CYTOKINE REGULATION OF PROLIFERATIVE ACTIVITY OF PERIPHERAL BLOOD CELLS

Full Text

Цитокиновая сеть обеспечивает всеобщую взаимосвязь систем организма посредством своих рецепторов, расположенных на мембране практически всех клеток. Цитокины, в том числе провоспалительные, секретируются любыми клетками. Многие цитокины имеют общие рецепторы, в связи с чем оказывают синергичное действие или дублируют друг друга. Цитокины регулируют пролиферативную активность иммунокомпетентных клеток, активируя Т- и В-лимфоциты посредством экспрессии гена рецепторов к цитокину и самого цитокина [6, 7, 9, 14, 15, 18, 20]. Провоспалительные цитокины могут и снижать функциональную активность клеток, возможно, путем индукции экспрессии ингибиторных молекул или посредством активизации тирозинкиназ [1, 10, 12, 16, 20]. Механизмы прямо противоположного влияния цитокинов по принципу обратной связи в достаточной степени не ясны. Известно, что IFN-y и IL-4 индуцируют экспрессию циклинзависимой киназы (Cdk) ингибитора p21Waf1, который требуется для IL- 4-зависимой ингибиции пролиферации макрофагов. IL-4 ингибирует M-CSF-зависимую Cdk-2 и Cdk-4 активацию, которые необходимы для прохождения 5-фазы клеточного цикла [11]. IL-4 макрофагов, увеличивая продукцию противовоспалительных ци-токинов натуральными киллерами Т-происхождения, обеспечивает противовоспалительное действие [19]. Повышенные концентрации провоспалительных ци- 28 Экология человека 2015.12 Экологическая физиология токинов установлены при воспалительных процессах, опухолях, гиперчувствительности замедленного и немедленного типов, метаболическом синдроме и аутосенсибилизации [7, 12, 20]. Таким образом, цитокины могут оказывать различное влияние на иммунокомпетентные клетки. Однако не установлено, что является определяющим в направлении развития пролиферативных реакций, уровень цитокина в крови, способ его влияния на клетки местный или системный, либо способность выполнять роль посредника для каких-либо других факторов активизации. Методы Проведено изучение иммунологического статуса и пролиферативной активности лейкоцитов периферической крови у 234 практически здоровых людей в возрасте от 20 до 50 лет. Забор крови для исследования проводился из локтевой вены в утренние часы. Определяли содержание фенотипов лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+, CD10+, CD16+, CD25+, CD71 + , CD95+, HLA-DR+, CD23+) методом непрямой иммунопероксидазной реакции с применением моноклональных антител (НПЦ «МедБиоСпектр» и ООО «Сорбент», г. Москва). Количество и соотношение клеток гемограммы, нейтрограммы, моноцитограммы [3] и лимфоцитограммы [5] подсчитывали в мазках крови, окрашенных по методу Романовского - Гимза. Содержание цитокинов (IL-6, IL-4, IL-10, TNF-a и IFN-y), онкомаркеров (раково-эмбриональный антиген - РЭА и альфа-фетопротеин - АФП) определяли в сыворотке и плазме крови иммуноферментным методом с использованием тест-наборов производства Bender MedSystems, Fujirebio Diagnostics. Inc, измерение оптической плотности проводили на фотометре Multiscan MS. Результаты исследования для каждого цитокина были разделены на группы. Первая и вторая группы выделены относительно медианы содержания цитокинов в выборке, третья - с повышенными их концентрациями. Полученные результаты были подвергнуты статистической обработке с применением пакета прикладных программ Statistica 10. Результаты непараметрических методов обработки представлены в виде медианы (Me) и интерквартильного размаха в виде 25 и 75 перцентилей (Q1-Q3). Статистическая значимость различий определялась с помощью непараметрического критерия Манна - Уитни и медианного теста. Корреляционный анализ проведен с использованием ранговой корреляции Спирмена (р < 0,05). Критический уровень значимости (p) в работе принимался равным 0,05. Результаты Для изучения влияния IL-6 на пролиферативную активность лимфоцитов, нейтрофилов и моноцитов результаты исследования были разделены на три группы: первая - с содержанием IL-6 в сыворотке крови менее 8 пг/мл (3,21-4,79-6,98), вторая - с содержанием IL-6 до 20 пг/мл (9,35-10,74-13,26) и третья - с повышенной концентрацией цитокина более 20 пг/мл (25,19-26,76-31,41). В возрастном аспекте группы статистически не различаются (х2 = 3,83, df = 2, p = 0,15), средний возраст в выборке составил (34,11 ± 1,97) года. Показано, что повышение концентрации провос-палительного цитокина IL-6 более 20 пг/мл не связано с увеличением общего содержания лейкоцитов в периферической крови: 6,40 (5,10-7,70) - в первой группе; 7,50 (6,30-10,10) х 109кл/л - в третьей. Концентрации нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов статистически значимых различий не имели. Структуры моноцитограммы и нейтрограммы были также практически одинаковыми у лиц обследуемых групп. Увеличение концентрации IL-6 ассоциировано с более высоким содержанием малых лимфоцитов, концентрация которых фактически в 2 раза выше у лиц третьей группы, и значительным сокращение средних форм (табл. 1). Повышение уровня малых лимфоцитов под влиянием IL-6 косвенным образом свидетельствует об усилении выхода лимфоцитов из депо. Таблица 1 Структура лимфоцитограммы при различных концентрациях IL-6 Me (Q1-Q3) Лимфоциты, 109 кл/л Содержание IL-6 Значи мость различий <8 пг/мл (1) до 20 пг/ мл (2) >20 пг/мл (3) Малые 0,89 (0,59 - 1,34) 0,76 (0,51 - 1,32) 1,56 (0,63-2,04) р2-3 = 0,°1 р1 ,=0,02 Средние 0,88 (0,56-1,44) 0,86 (0,57-1,23) 0,61 (0,44 - 0,91) р1-3=0,01 Большие 0,32 (0,21-0,52) 0,27 (0,17 - 0,36) 0,20 (0,17 - 0,37) р>0,05 Влияние IL-6 на пролиферативную активность Т-лимфоцитов связано с активизацией механизмов, опосредованных трансферрином. Содержание CD71+ практически в 2 раза выше на фоне концентраций цитокина более 20 пг/мл: в среднем у лиц первой и второй групп уровень содержания Т-клеток с рецептором к трансферрину составил соответственно 0,39 (0,27-0,57) и 0,38 (0,24-0,59) х 109 кл/л; в третьей группе обследуемых людей - 0,63 (0,41 - 0,75) х 109 кл/л (р2-3 = 0,02). Известно, что сразу после экспрессии рецептора к трансферрину клетка начинает продуцировать IL-2. Число клеток с рецептором к IL-2 (CD25+) в первой группе составило 0,52 (0,35-0,76), во второй - 0,40 (0,32-0,57), в третьей - 0,59 (0,43-0,82) х 109 кл/л, р2 3 = 0,04. Анализ уровня различных фенотипов лимфоцитов свидетельствует о дозозависимом влиянии IL-6 на содержание клеток, обеспечивающих антителозависимую цитотоксичность CD23+. Их концентрация составила в первой группе 0,56 (0,38-0,80), во второй - 0,49 (0,30-0,70), в третьей - 0,37 (0,26-0,48) х109кл/л (р1-3 = 0,004). Повышение концентрации IL-6 способствует активизации антителозависимых реакций, о чём 29 Экологическая физиология Экология человека 2015.12 свидетельствует значительное повышение уровня IgE с 23,74 (14,81-75,62) в первой группе до 148,4 (76,89-307,20) Ме/мл - в третьей (р = 0,005). Итак, более высокие концентрации IL-6 способствуют увеличению содержания лимфоцитов, вероятно, за счёт их перераспределения, а также стимулирования энергозависимого механизма активизации