депо. Таблица 1 Структура лимфоцитограммы при различных концентрациях IL-6 Me (Q1-Q3) Лимфоциты, 109 кл/л Содержание IL-6 Значи мость различий <8 пг/мл (1) до 20 пг/ мл (2) >20 пг/мл (3) Малые 0,89 (0,59 - 1,34) 0,76 (0,51 - 1,32) 1,56 (0,63-2,04) р2-3 = 0,°1 р1 ,=0,02 Средние 0,88 (0,56-1,44) 0,86 (0,57-1,23) 0,61 (0,44 - 0,91) р1-3=0,01 Большие 0,32 (0,21-0,52) 0,27 (0,17 - 0,36) 0,20 (0,17 - 0,37) р>0,05 Влияние IL-6 на пролиферативную активность Т-лимфоцитов связано с активизацией механизмов, опосредованных трансферрином. Содержание CD71+ практически в 2 раза выше на фоне концентраций цитокина более 20 пг/мл: в среднем у лиц первой и второй групп уровень содержания Т-клеток с рецептором к трансферрину составил соответственно 0,39 (0,27-0,57) и 0,38 (0,24-0,59) х 109 кл/л; в третьей группе обследуемых людей - 0,63 (0,41 - 0,75) х 109 кл/л (р2-3 = 0,02). Известно, что сразу после экспрессии рецептора к трансферрину клетка начинает продуцировать IL-2. Число клеток с рецептором к IL-2 (CD25+) в первой группе составило 0,52 (0,35-0,76), во второй - 0,40 (0,32-0,57), в третьей - 0,59 (0,43-0,82) х 109 кл/л, р2 3 = 0,04. Анализ уровня различных фенотипов лимфоцитов свидетельствует о дозозависимом влиянии IL-6 на содержание клеток, обеспечивающих антителозависимую цитотоксичность CD23+. Их концентрация составила в первой группе 0,56 (0,38-0,80), во второй - 0,49 (0,30-0,70), в третьей - 0,37 (0,26-0,48) х109кл/л (р1-3 = 0,004). Повышение концентрации IL-6 способствует активизации антителозависимых реакций, о чём 29 Экологическая физиология Экология человека 2015.12 свидетельствует значительное повышение уровня IgE с 23,74 (14,81-75,62) в первой группе до 148,4 (76,89-307,20) Ме/мл - в третьей (р = 0,005). Итак, более высокие концентрации IL-6 способствуют увеличению содержания лимфоцитов, вероятно, за счёт их перераспределения, а также стимулирования энергозависимого механизма активизации лимфопролиферации и механизма, опосредованного IL-2. Таким образом, данный цитокин, обеспечивающий стресс-реакции в организме и развитие воспалительного процесса, способствует повышению энергетического потенциала лимфоцитов. Установлена обратная зависимость содержания IL-6 и РЭА (r = -0,20; p < 0,05). Уровни РЭА у лиц с высокими концентрациями цитокина снижаются с 1,24 (0,66-1,99) до 0,72 (0,15-1,48) нг/мл (р = 0,05; U = 399,5), вероятно, за счет ингибиции шеддинга мукополисахарида со слизистых. Пределы колебания концентраций IL-10 были незначительными; влияние IL-10 на пролиферацию клеток периферической крови определяли в двух группах с концентрацией цитокина менее 2 пг/мл (0,90-1,24-1,70) и более 3,5 пг/мл (3,62-4,41 - 5,20). Не удалось установить значимого различия в уровне пролиферации нейтрофильных гранулоцитов. Содержание палочкоядерных нейтрофилов в первой группе составило в среднем 0,35 (0,24-0,54), во второй - 0,34 (0,18-0,64) x 109 кл/л. В структуре нейтрограммы также не выявлено статистически значимых различий. Концентрация моноцитов в обеих группах была практически одинаковой и составила соответственно 0,45 (0,33-0,62) и 0,44 (0,25-0,66) x 109 кл/л. Содержание лимфоцитов при концентрации IL-10 менее 2 пг/мл в среднем составило 2,25 (1,76-2,97), при повышении уровня цитокина