CONTEMPORARY PERCEPTION OF ANTIOXIDANT SYSTEM OF HUMAN ORGANISM

Full Text

Биохимические механизмы адаптации занимают ведущее место в процессах повышения резистентности организма к неблагоприятному влиянию различных факторов среды. Нормальная жизнедеятельность организма невозможна без развитой многоступенчатой системы регуляции и координации различных его функций, осуществляемых специальными веществами — биорегуляторами. Среди биорегуляторов, способных повышать защитно-приспособительные возможности организма, видное место занимают противоокислительные вещества, или антиоксиданты (АО) [1]. Известно, что при действии на организм различных неблагоприятных факторов химической и физической природы [ 1], биологических и социальных стрессоров чрезмерно усиливаются процессы свободнорадикального окисления [26]. В биологических системах можно выделить несколько типов свободных радикалов (СР). Одни из них образуются в качестве физиологических продуктов нормально протекающего обмена веществ, другие возникают при изменении условий жизнедеятельности. В числе последних — СР воды и органических молекул, образующиеся при действии на клетку ионизирующих и ультрафиолетовых излучений, различных токсических веществ, а также при многих заболеваниях. Процессы свободнорадикального окисления с участием активных форм кислорода (АФК) при достаточно низкой интенсивности относятся к нормальным метаболическим процессам [59, 61]. CP-процессы идут при любой патологии, причем тому или иному виду заболевания свойственны закономерные и характерные изменения их интенсивности. Многообразие биохимических реакций в большой степени обусловливается способностью СР при взаимодействии с различными веществами превращать их также в СР [36]. В этой связи особое значение имеют цепные реакции — химические процессы, протекающие с участием СР. Катализаторами таких реакций могут быть как конечные, так и промежуточные их продукты. Если в ходе цепной реакции встречаются два СР, то реакционная цепь обрывается, так как радикалы, взаимодействуя меладу собой, образуют валентнонасыщенную молекулу, не способную продолжать цепь. В то же время сколько бы раз ни происходили реакции радикалов с нейтральными молекулами, число радикалов не изменится, что находится в соответствии с известным в химии принципом неуничтожимости свободной валентности. Скорость цепного процесса будет зависеть как от количества образующихся СР, так и от количества гибнущих радикалов, точнее говоря, от соотношения этих показателей. Вот почему можно ускорить цепной процесс добавлением веществ, содержащих СР, или же путем воздействия некоторых физических факторов (например, ионизирующих излучений), способных индуцировать образование этих промежуточных соединений [24]. 50 Экология человека 2013.07 Экологическая физиология Радикалы кислорода индуцируют процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ), необходимые для процессов обновления фосфолипидов и регуляции проницаемости клеточных мембран. Важной физиологической функцией АФК является активация ряда мембранных белков и иммуноглобулинов, а также ферментов, регулирующих переключение метаболических путей и синтез макроэргических соединений в клетке. С процессами СРО непосредственно связаны окислительное фосфорилирование и скорость клеточного деления [59]. Перекись водорода может выступать в качестве метаболического сигнала для внутриклеточных процессов, приводящих к окислению специфических SH-групп протеинкиназ. Будучи активированными, эти белки транслоцируются в ядро и индуцируют экспрессию групп генов, продукты экспрессии которых ответственны за различные формы защитных реакций клетки. Такая двуликость свойств активизированных кислородных метаболитов предполагает, что в физиологических условиях существует некое динамическое равновесие между выработкой СР и их нейтрализацией [24], а также различные по организации механизмы его поддержания. Первоначально понятие АО ассоциировалось с химическими соединениями, непосредственно взаимодействующими с токсическими радикалами и нейтрализующими их. В настоящее время к АО относят более широкий класс соединений, тем или иным способом снижающих интенсивность