THE ROLE OF ADHESION MOLECULES IN THE MIGRATION OF LEUKOCYTES FROM THE BLOOD TO THE CAPILLARIES OF PAPULES IN PATIENTS WITH PSORIASIS

Full Text

Формирование псориатической папулы связано, с одной стороны, с изменением кинетики кератино-цитов, проявляющимся акантозом, гиперкератозом и паракератозом, а также папилломатозом, с другой - с инфильтрацией сосочков дермы и эпидермиса, в меньшей степени верхних отделов сетчатой дермы нейтрофилами, моноцитами и лимфоцитами [5, 8]. Движение лейкоцитов в очаг поражения начинается с серии адгезионных событий, каждое из которых касается лейкоцитов определенного типа: нейтрофилов, моноцитов или лимфоцитов. Нейтрофильные лейкоциты, покинув микроциркуляторное русло, больше в него никогда не возвращаются, тогда как моноциты и лимфоциты возвратиться способны [7]. Процесс миграции лейкоцитов в ткани представляет собой трехступенчатый процесс, включающий скольжение - «роллинг» - лейкоцитов по поверхности эндотелия с последующей фазой «прочной адгезии» и заканчивающийся фазой «трансмиграции» лейкоцитов через эндотелий капилляров [3, 4]. Циркулирующие адгезионные молекулы способствуют миграции в очаг воспаления и закреплению лейкоцитов на эндотелии. Молекула L-селектина опосредует эффект «катящихся» лейкоцитов вдоль сосудистой стенки микроциркулярного русла - феномен, который многие исследователи рассматривают как «первый шаг» адгезии лейкоцитов к эндотелию, что, в свою очередь, приводит к их накоплению в зоне воспаления. Молекула ICAM-1 способствует адгезии лейкоцитов к эндотелию, связываясь с LFA-1 и LFA-3, а также в механизмах взаимодействия антигенпрезентирующих клеток с Т-лимфоцитами (формирование иммунного сигнала). Полагают, что под влиянием клеточных молекул адгезии ICAM-I прогрессирует дисфункция эндотелия, что ведет к развитию воспаления в сосудистой стенке, инфильтрации ее лейкоцитами. Молекула РЕСАМ-1 играет важную роль в процессе трансэндотелиальной миграции лейкоцитов, Блокирование РЕСАМ-1 (CD31) моноклональными антителами приводит к «задержке» лейкоцитов на апикальной поверхности эндотелиальной клетки [15]. Гистогематогенный обмен в коже осуществляется в капиллярах артериального типа, локализующихся в сосочках дермы, кожных железах и волосяных фолликулах, а также в посткапиллярных венулах, локализующихся в верхних отделах сетчатой дермы [11-14]. Следует отметить, что волосяные фолликулы и кожные железы в псориатический процесс не вовлечены [6]. С учетом того, что процессы миграции клеток крови из микроциркуляторного русла являются немаловажным механизмом в развитии иммунных реактивных изменений, определяющих сохранение гомеостаза, сведения относительно соотношения уровня и качества иммунных реакций в коже и периферической крови представляют, несомненно, теоретический и практический интерес. С одной стороны, соотношение уровня и качества иммунных реактивных реакций в коже с таковыми во внутренней среде организма позволяет судить о влиянии кожи как иммунного органа. С другой стороны, необходимость в изучении механизмов миграции и рециркуляции обусловлена поиском клинически значимых мишеней для противовоспалительной терапии, в роли которых могут выступать молекулы адгезии. Значимость результатов исследования в определенной степени обусловлена адекватностью выбранной методики. Исходя из этого, целью исследования было изучение роли молекул адгезии в механизмах миграции лейкоцитов крови в капилляры папулы у больных псориазом Капиллярная кровь с поверхности псо-риатической папулы выделяется в ходе определения псориатической триады, когда последовательно при поскабливании появляются феномены стеаринового пятна, терминальной пленки и точечного кровотечения [5, 11]. Методы Проведено