более 3,5 пг/мл - 2,13 (1,71-2,47) х 109 кл/л. Таким образом, противовоспалительный цитокин IL-10 в концентрациях 0,9 - 5,20 пг/мл не оказывает существенного ингибиторного влияния на уровни пролиферации лимфоцитов, нейтрофилов и моноцитов. Мнение о возможном ингибиторном воздействии IL-10 основывается на его способности подавлять рецепторную активность клеток. Остается предполагать, что подавление активности клеток и её пролиферативной способности IL-10 происходит при более высоких его концентрация. Влияние IL-4 изучено в трех группах обследуемых лиц: с концентрацией интерлейкина менее 6 пг/ мл (1,48-2,58-4,10) и до 50 пг/мл (7,14-10,26- 11,08); в третьей группе содержание цитокина было выше физиологических норм, более 50 пг/мл (71,22-76,31-91,57). Влияние IL-4 дозозависимо: высокие концентрации подавляют пролиферацию лимфоцитов, не влияя на пролиферативные способности моноцитов и нейтрофильных гранулоцитов. Изучение структуры нейтрограммы и моноцитограммы подтверждает отсутствие взаимосвязей изменения количества палочкоядерных нейтрофилов и промоноцитов при различной концентрации IL-4 в крови. Установлены отрицательные корреляционные взаимосвязи общего содержания лимфоцитов и IL-4 (r = -0,26), также уровня содержания больших лимфоцитов и данного цитокина (r = -0,26). Низкие концентрации IL-4 значительно повышают пролиферацию Т-клеток с маркером CD25: 0,50 (0,38-0,74) x 109 кл/л - в первой группе и 0,32 (0,27-0,56) x 109 кл/л во второй (р = 0,02, U = 260). При уровне IL-4 более 50 пг/мл пролиферация клеток, обусловленная IL-2, также снижается относительно уровня в первой группе - 0,34 (0,24 - 0,47) x 109 кл/л (р = 0,02, U = 148). Аналогичное влияние установлено и для клеток с рецептором к главному комплексу гистосовместимости класса HLA-DR+ (r = -0,41). Показано, что более низкие физиологические концентрации IL-4 стимулируют активизацию лимфоцитов путем экспрессии HLA-DR: в первой группе содержание данных Т-клеток в среднем составило 0,61 (0,41-0,81) х 109 кл/л; во второй и третьей соответственно - 0,38 (0,25-0,60) и 0,33 (0,20-0,47) x 109 кл/л, (р1-2 = 0,01, р1-3 = 0,001). Таким образом, IL-4 способен влиять как на раннюю активацию Т-клеток, так и на позднюю. Не установлено влияния физиологических концентраций IL-4 на пролиферацию клеток путем экспрессии гена рецептора к трансферрину CD71 +. Низкие концентрации IL-4, способствуя лим-фопролиферации, преимущественно стимулируют активизацию CD 16+ и CD23+; высокие, напротив, способствуют снижению концентрации этих клеток с рецепторами к Fc-фрагментам иммуноглобулинов. Так, содержание CD16+ и CD23+ составило соответственно 0,43 (0,33-0,66) и 0,58 (0,38-0,77) х 109 кл/л при низких концентрациях цитокина; при повышенных уровнях содержания цитокина концентрации активированных клеток были в 2 раза ниже (соответственно 0,25 (0,22-0,44) х 109кл/л, р = 0,01, U = 139) и 0,30 (0,20-0,38) x 109 кл/л, р = 0,001, U = 100). Влияние IFN-y изучали при концентрациях в крови менее 10 пг/мл, до 50 и более 50 пг/мл. Общее содержание лейкоцитов статистически значимо было выше в первых двух группах и составило соответственно 6,20 (4,90-7,50) и 7,40 (6,00-9,20) х 109 кл/л, в третьей группе концентрация лейкоцитов снижается до 4,75 (4,10-5,65) x 109 кл/л (р < 0,0001, х2 = 17,82). Влияние низких концентраций IFN-y на пролиферацию нейтрофилов проявляется увеличением числа палочкоядерных форм до 0,33(0,18-0,53) х 109 кл/л по сравнению с уровнями содержания во второй и третьей группах - 0,24 (0,10-0,35) и 0,23 (0,13-0,37) x 109 кл/л, р12 = 0,004). Физиологические концентрации IFN-y до 50 пг/мл стимулируют лимфопролифе-рацию, что сопровождается как увеличением общего числа циркулирующих лимфоцитов (1-я группа 2,20 (1,69-2,71), 2-я - 2,35 (1,86-2,89), 3-я - 1,39 (1,21 - 1,52) x 109 кл/л, р1-3 = 0,001, р23 <0,0001), так и бластных форм (соответственно 0,26 (0,16-0,41), 0,25 (0,19-0,39), 0,13 (0,11-0,17) х 109 кл/л, р1-3 = 0,010, р2-3 = 0,004). 30 Экология человека 2015.12 Экологическая физиология Увеличение уровня содержания IFN-y в пределах физиологических норм способствует повышению активизации лимфоцитов посредством IL-2 с увеличением концентраций CD25+ (1-я группа 0,40 (0,27-0,65), 2-я - 0,53 (0,37-0,71), 3-я - 0,28 (0,21-0,29) x 109 кл/л, р1-2 = 0,02; р2-3 < 0,0001; р1-3 = 0,020). Подобная закономерность наблюдается относительно содержания клеток CD71 + (соответственно 0,45 (0,26-0,64), 0,38 (0,28-0,54) и 0,26 (0,22-0,36) x 109 кл/л, р1-3 = 0,030; р2-3=0,02). IFN-y обусловливает подобную зависимость относительно В-лимфоцитов: при низких концентрациях цитокина увеличивается количество В-клеток с маркерами ранней активизации (CD 10+), при увеличении содержания цитокина более 50 пг/мл уровень концентрация CD 10+ снижается в 2 раза (соответственно 0,51(0,27-0,74) и 0,25 (0,17-0,32) x 109 кл/л, р1-3 = 0,010; р2-3 = 0,001). Влияние TNF-a на пролиферацию клеток периферической крови изучали в трех группах обследуемых лиц: первая группа с концентрацией TNF-a в крови менее 10 пг/мл; вторая - до 20 пг/мл; третья - более 20 пг/мл. TNF-a не оказывает влияния на пролиферацию моноцитов; не установлено изменения в общем содержании данных клеток, а также в структуре моноцитограммы. Взаимосвязь пролиферации нейтрофилов и концентрации TNF-a проявляется значительным снижением в 2 раза числа палочкоядерных нейтрофилов (с 0,37 (0,24-0,55) до 0,19 (0,12-0,30) x 109 кл/л; р1-2 > 0,05; р2-3 > 0,05; р13 < 0,0001) и повышением общего количества сегментированных клеток (с 2,70 (2,10-3,89) до 3,71 (3,10-5,51) x 109 кл/л, р1-2 = 0,01; р2-3 > 0,05; р1-3 < 0,0001). В структуре сегментограммы не установлено различий между первой и второй группами, однако в третьей группе отмечается значительное увеличение всех форм нейтрофилов (табл. 2). Таблица 2 Структура нейтрограммы при различных концентрациях TNF-a Ме (Q1-Q3) Количество сегментов ядра, 109 кл/л TNF-a Значимость различий <10 пг/мл (1) до 20 пг/ мл (2) л /м 0 ( 2 > Два 0,76 (0,47-1,24) 0,73 (0,48-1,33) 7) ,2 7 1, <=* 1 02 ,7 (0, р1-2 > 0,05 р2-3 > 0,05 р1-3 = 0,05 Три 1,24 (0,97-1,71) 1,48 (0,83-2,21) 1,90 (1,49-2,31) 5 5 01 ,0 ,0 00 0 0 0, Л> Л> " Четыре 0,54 (0,38-0,74) 0,69 (0,36-1,15) 7) ,6 0 1, <=* 1 02 ,5 (0, р1-2 > 0,05 р2-з > 0,05 р1 , = 0,005 Пять и более 0,04 (0,01-0,11) 0,10 (0,03-0,30) 7) ,2 6 0, 1 08 ,0 (0, р1-2 = 0,003 р2-3 > 0,05 р1-3 < 0,0001 Не выявлено статистически значимых различий в содержании лимфоцитов (соответственно группам исследования - 2,14 (1,77-2,87); 2,35 (2,02-2,80) и 2,34 (1,86-2,88) x 109 кл/л). Изучение морфологии лимфоцитов показало, что повышенные концентрации TNF-a связаны со снижением числа больших лимфоцитов (с 0,36 (0,23-0,54) до 0,23 (0,6-0,35) x 109 кл/л, р1-2 = 0,008; р1-3 = 0,004) и средних по размеру клеток (с 1,00 (0,79-1,51) до 0,63 (0,48-0,83) x 109 кл/л, р1-2 = 0,03; р2-3 = 0,02; р1-3 < 0,0001).