INFLUENCE OF TECHNOGENIC POLLUTION ON SPECIES COMPOSITION AND PECULIARITIES OF BIOFILM FORMATION OF STAPHYLOCOCCI ISOLATED FROM BACTERIA CARRIERS

Full Text

Формирование стафилококкового бактерионосительства в полости носа и зева способствует возникновению различных гнойно-септических осложнений. При этом переход симбиотических взаимоотношений в патологический процесс определяется не только особенностями биологических свойств бактерий, но и состоянием организма человека [1, 3]. В свою очередь, состояние макроорганизма и уровень резистентности его различных биотопов, в том числе и носоглотки, определяют как возможность возникновения стафилококкового бактерионосительства, так и его исход. Известно, что неблагоприятные факторы окружающей среды, в частности техногенное загрязнение, могут негативно воздействовать на состояние резистентности макроорганизма, следовательно, могут способствовать и формированию бактерионосительства [2, 6, 7]. В этой связи логично предположить, что стафилококки, главным образом S. aureus, колонизирующие носоглотку, и прежде всего у резидентных бактерионосителей, характеризуются наличием определенных факторов персистенции, в их числе и способностью к образованию биопленок [10]. Находясь в микробном сообществе, бактерии получают оптимальные условия для существования и в значительной мере недоступны защитным факторам организма. Учитывая эти обстоятельства, можно полагать, что стафилококки, изолированные от детей, проживающих в регионах с различной техногенной нагрузкой, будут отличаться не только по видовому составу, частоте встречаемости, но и степени выраженности факторов персистенции, в частности биопленокообразованию. Цель работы - изучение видового разнообразия и пленкообразующей способности стафилококков, колонизирующих полость носа и зева у детей, проживающих в экологически благополучном и промышленном районах. Методы В качестве территорий с различной техногенной нагрузкой были выбраны пос. Сылва («экологически благополучный») и район г. Чусового вблизи ОАО «Чусовской металлургический завод» (ЧМЗ) Пермского края. В соответствии с данными Краевого управления федеральной службы роспотребнадзора первый из них характеризуется благоприятной экологической обстановкой, тогда как второй отличается высоким содержанием в воздухе загрязняющих веществ. На основании результатов проведенного в 2010-2012 годах мониторинга состояния атмосферного воздуха в зоне влияния ЧМЗ лабораториями отдела химико-аналитических методов исследования ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» (ФБУН ФНЦ МПТ УРЗН) г. Пермь качество воздуха на исследованной территории не соответствует действующим нормативным 48 Экология человека 2014.05 Медицинская экология документам (ст. 30 ФЗ «Об охране атмосферного воздуха» и раздела 4 СанПиН 2.1.6.1032-01 «Гигиенические требования к обеспечению качества атмосферного воздуха населенных мест») [4, 5]. Так, в атмосферный воздух г. Чусового в результате деятельности ЧМЗ ежегодно поступает более 8 тыс. тонн вредных веществ, при этом загрязняющие примеси включают около 80 различных компонентов (рис. ι). S углерода оксид ED азота диоксид Ш железа оксид ■ метан Ш кальций оксид Il прочие Структура выбросов в окружающий воздух стационарных источников загрязнения в г. Чусовом в 2010 году Важным показателем потенциальной опасности выбросов для здоровья населения является присутствие в пылегазовых смесях веществ I и II классов (чрезвычайно и высоко опасных веществ), из них наиболее значимы пятиокись ванадия и соединения марганца. Следует подчеркнуть, что при определении этих химических веществ в сыворотках крови практически здоровых детей г. Чусового (n = 45) уровень пятиокиси ванадия и соединений марганца превышал