свободнорадикальных реакций окисления [26]. Антиоксиданты контролируют уровень СРО и препятствуют накоплению токсичных продуктов окисления, участвуют в различных видах обмена веществ, способны изменять активность других регулирующих систем, участвуют в построении структурных элементов клетки [28]. Систему защиты тканей и клеток от токсических метаболитов кислорода и продуктов ПОЛ можно условно разделить на физиологическую — механизмы, осуществляющие регуляцию доставки и поступления кислорода к клеткам, и биохимическую — собственно антиоксидантная система (АОС) организма, включающая широкий класс химических соединений, снижающих активность радикальных окислительных процессов. Физиологический компонент системы антиоксидантной защиты организма обеспечивает равновесие между интенсивностью транспорта кислорода к клеткам и метаболическими процессами по его выгодной и безопасной утилизации. Биохимическую АОС организма условно можно разделить на специфическую и неспецифическую. Специфическая АОС направлена на разрушение АФК и продуктов их дальнейших превращений. Действие неспецифической АОС связано с предотвращением условий и возможностей утечки электронов и генерации АФК в ходе окислительновосстановительных реакций (в рамках окислительного фосфорилирования) или в процессе аутоокисления субстратов (микросомального окисления) [1]. Для понимания механизмов действия АО их можно разделить по точкам приложения или выполнения ими антирадикальной функции. Исходя из этого, среди АО возможно выделение первичных АО, например супероксиддисмутазы (СОД) и глутатионпероксидазы (ГП), препятствующих образованию новых радикалов кислорода, а также вторичных АО, захватывающих уже образовавшиеся радикалы, предотвращая накопление их избытка. К этой группе относят большой перечень веществ, иногда называемых «тушителями» — scavenger (англ.). Известно, что система ингибирования избыточного аутоокисления состоит из неферментативного и ферментативного звеньев. Патогенному воздействию АФК на организм противостоят специализированные ферментные системы. К специфическим AO-энзимам можно отнести СОД, каталазу, ГП, глутатионредуктазу (ГР) и трансферазы [7, 8]. Эта группа ферментов, локализующихся преимущественно внутриклеточно, обладает способностью разрушать СР, а также участвовать в разложении гидроперекисей нерадикальным путем. Энзимы антирадикальной защиты характеризуются высокой избирательностью действия, направленного против определенных радикалов; специфичностью клеточной и органной локализации; а также использованием в качестве стабилизаторов металлов, к которым относятся медь, цинк, марганец, железо и ряд других. Содержание AO-ферментов в различных тканях организма существенно различается. В нормальных условиях содержание ферментных АО относительно постоянно и мало зависит от пола, отмечается некоторое снижение их уровня с возрастом [52]. В условиях гипоксии и гипероксии, то есть состояний, усиливающих образование АФК, повышается уровень ферментных АО внутри клеток [25]. Ферментные АО практически всегда выполняют свою функцию внутри клеток, так как большая молекулярная масса молекул энзимов препятствует их выходу из клетки, это же является препятствием для проникновения внутрь клетки введенных в организм в виде лекарственных препаратов экзогенных ферментов (например, СОД) [21]. Их синтез и внутриклеточное содержание, как и большинства белков, находится под генетическим контролем и изменяется под влиянием ряда внешних воздействий, в том числе фармакологических. Среди неферментных АО можно выделить соединения, имеющие в своей структуре ароматическое кольцо, связанное с одной или несколькими гидроксильными группами (витамины С, D, E, К, F; убихиноны, триптофан, фенилаланин, флавоноиды, каротины и каротиноиды; вещества, имеющие в своем составе SH-группы) [24]. Этанол, манит, глюкоза и некоторые другие органические молекулы эффективно акцептируют синглетный кислород и гидроксильный радикал [28]. Для оценки АОА используют различные методы исследования, которые условно можно подразделить на две основные группы. В первом случае определяют уровень продуктов перекисного окисления в исследуемых образцах, например ПОЛ. Во