лимфопролиферации и механизма, опосредованного IL-2. Таким образом, данный цитокин, обеспечивающий стресс-реакции в организме и развитие воспалительного процесса, способствует повышению энергетического потенциала лимфоцитов. Установлена обратная зависимость содержания IL-6 и РЭА (r = -0,20; p < 0,05). Уровни РЭА у лиц с высокими концентрациями цитокина снижаются с 1,24 (0,66-1,99) до 0,72 (0,15-1,48) нг/мл (р = 0,05; U = 399,5), вероятно, за счет ингибиции шеддинга мукополисахарида со слизистых. Пределы колебания концентраций IL-10 были незначительными; влияние IL-10 на пролиферацию клеток периферической крови определяли в двух группах с концентрацией цитокина менее 2 пг/мл (0,90-1,24-1,70) и более 3,5 пг/мл (3,62-4,41 - 5,20). Не удалось установить значимого различия в уровне пролиферации нейтрофильных гранулоцитов. Содержание палочкоядерных нейтрофилов в первой группе составило в среднем 0,35 (0,24-0,54), во второй - 0,34 (0,18-0,64) x 109 кл/л. В структуре нейтрограммы также не выявлено статистически значимых различий. Концентрация моноцитов в обеих группах была практически одинаковой и составила соответственно 0,45 (0,33-0,62) и 0,44 (0,25-0,66) x 109 кл/л. Содержание лимфоцитов при концентрации IL-10 менее 2 пг/мл в среднем составило 2,25 (1,76-2,97), при повышении уровня цитокина более 3,5 пг/мл - 2,13 (1,71-2,47) х 109 кл/л. Таким образом, противовоспалительный цитокин IL-10 в концентрациях 0,9 - 5,20 пг/мл не оказывает существенного ингибиторного влияния на уровни пролиферации лимфоцитов, нейтрофилов и моноцитов. Мнение о возможном ингибиторном воздействии IL-10 основывается на его способности подавлять рецепторную активность клеток. Остается предполагать, что подавление активности клеток и её пролиферативной способности IL-10 происходит при более высоких его концентрация. Влияние IL-4 изучено в трех группах обследуемых лиц: с концентрацией интерлейкина менее 6 пг/ мл (1,48-2,58-4,10) и до 50 пг/мл (7,14-10,26- 11,08); в третьей группе содержание цитокина было выше физиологических норм, более 50 пг/мл (71,22-76,31-91,57). Влияние IL-4 дозозависимо: высокие концентрации подавляют пролиферацию лимфоцитов, не влияя на пролиферативные способности моноцитов и нейтрофильных гранулоцитов. Изучение структуры нейтрограммы и моноцитограммы подтверждает отсутствие взаимосвязей изменения количества палочкоядерных нейтрофилов и промоноцитов при различной концентрации IL-4 в крови. Установлены отрицательные корреляционные взаимосвязи общего содержания лимфоцитов и IL-4 (r = -0,26), также уровня содержания больших лимфоцитов и данного цитокина (r = -0,26). Низкие концентрации IL-4 значительно повышают пролиферацию Т-клеток с маркером CD25: 0,50 (0,38-0,74) x 109 кл/л - в первой группе и 0,32 (0,27-0,56) x 109 кл/л во второй (р = 0,02, U = 260). При уровне IL-4 более 50 пг/мл пролиферация клеток, обусловленная IL-2, также снижается относительно уровня в первой группе - 0,34 (0,24 - 0,47) x 109 кл/л (р = 0,02, U = 148). Аналогичное влияние установлено и для клеток с рецептором к главному комплексу гистосовместимости класса HLA-DR+ (r = -0,41). Показано, что более низкие физиологические концентрации IL-4 стимулируют активизацию лимфоцитов путем экспрессии HLA-DR: в первой группе содержание данных Т-клеток в среднем составило 0,61 (0,41-0,81) х 109 кл/л; во второй и третьей соответственно - 0,38 (0,25-0,60) и 0,33 (0,20-0,47) x 109 кл/л, (р1-2 = 0,01, р1-3 = 0,001). Таким образом, IL-4 способен влиять как на раннюю активацию Т-клеток, так и на