аналогичные показатели у детей, проживающих в пос. Сылва (n = 45), соответственно в 8,8 и 2 раза. В течение марта 2012 года проведено бактериологическое обследование типа «случай - контроль» 54 практически здоровых детей, посещающих детские дошкольные учреждения: 31 ребенка, проживающего в пос. Сылва, - группа сравнения и 23 жителей г. Чусового - группа наблюдения. Обе группы детей сопоставимы по полу и возрасту. Основными критериями для включения служили отсутствие на момент обследования каких-либо клинических проявлений заболеваний и возраст 5-6 лет. Исследования проводили в соответствии со стандартами Хельсинкской декларации 1975 года и ее пересмотра 1983-го с положительным заключением комитета по этике при ФБУН ФНЦ МПТ УРЗН. В качестве исследуемого материала использовали отделяемое из полости носа и полости зева, которое забирали стерильными ват ными тампонами, посев осуществляли на кровяной и желточно-солевой агары в соответствии с Приказом МЗ СССР № 535 [8]. Идентификацию выделенных культур бактерий рода Staphylococcus проводили с использованием Staphy-test 24 производства PLIVA-Lachema (Чехия), оценку результатов осуществляли с помощью компьютерной программы «Микроб-2». Проведена также количественная оценка степени роста стафилококков [8]. Биопленки выделенных культур выращивали в 96-луночных полистероловых планшетах для иммуноферментного анализа (Медпо-лимер, Россия). В 6 лунок каждого ряда планшета вносили по 100 микролитров инокулума определенного штамма стафилококка, содержащего 107 КОЕ/ мл, после чего планшеты инкубировали в течение 24 часов в термостате (37 °С). Через сутки планктонную культуру из всех лунок удаляли, биопленки дважды аккуратно промывали 10 мМ фосфатным буфером (рН 7,2), затем окрашивали 0,1 % раствором генцианвиолета с последующей спиртовой экстракцией связавшегося красителя для оценки общей биомассы образовавшихся пленок. Детекцию окрашенных экстрактов биопленок осуществляли на ридере Benchmark Plus (Bio Rad, США) при длинах волн 570 и 490 нм (O'Toole G., 2000). В качестве контроля использовали стерильный мясопептонный бульон. Обработку полученных данных проводили с помощью программ Excel и STATISTICA 6.0 [9]. Сравнение бинарных признаков осуществляли с помощью точного критерия Фишера однонаправленного (р), при построении четырехпольной таблицы сопряженности (2^2). Для оценки степени биопленкообразования определяли средние арифметические величины (M) и стандартное отклонение (M + SD). Поскольку по критерию Шапиро - Уилкса распределение признака не было нормальным (гауссовым), сравнение пленкообразующей способности стафилококков, выделенных от детей различных групп, проводили с помощью критерия Манна - Уитни (р). О статистически значимых различиях полученных результатов в сравниваемых группах судили по величине цифровых значений р, критический уровень значимости которого в данном исследовании принимался равным 0,05. Результаты У 61,2 % детей группы сравнения в полости носа (ПН) были выявлены бактерии рода Staphylococcus, в группе наблюдения их изолировали значительно чаще - у 95,6 %. Доля носителей S. aureus соответственно составила 12,9 и 26,1 % (табл. 1). Таблица 1 Частота колонизации у обследованных детей полости носа и зева бактериями рода Staphylococcus, % Выделенная культура Полость носа Полость зева Группа сравнения Группа наблюдения p Группа сравнения Группа наблюдения p Бактерии рода Staphylococcus (различных видов) 61,20 + 10,99 95,60+19,93 0,003 51,60+9,27 68,20+14,22 0,147 S. aureus 12,90±2,32 26,10+5,44 0,189 3,20+0,57 52,20+10,88 <0,001 Примечание. р - точный критерий Фишера однонаправленный. 