втором 51 Экологическая физиология Экология человека 2013.07 случае АОА оценивают путем введения в изучаемые образцы сильных оксидантов, источников свободных радикалов, после чего определяют их концентрацию в анализируемом растворе спектрофотометрическим или люминисцентным и другими методами [57]. Хемилюминесцентный метод основан на открытом в 1961 году Б. Н. Тарусовым и его сотрудниками явлении — спонтанном непрерывном сверхслабом свечении тканей и биосред в видимой области спектра, обусловленном липидными структурами. Установлено, что биохемилюминесценция возникает в результате СРО липидов: кванты видимого участка спектра и соответствующие им электронные возбужденные состояния являются продуктами ПОЛ. Повышение спонтанной хемилюминесценции имеет место при усилении процессов ПОЛ, поскольку основным источником хемилюминесценции является реакция рекомбинации перекисных липидных радикалов. В присутствии ингибиторов свободнорадикальных реакций хемилюминесценция ослабляется, так как при этом снижается концентрация перекисных радикалов. Измерение спонтанного сверхслабого свечения осуществляется хемилюминометрами, в которых в качестве детектора слабых световых потоков служит фотоэлектронный умножитель [7, 8, 38, 52]. Химические методы определения интенсивности СРО липидов позволяют оценивать диеновую конъюгацию, которая проявляется на начальных этапах СРО, накопление гидроперекисей, обнаруживаемых на более поздних этапа, и вторичные продукты окисления — альдегиды, эпоксисоединения и др. Определение диеновых конъюгатов проводится спектрофотометрическим методом и основано на том, что СР в молекулах полиненасыщенных жирных кислот возникают сопряженные двойные связи. Это сопровождается повышением оптической плотности выделенных из биологических объектов растворов липидов в гексане в ультрафиолетовой области спектра при длине волны ~ 233 нм [1, 22]. Гидроперекиси липидов определяют чаще методом йодометрического титрования. Он основан на окислении содержащимися в липидах перекисями йодисто-водородной кислоты с последующим титрованием выделившегося йода тиосульфатом натрия. Для повышения чувствительности метода предложена амперометрическая регистрация точки эквивалентности, что позволяет определять в липидных экстрактах содержание перекисей в диапазоне концентраций 0,005—0,5 мкэкв в пробе. Рекомендован также спектрофотометрический метод определения гидроперекисей липидов, который основан на окислении перекисями Fe2+ в Fe3+, обнаруживаемый с помощью цветной реакции с тиоцианатом аммония при максимуме поглощения 480 нм [13, 22]. Об относительном уровне вторичных продуктов окисления часто судят по уровню малонового диальдегида, который определяют по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой. При этом образуется окрашенный триметиновый комплекс с максимумом поглощения при 532 нм. Суммарную пероксидазную активность определяют по реакции окисления бензидина перекисью водорода [1]. Определение оснований Шиффа — конъюгированных соединений, которые образуются при взаимодействии ряда продуктов ПОЛ с N-концевыми остатками белков, аминокислот, аминогруппами фосфолипидов. Принцип метода В. L. Fletcher (1973) заключается в том, что основания Шиффа имеют хромофорные системы, обладающие флюоресцентными свойствами (максимум возбуждения при ~ 370 нм и эмиссии при ~ 450 нм). Экстракцию продуктов липопероксида-ции из тканей осуществляют смесью хлороформа с метанолом, и с помощью спектрофлюориметра измеряют флюоресценцию. Привитая сополимери-зация позволяет оценить реакционную способность СР и их относительную концентрацию. Он основан на том, что некоторые ненасыщенные соединения, такие как акриламид, винилпирролидон и другие, могут полимеризоваться в присутствии СР. Приоритет применения метода привитой сополимеризации в биологических системах принадлежит советским биофизикам Ю. П. Козлову и Б. Н. Тарусову (1958). Для определения привитых сополимеров в клетках используют радиометрический метод. Он основан на использовании меченых по 14С или 3Н молекул мономера (акриламида). После сополимеризации со СР клеток радиоактивные полимеры остаются там, где они образовались, поэтому гомогенаты исследуемых