позднюю. Не установлено влияния физиологических концентраций IL-4 на пролиферацию клеток путем экспрессии гена рецептора к трансферрину CD71 +. Низкие концентрации IL-4, способствуя лим-фопролиферации, преимущественно стимулируют активизацию CD 16+ и CD23+; высокие, напротив, способствуют снижению концентрации этих клеток с рецепторами к Fc-фрагментам иммуноглобулинов. Так, содержание CD16+ и CD23+ составило соответственно 0,43 (0,33-0,66) и 0,58 (0,38-0,77) х 109 кл/л при низких концентрациях цитокина; при повышенных уровнях содержания цитокина концентрации активированных клеток были в 2 раза ниже (соответственно 0,25 (0,22-0,44) х 109кл/л, р = 0,01, U = 139) и 0,30 (0,20-0,38) x 109 кл/л, р = 0,001, U = 100). Влияние IFN-y изучали при концентрациях в крови менее 10 пг/мл, до 50 и более 50 пг/мл. Общее содержание лейкоцитов статистически значимо было выше в первых двух группах и составило соответственно 6,20 (4,90-7,50) и 7,40 (6,00-9,20) х 109 кл/л, в третьей группе концентрация лейкоцитов снижается до 4,75 (4,10-5,65) x 109 кл/л (р < 0,0001, х2 = 17,82). Влияние низких концентраций IFN-y на пролиферацию нейтрофилов проявляется увеличением числа палочкоядерных форм до 0,33(0,18-0,53) х 109 кл/л по сравнению с уровнями содержания во второй и третьей группах - 0,24 (0,10-0,35) и 0,23 (0,13-0,37) x 109 кл/л, р12 = 0,004). Физиологические концентрации IFN-y до 50 пг/мл стимулируют лимфопролифе-рацию, что сопровождается как увеличением общего числа циркулирующих лимфоцитов (1-я группа 2,20 (1,69-2,71), 2-я - 2,35 (1,86-2,89), 3-я - 1,39 (1,21 - 1,52) x 109 кл/л, р1-3 = 0,001, р23 <0,0001), так и бластных форм (соответственно 0,26 (0,16-0,41), 0,25 (0,19-0,39), 0,13 (0,11-0,17) х 109 кл/л, р1-3 = 0,010, р2-3 = 0,004). 30 Экология человека 2015.12 Экологическая физиология Увеличение уровня содержания IFN-y в пределах физиологических норм способствует повышению активизации лимфоцитов посредством IL-2 с увеличением концентраций CD25+ (1-я группа 0,40 (0,27-0,65), 2-я - 0,53 (0,37-0,71), 3-я - 0,28 (0,21-0,29) x 109 кл/л, р1-2 = 0,02; р2-3 < 0,0001; р1-3 = 0,020). Подобная закономерность наблюдается относительно содержания клеток CD71 + (соответственно 0,45 (0,26-0,64), 0,38 (0,28-0,54) и 0,26 (0,22-0,36) x 109 кл/л, р1-3 = 0,030; р2-3=0,02). IFN-y обусловливает подобную зависимость относительно В-лимфоцитов: при низких концентрациях цитокина увеличивается количество В-клеток с маркерами ранней активизации (CD 10+), при увеличении содержания цитокина более 50 пг/мл уровень концентрация CD 10+ снижается в 2 раза (соответственно 0,51(0,27-0,74) и 0,25 (0,17-0,32) x 109 кл/л, р1-3 = 0,010; р2-3 = 0,001). Влияние TNF-a на пролиферацию клеток периферической крови изучали в трех группах обследуемых лиц: первая группа с концентрацией TNF-a в крови менее 10 пг/мл; вторая - до 20 пг/мл; третья - более 20 пг/мл. TNF-a не оказывает влияния на пролиферацию моноцитов; не установлено изменения в общем содержании данных клеток, а также в структуре моноцитограммы. Взаимосвязь пролиферации нейтрофилов и концентрации TNF-a проявляется значительным снижением в 2 раза числа палочкоядерных нейтрофилов (с 0,37 (0,24-0,55) до 0,19 (0,12-0,30) x 109 кл/л; р1-2 > 0,05; р2-3 > 0,05; р13 < 0,0001) и повышением общего количества сегментированных клеток (с 2,70 (2,10-3,89) до 3,71 (3,10-5,51) x 109 кл/л, р1-2 = 0,01; р2-3 > 0,05; р1-3 < 0,0001). В структуре сегментограммы не установлено различий между первой и второй группами, однако в третьей группе отмечается значительное