клинико-иммунологическое обследование 82 пациентов (39 женщин и 43 мужчины) в возрасте от 20 до 60 лет, страдающих вульгарным и экссудативным псориазом в прогрессирующую и стационарную стадии. Давность заболевания составила от 3 месяцев до 10 лет. В качестве контрольной группы обследованы 50 практически здоровых лиц (28 женщин и 22 мужчины) в возрасте от 20 до 60 лет, не имеющих на момент обследования острых хронических заболеваний или их обострения. Различий по полу не было установлено. Обследование проводили с письменного согласия респондентов, с соблюдением основных норм биомедицинской этики в соответствии с документом «Этические принципы проведения медицинских исследований с участием людей в качестве субъектов исследования» (Хельсинкская декларация Всемирной медицинской ассоциации 1964 года с изменениями и дополнениями на 2008 год). На мазках венозной крови, взятой из кубитальной вены, и крови, полученной в виде феномена точечного кровотечения псориатической триады с поверхности псориатической папулы, локализованной на предплечье, зафиксированных в смеси Никифорова и окрашенных по Романовскому - Гимзе, определяли содержание нейтрофилов, эозинофилов, базофилов, моноцитов, лимфоцитов. В микроскопическом мазке венозной крови и крови, выделяемой с поверхности псориатической папулы, подсчитывали среднее количество фрагментов ядра у 100 нейтрофильных лейкоцитов. Индекс сегментации нейтрофилов изучали по формуле [2]: 1х + 2х + 3х + 4х + 5х Индекс сегментации =--, где х - количество сегментов в ядре нейтрофила. В соответствии с методом, предложенным О. П. Григоровой [1], проводили дифференцировку моноцитов по морфологии ядра на промоноциты, собственно моноциты и полиморфно-ядерные моноциты. При изучении лимфоцитограммы дифференцировали лимфоциты по величине клетки с учетом размеров цитоплазмы: малые лимфоциты - до 8 мкм, средние 38 Экология человека 2018.11 Медицинская экология - от 8 до 12 мкм, большие - больше 12 мкм [9]. На проточном цитометре FC-500 фирмы BeckmanCoulter (США) определяли количество нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов венозной крови, содержащих молекулы L-селектина (CD62L, FITC), LFA-1 - Lymphocyte Function-Assosiated antigen, 1 (CD 11a, FiTC), LFA-3 - Lymphocyte Function-Assosiated antigen, 3 (CD58, FITC), ICAM- 1 - Intercellular Adhesion Molecule-1 (CD54, FITC), PECAM-1 - Platelet/Endothelium Cell Adhesion Molecule (CD31, FITC). Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью SPSS 13.0 for Windows. Распределение параметров было ненормальным, в связи с чем описание выборок проводили с помощью подсчета медианы ^e) и межквартильного интервала (25 и 75 процентили). Вероятность различий оценивали по непараметрическом критериям Колмогорова -Смирнова (Z) и Вилкоксона (W). Корреляционный анализ проводили с использованием коэффициента корреляции Спирмена (р). Результаты Непосредственно в очаге поражения - в крови псориатической папулы концентрация нейтрофиль-ных лейкоцитов (рис. 1) была заметно ниже, чем в венозной: 36,32 (22,86; 43,02) % против 56,0 (51,0; 63.0) %; W = -3,81; р = 0,001. В сегментограмме крови, выделяемой с поверхности псориатической папулы (рис. 2), содержание 2-сегментных форм нейтрофилов выше, чем в венозной: 25,65 (17,29; 35,57) % против 14,0 (10,0; 23,0) %; W = -3,29;p = 0,001, в то время как концентрации 3- и 4-сегменто-ядерных форм нейтрофилов практически одинаковы: 40,66 (33,65; 50,91) % и 41,0 (34,0; 48,0) %; W = 0,78; p = 0,43 и 17,17 (7,27; 27,45) % и 27,0 (22,0; 34.0) %; W = -0,28; p = 0,77. Индекс сегментации в крови псориатической папулы был несколько ниже, чем в венозной крови: 2,83 (2,46; 3,04) против 3,17 (2,96; 3,43); W = -0,78; p = 