тканей с меченым веществом анализировали посредством электрофореза и хроматографии и таким образом устанавливают локализацию СРО [1]. Биохимические методы исследования интенсивности ПОЛ и AO-обеспеченности основаны на определении в тканях и биосредах активности ферментных компонентов АОС: каталазы, глутатионпероксидазы (ГП), СОД, церуллоплазмина (ЦП) и неферментных компонентов: витаминов А, Е, С, содержание SH-групп, фракций глутатиона. Кроме того, часто используются интегральный показатель — АОА липидов биологического объекта, а также биохимические и клинико-физиологические критерии оценки обеспеченности организма витаминами С (например, лингвальный тест) и Е (определение перекисной резистентности эритроцитов) [21, 46]. Электрохимический метод основан на амперометрическом детектировании пероксида водорода на электродах, покрытых электроактивными материалами — сенсорами на пероксид водорода [6]. Существует мнение, что многие из известных методов оценки АОА неэффективны только потому, что в качестве окисляющих соединений используют те, которые в естественных условиях не встречаются в организме человека. Концентрация же свободных радикалов в биологических жидкостях in vivo в большинстве случаев незначительная, так как продолжительность жизни радикалов крайне низкая [48]. Принято считать, что пероксид водорода, как природный оксидант (концентрация его в крови может достигать 30 мкМ), более стабилен и менее реактивен в отличие от других 52 Экология человека 2013.07 Экологическая физиология окислителей, поэтому его использование в качестве окислителя значительно повышает эффективность современных методов исследования АОА внутренней среды организма. В этом отношении А. А. Карякиным была продемонстрирована эффективная возможность амперметрического детектирования концентрации пероксида водорода на электродах, покрытых берлинской лазурью [6]. Изучение характера изменений состояния основных звеньев АОС проводят в различных тканях органов [10, 11, 43], внутри- и внеклеточных жидкостях (бронхоальвеолярной, мозговой, плазме крови) [10, 16, 17, 39], в слюне [18, 20, 23, 26], пристеночном слизистом слое верхних отделов пищеварительного тракта [9, 16, 17]. В качестве материала для изучения свободнорадикальных процессов используют также клетки крови [43, 11, 23]. Водные среды организма, к которым относятся кровь, лимфа, ликвор, межклеточная и внутриклеточная жидкость, являются местом постоянного протекания окислительных процессов, обеспечивающих все виды обмена веществ. Транспорт молекулярного кислорода, аспирация радикалов гидрофобными АО из липидного слоя, поступление в гидрофильные среды организма АФК как результат интенсивной жизнедеятельности и патологических процессов — все эти постоянно протекающие процессы создают опасность возникновения «окислительного стресса». Присутствие в водных средах организма легкоокисляющихся липидных образований, таких как липопротеины, хиломикроны, холестерин, триглицериды и фосфолипиды, значительно увеличивают эту опасность. За стабильность прооксидантно-антиоксидантного равновесия жидкостных сред организма ответственны специализированные АО-системы [36], активность которых вполне приемлемо оценивать по АОА плазмы крови как сравнительно доступного материала для исследования. Неслучайно в большинстве исследований для оценки уровня свободнорадикальных процессов при разных функциональных и патологических состояниях используется плазма крови. В плазме крови АО представлены как ферментными, так и неферментными субстанциями. Так, в состав плазмы входят ЦП, трансферрин и лак-тоферрин. Некоторые ферменты АО содержатся в плазме в следовых количествах (СОД), другие из-за большого молекулярного веса молекул практически не проникают через клеточные мембраны (каталаза, ГП, ГР), что является некоторым препятствием для использования их в качестве фармакологических препаратов на практике [ 14, 15]. Кчислу АО неферментной системы плазмы крови относятся витамины (Е, С, D), каротиноиды, уроновые кислоты, билирубин, стероиды, некоторые аминокислоты, пурины, глюкоза и другие субстанции. Результаты определения количества калдого из указанных АО плазмы в отдельности трудны