Содержание малых лимфоцитов соответственно растет (с 0,64 (0,40-1,05) до 1,43 (1,08-1,78) x 109кл/л, р1-2 = 0,001; р2-3 = 0,05; р13 < 0,0001). Концентрации данного цитокина менее 10 пг/мл усиливают пролиферацию В-клеток с повышением содержания CD10+ с 0,45 (0,35-0,55) до 0,55 (0,37-0,90) x 109 кл/л (р = 0,04). При этом число клеток, обеспечивающих антителозависимую клеточную цитотоксичность CD23+, значительно повышается при концентрации TNF-a более 20 пг/мл с 0,45 (0,32-0,77) до 0,66 (0,49-0,79) x 109 кл/л - третья группа (р = 0,02). Влияния TNF-a на Т-клеточную лимфопролиферацию в данных обследуемых группах не установлено. При изучении соотношения содержания клеток с маркерами ранней активизации CD25+ и CD71+ показано, что доли энергодефицитных пролиферирующих клеток, требующих дополнительного энергетического ресурса от общего количества зрелых Т-клеток, в первых двух группах одинаковы - 20,41 и 24,00 %, а при ингибиции пролиферации отмечается резкое её снижение до 7,01 %. Это может свидетельствовать о снижении активизации клетки посредством IL-2, так как доля клеток с рецептором к трансферрину от общего содержания зрелых Т-лимфоцитов во всех группа остается одинаковой (соответственно 73,47; 76,00; 78,95 %). Повышение концентрации TNF-a ассоциирует со снижением содержание АФП с 3,48 (1,83-7,17) до 0,97 (0,59-1,76) Ме/мл (р < 0,0001). В первой группе доля лиц с повышенными концентрациями онкомаркера (более 5 Ме/мл) составила 27,54 %, во второй - 15,62 %, в третьей - 3,03 %. Обсуждение результатов Таким образом, физиологические концентрации цитокинов, в том числе и относительно низкие, обусловливают пролиферацию клеток врожденного иммунитета - нейтрофилов (TNF-a) и натуральных киллеров (IL-4, IFN-y), а также T- и В- лимфоцитов-клеток, обеспечивающих адаптивный иммунитет. Повышенные концентрации цитокинов, напротив, подавляют процессы активации и пролиферации. Такое влияние провоспалительных и противовоспалительных цитокинов (TNF-a, IFN-y, IL-4, IL-6) обеспечивает адекватное клеточное взаимодействие и регуляцию иммунного гомеостаза. Ингибиция активности повышенными концентрациями не связана с инициацией апоптоза, так как активность апоптоза иммунокомпетентных клеток нарастает на фоне пролиферации, а в случаях ингибиции активность апоп-тоза снижается. Нет оснований считать, что процесс подавления активности клетки большими дозами ци-токина связан с дефицитом энергетического ресурса, 31 Экологическая физиология Экология человека 2015.12 поскольку содержание CD71 + в этой ситуации не повышается, а, напротив, снижается. Возможно, что в подавлении активности клеток большими дозами провоспалительных цитокинов играет роль снижение содержания ядерного фактора активации, стимулирующего продукцию IL-2. Ещё одним из механизмов ингибиции активности иммунокомпетентных клеток большими концентрациями цитокина