0,43. Концентрация моноцитов (см. рис. 1) в капиллярной крови псориатической папулы была выше, чем в венозной: 18,67 (15,83; 24,0) % против 6,0 Рис. 1. Соотношение нейтрофилов, моноцитов, лимфоцитов в капиллярной крови псориатической папулы и венозной крови больных псориазом Примечания: по оси абсцисс - группы лейкоцитов; по оси ординат - содержание в процентах (Me); ** - р < 0,001 (непараметрический критерий Колмогорова - Смирнова). Рис. 2. Сегментограмма нейтрофилов капиллярной крови псори-атической папулы и венозной крови больных псориазом Примечания: по оси абсцисс - группы нейтрофилов в зависимости от количества сегментов; по оси ординат - содержание нейтро-филов в процентах (Me); ** - р < 0,001 (непараметрический критерий Колмогорова - Смирнова). (4,0; 8,0) %; W = -3,40; р = 0,001. Более высоким содержание становилось за счет статистически значимого повышения концентрации полиморфноядерных моноцитов - 65,15 (56,12; 74,58) % против 36,0 (30,5; 40,5) %; W = -3,29; р = 0,001, тогда как промоноциты практически не выявлялись, из-за чего медиана содержания этих клеток составила 0 (0; 6) %; W = -3,29; р = 0,001. Содержание собственно моноцитов было одинаковым в псориатической папуле и венозной крови: 34 (24; 36) % и 30 (22; 34) %; W = 0,65; р = 0,78 (рис. 3). Рис. 3. Моноцитограмма капиллярной крови псориатической папулы и венозной крови больных псориазом Примечания: по оси абсцисс - группы моноцитов в зависимости от морфологии ядра; по оси ординат - содержание моноцитов в процентах (Ma); ** - р < 0,001 (непараметрический критерий Колмогорова - Смирнова). Сравнение концентрации лимфоцитов (см. рис. 1) капиллярной крови, выделяемой с поверхности псо-риатической папулы и венозной крови, показало отсутствие различий в содержании общего количества лимфоцитов (34,0 (28,0; 43,0) % и 30,53 (26,83; 45,22) %; W = 0,01; р = 0,89), а также малых (33,0 (23,0; 50,0) % и 32,77 (18,41; 45,46) %; W = -0,72; р = 0,47) и средних (44,0 (37,0; 50,0) % и 47,12 (36,75; 58,87) %; W = -1,41; р = 0,15) лимфоцитов. Отличительным было заметное нарастание концентрации больших лимфоцитов (рис. 4) в капиллярной крови (19,10 (10,75; 25,3) % против 2,0 (0,1; 6,0) %; W = -3,11; р = 0,002). 39 Медицинская экология Экология человека 2018.11 Рис. 4. Лимфоцитограмма капиллярной крови псориатической папулы и венозной крови больных псориазом Примечания: по оси абсцисс - группы лимфоцитов в зависимости от величины их клетки с учетом размеров цитоплазмы: малые лимфоциты - до 8 мкм, средние - 8-12 мкм, большие - больше 12 мкм; по оси ординат - содержание лимфоцитов в процентах (Ме); ** - р < 0,001 (непараметрический критерий Колмогорова - Смирнова). Таким образом, капиллярная кровь псориатической папулы характеризуется более низким уровнем общего количества нейтрофилов на фоне высокого содержания 2-сегментных форм и тенденцией к снижению индекса сегментации нейтрофилов; содержанием моноцитов, в 3 раза превышающим уровень венозной крови за счет увеличения уровня полиморфно-ядерных форм на фоне резкого снижения концентрации промоноцитов; а также увеличением количества больших лимфоцитов. С учетом того, что процессы миграции лейкоцитов связаны с молекулами адгезии [7], нами изучено содержание нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов венозной крови, имеющих молекулы адгезии, у больных псориазом и у практически здоровых лиц. У больных псориазом по сравнению с группой контроля на этапе «роллинга» наблюдалась тенденция к увеличению концентрации нейтрофилов, несущих молекулу L-селектина (рис. 5). Отмечалось понижение экспрессии молекул ICAM-1 и LFA-3 на нейтрофилах, участвующих в этапе «прочной адгезии», при этом значимых различий в содержании молекулы