для интерпретации. С физиологической точки зрения в системе, генерирующей свободные радикалы, можно считать уместной альтернативу определения общей АОА [51, 52]. Согласно данным литературы, антиоксидантная активность плазмы крови зависит от состояния здоровья, стресса, питания [1, 16, 17, 19, 20, 30], возраста [29, 30], климатогеографических условий проживания [34, 35, 51] и других факторов. Доказано, что в условиях острого стресса наблюдается компенсаторное увеличение АО в плазме крови [ 18] и слюне [ 18, 20, 26], в то время как при длительном стрессе АОА организма снижается [26]. Имеется ряд работ, указывающих на взаимосвязь меладу характером питания и уровнем АО в различных тканях [9, 12, 51]. Показана возможность коррекции АОС пищевыми антиоксидантами [2, 9, 27, 36, 39]. Известно, что этанол обладает антиоксидантными свойствами [29], но при интоксикации алкоголем в основе токсического повреждения биомембран лежит механизм свободнорадикального окисления их липидного компонента с одновременным снижением антиоксидантной резистентности организма [47]. И. В. Зуевым [12] установлено снижение активности ГП и ГР в печени крыс, содержащихся на рационе с недостатком белка и калорий. По данным N. Weng и соавт. [60], наиболее значимым эффектом ограниченного по калорийности питания у подопытных крыс является уменьшение интенсивности свободнорадикальных процессов. Однако результаты подобных исследований на человеке в литературе освещены недостаточно. Несмотря на более чем тридцатилетнюю историю изучения роли радикальных процессов в патогенезе различных заболеваний человека и животных, перечень препаратов-антиоксидантов, вышедших за рамки экспериментальных и доклинических испытаний и использующихся в клинической практике, остается немногочисленным [36]. Существует мнение, что фармакологическая коррекция ферментной системы антиоксидантной защиты организма мало вероятна, поскольку активность обычных ферментов (СОД, каталаза, пероксидаза и др.) очень высока и специфична [49, 50]. В то же время о значении поступления в организм АО, содержащихся в продуктах питания, упоминается во многих работах [ 1, 5, 9, 19, 36]. Так, при уменьшении поступления в организм и усвоения экзогенных антиоксидантов (токоферола, аскорбата, других витаминов-биоантиоксидантов, биофлавонои-дов, полифенольных соединений) отмечено снижение АОА организма и избыточная липопероксидация [4, 25, 28, 37, 45, 58]. В исследованиях, посвященных изучению процессов старения, развития болезней, связанных со старением, упоминается возможность снижения развития указанных процессов. По мнению В. К. Кольтовер, никакие антиоксиданты, в том числе витамин Е, аскорбиновая кислота, флавоноиды и другие, не способны конкурировать с СОД и другими антиоксидантными ферментами за перехват in vivo, поскольку проигрывают ферментам много порядков по константам скоростей реакции и концентрациям [15]. Однако является доказанным, что флавоноиды 53 Экологическая физиология Экология человека 2013.07 индуцируют повышение активности СОД и каталазы [54]. Кроме того, уровень СОД тесно коррелирует с уровнем гормонов кортизола в крови обезьян Масаса mulatto. [42], антиоксидант 4-метил-2,6-дитрибутилфенол вызывает рост уровня адренокор-тикотропного гормона и кортикостероидов, снижение уровня тиреотропина и Т3, а также появление оксида азота (N0) в крови крыс [49]. Таким образом, антиоксиданты снижают уровень свободных радикалов не путем их прямого перехвата, а превентивным профилактическим путем через гормональную регуляцию и N0. Следовательно, эффективные геропротекторы могут быть созданы на основе гормональной терапии и доноров N0 [15]. Остаются обсуждаемыми вопросы возрастных изменений АОА организма, поскольку на сегодняшний день каких-либо однозначно интерпретируемых результатов получено не было. По данным одних авторов, активность СОД тканей может повышаться с возрастом [41], результаты исследований других указывают на ее снижение [3]. Установлено, что генетически измененные дрозофилы с повышенной активностью СОД живут дольше нормальных мух [56], кроме того, ингибиторы свободнорадикальных механизмов (дибунол и преувеличивают на 20—30 % длительность жизни