49 Медицинская экология Экология человека 2014.05 Таблица 2 Доля бактерионосителей стафилококков у обследованных детей с различной степенью обсемененности полости носа и зева, % Степень обсемененности Полость носа Полость зева Группа сравнения Группа наблюдения p Группа сравнения Группа наблюдения p I 52,60±9,45 31,80±6,63 0,151 56,25±10,10 12,50±2,77 0,012 II 21,10±3,61 9,10±1,9 0,262 31,25±5,61 62,50±13,91 0,078 III 26,30±4,72 13,60±2,84 0,265 12,50±2,25 25,00±4,17 0,327 IV 0 45,50±9,49 <0,001 0 0 Примечание. р - точный критерий Фишера однонаправленный. В зеве стафилококки были обнаружены практически у половины - 51,6 % детей группы сравнения и у 68,2 % группы наблюдения. Носительство золотистых стафилококков регистрировали у 3,2 % детей первой группы и у 52,2 % второй (см. табл. 1). На основании результатов оценки количества выросших при первичном посеве колоний стафилококков у каждого ребенка изучена степень обсемененности слизистых ПН и полости зева (ПЗ) (табл. 2). Из представленных материалов следует, что у 72,7 % детей группы сравнения в ПН обнаружили I-II степени обсемененности, тогда как обсеменен-ности IV степени не наблюдали. В зеве у этой группы детей выявили те же закономерности - преобладала I-II степень обсемененности (87,5 % случаев); III - у 12,5 %. В то же время в группе наблюдения обсеменен-ность слизистых носа и зева была значительно выше. Так, почти у половины (45,5 %) детей в ПН выявили IV степень, а в зеве у 66,7 % превалировала II степень обсемененности. Видовая структура штаммов, изолированных от детей различных групп, существенно отличалась (табл. 3). Как свидетельствуют представленные материалы, у детей, проживающих в экологически благополучном районе, из ПН всего было выделено 26 штаммов различных видов, из зева - 16. При этом независимо от исследуемого биотопа отмечалось широкое видовое разнообразие коагулазоотрицательных стафилококков (КОС). Так, у детей этой группы были изолированы штаммы S. warneri, S. chromogenes, S. delphini, S. caprae, S. hominis, S. lugdunensis, S. xylosus. При этом превалировали S. epidermidis - 35,7 %. У этой же группы детей были выявлены S. aureus, которые присутствовали у 6,25 % детей в зеве и у 15,4 % - в полости носа. Идентичные виды стафилококков из ПН и ПЗ были обнаружены в 12,9 % случаев; в 9,7 % это были S. еpidermidis. Таким образом, среди обследованных детей группы сравнения было выявлено 5 бактерионосителей S. aureus (16,1 %), у четырех из них - в ПН. У детей группы наблюдения и в ПН, и в ПЗ видовой состав стафилококков был ограничен, как правило, двумя видами. Доминирующими являлись S. aureus - 48,6 % и S. еpidermidis - 40,5 %. Значительно чаще, чем у детей группы сравнения, выделяли S. aureus как из ПН - 27,3 % так и из ПЗ - 80,0 %. Важно отметить, что у 8 этих детей и ПН, и ПЗ были колонизированы одними и теми Видовая принадлежность стафилококков, изолированных из полости носа и зева у обследованных детей Таблица 3 Частота встречаемости в биотопах, Вид стафилококков Полость носа Полость зева Группа сравнения Группа наблюдения p Группа сравнения Группа наблюдения p S. aureus 15,40±2,77 27,30±5,69 0,256 6,25±1,12 80,00±16,68 <0,001 S. epidermidis 34,60±6,21 59,10±12,32 0,080 37,50±6,74 13,30±2,77 0,130 S. delphini 11,50±2,07 4,50±0,94 0,371 12,50±2,25 - 0,258 S. chromogenes 11,50±2,07 - 0,150 18,75±3,37 - 0,125 S. hominis 7,60±1,37 - 0,278 6,25±1,12 - 0,516 S. intermedius 3,80±0,68 - 0,542 6,25±1,12 - 0,516 S. warneri 3,80±0,68 4,50±0,94 0,712 - - S. lugdunensis 3,80±0,68 - 0,542 6,25±1,12 - 0,516 S. caprae 3,80±0,68 - 0,542 6,25±1,12 - 0,516 S. xylosus 3,80±0,68 4,50±0,94 0,712 - - S. vitulinus - - - - 6,70±1,40 0,525 Всего 26 / 100 22 /100 - 16 / 100 15 / 100 Примечание. р - точный критерий Фишера однонаправленный. 