LFA-1 на нейтрофилах не наблюдали. На этапе «трансмиграции» было выявлено статистически значимое &о 80 60 40 20 ■ практически здоровые _Доольные псориазом_ *_ tfiii L-селектин LFA-1 LFA-3 ICAM-1 РЕСАМ-1 Рис. 5. Содержание нейтрофилов, экспрессирующих молекулы адгезии, у практически здоровых лиц и больных псориазом, Me (Q25; Q75) Примечание. * - р < 0,05 (непараметрический критерий Колмогорова - Смирнова). снижение концентрации молекулы PECAM-1 на нейтрофилах (с 98,72 (92,09; 99,53) % до 93,44 (57,49; 97,71) %; Z = 2,25; p = 0,001) у больных псориазом. В отношении экспрессии молекул адгезии на моноцитах (табл. 1) и лимфоцитах (табл. 2) статистически значимых различий в группах сравнения не регистрировали ни на этапе роллинга, ни на этапе прочной адгезии, ни на этапе трансэндотелиальной миграции. Таблица 1 Содержание моноцитов, экспрессирующих молекулы адгезии, у практически здоровых лиц и больных псориазом Me (Q25; Q75) Показатель, % Практически здоровые n=50 Больные псориазом n=69 Уровень значимости различий (р) L-селектин (CD62L) 42,2 (14,82; 60,0) 40,68 (10,55; 63,83) Z=0,58; р=0,88 LFA-1 (CD11a) 99,72 (92,75; 100,0) 98,34 (89,32; 100,0) Z=0,94; р=0,33 ICAM-1 (CD54) 94,11 (77,08; 100,0) 93,81 (65,62; 100,0) Z=0,67; р=0,75 LFA-3 (CD58) 88,88 (61,33; 96,83) 87,59 (45,55; 97,05) Z=0,66; р=0,77 PECAM-1 (CD31) 97,5 (80,0; 98,75) 95,23 (49,31; 99,26) Z=0,91; р=0,37 Таблица 2 Содержание лимфоцитов, экспрессирующих молекулы адгезии, у практически здоровых лиц и больных псориазом Me (Q25; Q75) Показатель, % Практически здоровые n=50 Больные псориазом n=69 Уровень значимости различий (р) L-селектин (CD62L) 9,9 (4,9; 17,5) 13,8 (6,0; 30,6) ,8 ,51 о° o' Il II Z p LFA-1 (CD11a) 65,6 (45,9; 78,7) 65,8 (46,3; 79,5) 6; 8 ,4 ,9 о° о Il II Zp ICAM-1 (CD54) 9,4 (1,1; 21,3) 24,7 (8,4; 41,5) 4; 5 ,3 ,0 Il II Zp LFA-3 (CD58) 63,0 (15,4; 82,7) 64,1 (32,0; 84,6) 6; 1 ,5 ,9 Il II Zp PECAM-1 (CD31) 12,1 (3,2; 20,2) 8,5 (4,4; 16,4) 8; 8 5 ,8 о° о Il II Zp Различия были выявлены посредством корреляционного анализа. На первом этапе миграции («роллинга») у больных псориазом отмечалось присутствие слабых статистически значимых корреляций уровня экспрессии L-селектина с концентрацией 1-, 2- и 3-сегментных форм нейтрофилов (рис. 6), при этом с концентрацией 4-сегментных форм нейтрофилов корреляций не было, что является отличием от контрольной группы, в которой определена статистически значимая связь содержания нейтрофилов с концентрациями L-селектина и 4-сегментных форм нейтрофилов. В отношении популяции моноцитов, несущих молекулу L-селектина, статистически значимых корреляций не наблюдалось. При изучении содержания лимфоцитов, несущих молекулы адгезии, и их морфологических особенностей, корреляционный анализ показал отсутствие значимых связей с молекулой L-селектина и концентрацией малых, средних 40 Экология человека 2018.11 Медицинская экология Рис. 6. Корреляционный анализ между содержанием молекул адгезии L-селектина, ICAM-1, LFA-1, LFA-3, PECAM-1 на ней-трофилах и сегментацией (S) ядер нейтрофильных лейкоцитов. Примечание. Уровни значимости коэффициентов корреляции: *р < 0,05; ** р < 0,001. Корреляционные связи были приняты за сильные - сплошная толстая линия, средние - сплошная линия, слабые - штрихованная линия. Рис. 7. Корреляция между содержанием молекул адгезии L-селектина, ICAM-1, LFA-1, LFA-3, PECAM-^а лимфоцитах и размером их цитоплазмы (Малые, Средние и Большие). Примечание. Уровни значимости коэффициентов корреляции: *р < 0,05; ** р < 0,001. Корреляционные связи были приняты за средние - сплошная линия, слабые - штрихованная линия. 