увеличение всех форм нейтрофилов (табл. 2). Таблица 2 Структура нейтрограммы при различных концентрациях TNF-a Ме (Q1-Q3) Количество сегментов ядра, 109 кл/л TNF-a Значимость различий <10 пг/мл (1) до 20 пг/ мл (2) л /м 0 ( 2 > Два 0,76 (0,47-1,24) 0,73 (0,48-1,33) 7) ,2 7 1, <=* 1 02 ,7 (0, р1-2 > 0,05 р2-3 > 0,05 р1-3 = 0,05 Три 1,24 (0,97-1,71) 1,48 (0,83-2,21) 1,90 (1,49-2,31) 5 5 01 ,0 ,0 00 0 0 0, Л> Л> " Четыре 0,54 (0,38-0,74) 0,69 (0,36-1,15) 7) ,6 0 1, <=* 1 02 ,5 (0, р1-2 > 0,05 р2-з > 0,05 р1 , = 0,005 Пять и более 0,04 (0,01-0,11) 0,10 (0,03-0,30) 7) ,2 6 0, 1 08 ,0 (0, р1-2 = 0,003 р2-3 > 0,05 р1-3 < 0,0001 Не выявлено статистически значимых различий в содержании лимфоцитов (соответственно группам исследования - 2,14 (1,77-2,87); 2,35 (2,02-2,80) и 2,34 (1,86-2,88) x 109 кл/л). Изучение морфологии лимфоцитов показало, что повышенные концентрации TNF-a связаны со снижением числа больших лимфоцитов (с 0,36 (0,23-0,54) до 0,23 (0,6-0,35) x 109 кл/л, р1-2 = 0,008; р1-3 = 0,004) и средних по размеру клеток (с 1,00 (0,79-1,51) до 0,63 (0,48-0,83) x 109 кл/л, р1-2 = 0,03; р2-3 = 0,02; р1-3 < 0,0001).Содержание малых лимфоцитов соответственно растет (с 0,64 (0,40-1,05) до 1,43 (1,08-1,78) x 109кл/л, р1-2 = 0,001; р2-3 = 0,05; р13 < 0,0001). Концентрации данного цитокина менее 10 пг/мл усиливают пролиферацию В-клеток с повышением содержания CD10+ с 0,45 (0,35-0,55) до 0,55 (0,37-0,90) x 109 кл/л (р = 0,04). При этом число клеток, обеспечивающих антителозависимую клеточную цитотоксичность CD23+, значительно повышается при концентрации TNF-a более 20 пг/мл с 0,45 (0,32-0,77) до 0,66 (0,49-0,79) x 109 кл/л - третья группа (р = 0,02). Влияния TNF-a на Т-клеточную лимфопролиферацию в данных обследуемых группах не установлено. При изучении соотношения содержания клеток с маркерами ранней активизации CD25+ и CD71+ показано, что доли энергодефицитных пролиферирующих клеток, требующих дополнительного энергетического ресурса от общего количества зрелых Т-клеток, в первых двух группах одинаковы - 20,41 и 24,00 %, а при ингибиции пролиферации отмечается резкое её снижение до 7,01 %. Это может свидетельствовать о снижении активизации клетки посредством IL-2, так как доля клеток с рецептором к трансферрину от общего содержания зрелых Т-лимфоцитов во всех группа остается одинаковой (соответственно 73,47; 76,00; 78,95 %). Повышение концентрации TNF-a ассоциирует со снижением содержание АФП с 3,48 (1,83-7,17) до 0,97 (0,59-1,76) Ме/мл (р < 0,0001). В первой группе доля лиц с повышенными концентрациями онкомаркера (более 5 Ме/мл) составила 27,54 %, во второй - 15,62 %, в третьей - 3,03 %. Обсуждение результатов Таким образом, физиологические концентрации цитокинов, в том числе и относительно низкие, обусловливают пролиферацию клеток врожденного иммунитета - нейтрофилов (TNF-a) и натуральных киллеров (IL-4, IFN-y), а также T- и В- лимфоцитов-клеток, обеспечивающих адаптивный иммунитет. Повышенные концентрации цитокинов, напротив, подавляют процессы активации и пролиферации. Такое влияние провоспалительных и противовоспалительных цитокинов (TNF-a, IFN-y, IL-4, IL-6) обеспечивает адекватное клеточное взаимодействие и регуляцию иммунного гомеостаза. Ингибиция активности повышенными концентрациями не связана с инициацией апоптоза, так как активность апоптоза иммунокомпетентных клеток нарастает на фоне пролиферации, а в случаях ингибиции активность апоп-тоза снижается. Нет оснований считать, что процесс подавления активности клетки большими дозами ци-токина