может быть активизация шеддинга - слущивания с поверхности клетки рецепторов. Повышение концентраций в крови АФП и РЭА - гликопротеидов муцинового типа - является отражением повышенного уровня их шед-динга эпителиоцитами слизистых. Физиологическая роль этих гликопротеинов связана с пролиферацией. Пролиферативное влияние проявляется увеличением концентраций CD25+, CD71+, HLADR+, CD10+, которое приводит к повышению содержания дифференцированных иммунокомпетентных клеток, обеспечивающих клеточно-опосредованную защиту, а также антителообразование. Доказано, что лим-фопролиферация под влиянием IL-6 ассоциирована с увеличением содержания IgE; влияния IFN-y, TNF-a и IL-4 на концентрации иммуноглобулинов не установлено. Есть основание считать, что активизация дифференцировки иммунокомпетентных клеток соразмерна с уровнем их апоптоза [2, 8]. Данная закономерность влияния на пролиферацию цитокинов подтверждается относительно активации пролиферативных реакций IFN-y, что, возможно, объясняется более значимой ролью этого цитокина в дифференцировке иммунокомпетентных клеток, чем в их активации. Вероятно, для активизации клеток требуются значительно меньшие концентрации цитокинов, чем для их дифференцировки [4], что подтверждается снижением в лизате клеток концентрации ядерного фактора активации NFATd при высоких концентрациях IFN-y. Повышенные концентрации цитокинов, напротив, подавляют пролиферативную способность лимфоцитов, что проявляется снижением содержания натуральных киллеров, лимфоцитов с рецепторами к Fc-фрагменту Ig, цитотоксических лимфоцитов и клеток, ориентированных на дифференцировку В-лимфоцитов. И в этих условиях закономерность четкого соответствия уровней активности иммунной реакции и апоптоза подтверждается относительно влияния IFN-y. Накоплению цитокинов способствует дефицит энергетического ресурса (АТФ), что подтверждается увеличением уровня лактата у обследуемых людей с повышенным содержанием цитокинов. В литературе имеются единичные сведения об активации пролиферативных процессов провоспали-тельными цитокинами путем стимуляции проведения митогенного сигнала, изменения метаболизма для получения дополнительной энергии, увеличения активности липолиза и окисления жиров [13, 17]. Ингибиторное влияние повышенных концентраций провоспалительных цитокинов на пролиферацию вряд ли можно объяснить подавлением экспрессии рецепторов, ибо концентрации IL-10, ингибиторный эффект которого определяется именно снижением рецепторной активности клетки, не оказывает существенного влияния на пролиферацию, диффе-ренцировку и апоптоз иммунокомпетентных клеток. Однотипность влияния повышенных концентраций ци-токинов указывает на единый механизм ингибиторного действия, которым может быть индукция экспрессии ингибиторных молекул активизации тирозинкиназ. Список литературы 1. Александрова Н.П., Исаев Г.Г. Проблема утомле

Об авторах

Вероника Павловна Патракеева

Институт физиологии природных адаптаций Уральского отделения Российской академии наук

Email: repina-veronika@yandex.ru
кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории регуляторных механизмов иммунитета и экологической иммунологии 163000, г. Архангельск, пр. Ломоносова, 249

Список литературы

Дополнительные файлы