50 Экология человека 2014.05 Медицинская экология же видами стафилококков, идентичными по видовым характеристикам. У 6 это были штаммы S. aureus, у 2 - S. еpidermidis. В серии специальных экспериментов в сравнительном аспекте проанализирована способность выделенных изолятов, как золотистых стафилококков, так и представителей КОС, к образованию биопленок (табл. 4). Таблица 4 Пленкообразующая способность стафилококков, изолированных со слизистых зева и носа обследованных детей Вид стафило- Пленкообразующая активность штаммов, изолированных от детей p кокков группы сравнения группы наблюдения S. aureus 0,34+0,06 0,44+0,10 0,031 кос 0,53+0,12 1,21+0,36 <0,001 Примечание. р - критерий Манна - Уитни. Степень выраженности данного признака у штаммов, выделенных от детей разных групп, значительно варьировала. Культуры, изолированные от детей группы наблюдения, проявляли более высокую способность к биопленкообразованию. Это касалось штаммов как золотистого стафилококка, так и ко-агулазоотрицательных видов. При сравнении этого признака у штаммов КОС, изолированных от сравниваемых групп детей, выявлена более значительная разница. Так, если показатели пленкообразования у этих видов стафилококков у детей группы сравнения составили 0,53 + 0,12, то у детей группы наблюдения 1,21 + 0,36 (р < 0,001). Аналогичная тенденция прослеживалась и в отношении пленкообразования золотистых стафилококков, но разница не была столь значительной: 0,34 + 0,06 и 0,44 + 0,10 соответственно. В целом следует отметить, что штаммы КОС отличались более выраженной способностью к биопленкообразованию, чем культуры золотистого стафилококка. Обсуждение результатов Видовой состав стафилококков, колонизирующих нос и зев детей, проживающих в экологически благополучном районе, отличался широким видовым разнообразием. Доминирующим видом являлся S. epidermidis, который был изолирован от 41,9 % детей. У детей, находившихся под влиянием неблагоприятных экологических факторов, видовой спектр стафилококков зева и носа значительно сужается практически до двух видов - S. epidermidis и S. aureus. Таким образом, под влиянием техногенных загрязнений происходит изменение видового состава бактерий рода Staphylococcus в этих биотопах, с которыми связана их колонизационная резистентность. Как следствие, у этой группы детей освободившиеся ниши заселяются патогенными штаммами S. aureus. Не случайно носительство S. aureus в ПЗ выявлено практически у 50 % обследованных детей, проживающих на экологически неблагоприятной терри тории. Аналогичные данные, свидетельствующие об увеличении числа бактерионосителей стафилококков у лиц, проживающих в районах с неблагоприятной экологической ситуацией, приводятся и другими авторами [2, 3, 6]. Однако эти исследования касаются преимущественно носительства золотистых стафилококков. Важно также отметить, что на фоне действия металлополютантов происходит изменение биологических свойств штаммов стафилококков. Все изученные изоляты различных видов стафилококков характеризовались более выраженной способностью к образованию биопленок, которая достигала наибольших значений у представителей КОС. Этот фрагмент исследования представляется наиболее интересным. В свете полученных данных очевидно целесообразно дальнейшее сравнительное изучение ряда биологических свойств (факторов вирулентности и персистенции) различных видов стафилококков, изолированных от детей, проживающих в различных экологических условиях.

About the authors

S V Pospelova

Perm State Academy of Medicine named after Academician E. A. Wagner

Email: pospelova_svetlana@mail.ru

E S Gorovits

Perm State Academy of Medicine named after Academician E. A. Wagner

L M Lemkina

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms Ural Branch of Russian Academy of Sciences

References

Supplementary files