мышей [44]. При параллельном изучении продукции АФК тканями молодых и старых животных было показано, что в головном мозге старых животных почти в 2 раза снижается активность СОД [3, 53]. Это, однако, не приводило ни к повышению концентрации диеновых конъюгатов, ни к повышению показателей перекис-ного окисления белков или общей АОА (содержанию аскорбиновой кислоты, токоферола, мочевой кислоты, глутатиона и др.), концентрация же шиффовых оснований даже снижалась. В то же время в печени старых животных существенно повышалась концентрация шиффовых оснований и продуктов перекисного окисления белков при снижении активности СОД в 2 и более раза; но не изменялись уровень общей АОА и содержание диеновых конъюгатов. В сыворотке старых крыс существенно повышалось содержание продуктов ПОЛ и белков при снижении активности СОД и общей АОА сыворотки крови [3]. Данные, полученные на трансгенных дрозофилах с дополнительными копиями гена СОД и каталазы, показали увеличение средней и максимальной продолжительности жизни [56], трансгенные мыши с избыточной экспрессией СОД, каталазы и ГП обладали повышенной резистентностью к оксидативному стрессу, при снижении же активности этих генов мыши имели признаки преждевременного старения [45]. В отношении людей наблюдается противоположный результат. Синдром Дауна с укорочением продолжительности жизни вдвое сопровождается ростом активности СОД тканей [41]. В литературе отмечены данные о существенном снижении в сыворотке крови пожилых и старых людей (60—97 лет) уровня глутатиона и повышении продуктов ПОЛ [28], окислительного повреждения макромолекул, в том числе ДНК [33, 55]. Интересно, что эти изменения идут на фоне существенного снижения с возрастом генерации АФК в тканях старых животных и человека. С возрастом, безусловно, повышается содержание в тканях человека и животных продуктов окислительного повреждения макромолекул, в том числе ДНК [33. 55]. По мнению авторов, это указывает лишь на снижение скорости метаболизма для организма в целом [28]. В этих условиях снижается обновление всех макромолекул и биологических структур, что создает возможность для персистенции измененных форм макромолекул вследствие общего увеличения длительности их жизни [32]. «Свободнорадикальная теория старения», практически одновременно выдвинутая D. Harman и H. М. Эммануэлем, является одной из наиболее плодотворно развивающихся в последние годы фундаментальных теорий возрастных изменений [3, 31]. Теория объясняет не только механизм старения, но и широкий круг связанных с ним патологических процессов. Основное положение свободнорадикальной теории старения, сформулированное в 1954 году D. Harman, сводится к тому, что универсальной причиной старения служит свободнорадикальное окисление липидов, жиров и белков всех организмов кислородом воздуха [44]. В данном направлении было выполнено значительное число самых разнообразных работ, но каких-либо однозначно интерпретируемых результатов получено не было. Свободнорадикальные процессы по сей день остаются обсуждаемыми, однако все исследователи сходятся во мнении, что активные кислородные метаболиты занимают ведущее место в патогенезе многих заболеваний. По альтернативной концепции — старение запрограммировано в геноме, будучи заключительным этапом онтогенеза. Существует также мнение, что активность ферментов антиоксидантной защиты в принципе зависит от нейроэндокринной регуляции и может, таким образом, подтверждать не теорию повреждений, а регуляторную теорию возрастных изменений [33, 40]. Таким образом, согласно современным представлениям, АОС организма человека включает ферментативные и неферментативные антиоксиданты, действуя на внутри- и внеклеточном уровне они участвуют во многих физиологических процессах, активность АОС не является постоянным показателем, зависит от различных факторов и оценивается при помощи альтернативных методов исследования.

About the authors

E A Chanchaeva

Gorno-Altaisk State University

Email: chan.73@mail.ru
Gorno-Altaisk

R I Aizman

Novosibirsk State Pedagogical University

Novosibirsk, Russia

A D Gerasev

Novosibirsk State Pedagogical University

Novosibirsk, Russia

References

Supplementary files