связан с дефицитом энергетического ресурса, 31 Экологическая физиология Экология человека 2015.12 поскольку содержание CD71 + в этой ситуации не повышается, а, напротив, снижается. Возможно, что в подавлении активности клеток большими дозами провоспалительных цитокинов играет роль снижение содержания ядерного фактора активации, стимулирующего продукцию IL-2. Ещё одним из механизмов ингибиции активности иммунокомпетентных клеток большими концентрациями цитокина может быть активизация шеддинга - слущивания с поверхности клетки рецепторов. Повышение концентраций в крови АФП и РЭА - гликопротеидов муцинового типа - является отражением повышенного уровня их шед-динга эпителиоцитами слизистых. Физиологическая роль этих гликопротеинов связана с пролиферацией. Пролиферативное влияние проявляется увеличением концентраций CD25+, CD71+, HLADR+, CD10+, которое приводит к повышению содержания дифференцированных иммунокомпетентных клеток, обеспечивающих клеточно-опосредованную защиту, а также антителообразование. Доказано, что лим-фопролиферация под влиянием IL-6 ассоциирована с увеличением содержания IgE; влияния IFN-y, TNF-a и IL-4 на концентрации иммуноглобулинов не установлено. Есть основание считать, что активизация дифференцировки иммунокомпетентных клеток соразмерна с уровнем их апоптоза [2, 8]. Данная закономерность влияния на пролиферацию цитокинов подтверждается относительно активации пролиферативных реакций IFN-y, что, возможно, объясняется более значимой ролью этого цитокина в дифференцировке иммунокомпетентных клеток, чем в их активации. Вероятно, для активизации клеток требуются значительно меньшие концентрации цитокинов, чем для их дифференцировки [4], что подтверждается снижением в лизате клеток концентрации ядерного фактора активации NFATd при высоких концентрациях IFN-y. Повышенные концентрации цитокинов, напротив, подавляют пролиферативную способность лимфоцитов, что проявляется снижением содержания натуральных киллеров, лимфоцитов с рецепторами к Fc-фрагменту Ig, цитотоксических лимфоцитов и клеток, ориентированных на дифференцировку В-лимфоцитов. И в этих условиях закономерность четкого соответствия уровней активности иммунной реакции и апоптоза подтверждается относительно влияния IFN-y. Накоплению цитокинов способствует дефицит энергетического ресурса (АТФ), что подтверждается увеличением уровня лактата у обследуемых людей с повышенным содержанием цитокинов. В литературе имеются единичные сведения об активации пролиферативных процессов провоспали-тельными цитокинами путем стимуляции проведения митогенного сигнала, изменения метаболизма для получения дополнительной энергии, увеличения активности липолиза и окисления жиров [13, 17]. Ингибиторное влияние повышенных концентраций провоспалительных цитокинов на пролиферацию вряд ли можно объяснить подавлением экспрессии рецепторов, ибо концентрации IL-10, ингибиторный эффект которого определяется именно снижением рецепторной активности клетки, не оказывает существенного влияния на пролиферацию, диффе-ренцировку и апоптоз иммунокомпетентных клеток. Однотипность влияния повышенных концентраций ци-токинов указывает на единый механизм ингибиторного действия, которым может быть индукция экспрессии ингибиторных молекул активизации тирозинкиназ. Список литературы 1. Александрова Н.П., Исаев Г.Г. Проблема утомле

About the authors

V P Patrakeeva

Institute of Environmental Physiology, Ural Branch of Russian Academy of Sciences

Email: repina-veronika@yandex.ru

References

Supplementary files