41 Медицинская экология Экология человека 2018.11 и больших лимфоцитов у больных псориазом (рис. 7). Однако в группе практически здоровых людей выявлена средняя статистически значимая корреляция между молекулой L-селектина и средними по размеру лимфоцитами (р = 0,35; р = 0,01). На этапе «прочной адгезии» корреляционный анализ показал наличие статистически значимых связей молекул LFA-1, LFA-3 с 1-, 2-, 3-, 4-сегментными формами нейтрофилов как у больных псориазом, так и у практически здоровых лиц с той разницей, что у больных псориазом наблюдалось ослабление корреляционных связей (см. рис. 6). Были выявлены статистически значимые корреляции между уровнем экспрессии молекулы ICAM-1 и концентрациями 2-, 3-, 4-сегментных форм нейтрофилов у больных псориазом. Относительно моноцитов корреляционный анализ показал наличие связей только промоноцитов с молекулами LFA-1 и ICAM-1 (р = 0,39; р = 0,005 и р = 0,43; р = 0,002), при этом у собственно моноцитов появилась корреляция с молекулой LFA-3 (р = 0,38; р = 0,03). Корреляционный анализ в отношении лимфоцитов, имеющих молекулу ICAM-1, показал статистически значимые связи с содержанием средних (р = 0,29; р = 0,013) и больших лимфоцитов (р = 0,39; р = 0,005) у больных псориазом (см. рис. 7). Количество лимфоцитов с LFA-1 также коррелировало с концентрацией средних лимфоцитов как у больных псориазом (р = 0,50; р = 0,001), так и у здоровых лиц (р = 0,57; р = 0,001). Отмечалась корреляция с большими лимфоцитами (р = 0,41; р = 0,003) только у больных псориазом, и не было ее с малыми лимфоцитами в группах сравнения. Содержание лимфоцитов с LFA-3 коррелировало с концентрациями средних лимфоцитов как у больных псориазом (р = 0,49; р = 0,001), так и у здоровых лиц (р = 0,43; р = 0,01). Отличительной особенностью было то, что у больных псориазом наблюдалась корреляция LFA-3 с большими лимфоцитами (р = 0,59; р = 0,001), которой не было в группе контроля. Корреляционный анализ на этапе «трансмиграции» показал ослабление и даже отсутствие связей молекулы PECAM-1 с 2-сегментными формами нейтрофил у больных псориазом (см. рис. 6), в то время как у практически здоровых лиц регистрировали статистически значимые корреляции с концентрацией нейтрофилов, содержащих 1, 2, 3, 4 и более сегментов в ядре. Установлено наличие статистически значимых связей только полиморфно-ядерных моноцитов с молекулой PECAM-1 (р = 0,45; р = 0,03). Статистически значимые корреляции выявлены между уровнем лимфоцитов с молекулой PECAM-1 и концентрациями средних (р = 0,34; р = 0,01) и больших лимфоцитов (р = 0,47; р = 0,001) в группе больных псориазом (см. рис. 7). Обсуждение результатов Резкое снижение концентрации нейтрофильных лейкоцитов после миграции в псориатическую папулу может отражать высокий уровень дезактивации нейтрофилов в очаге поражения кожи. Кроме того, заслуживает внимания факт увеличения 2-сегментных форм нейтрофилов в крови, выделяемой с поверхности псориатической папулы (см. рис. 2). В этом случае создается впечатление, что именно нейтрофилы с 2 сегментами более активны в плане миграции. О пользе повышенной миграционной активности нейтрофилов в псориатическую папулу может свидетельствовать наличие положительных статистически значимых корреляций между концентрациями 2- и 3-сегментных форм нейтрофилов и содержанием нейтрофилов с молекулами L-селектина, LFA-1, ICAM-1, LFA-3, PECAM-1 (см. рис. 6). Таким образом, при псориазе наблюдается усиленная миграция нейтрофилов в псориатическую папулу, о чем может свидетельствовать снижение числа нейтрофилов в венозной крови с молекулами L-селектина, LFA-3, ICAM-1 и PECAM-1. В капиллярной крови псориатической папулы нарастает концентрация моноцитов за счет полиморфно-ядерных форм и снижается уровень промоноцитов. Известно, что именно промоноциты обладают способностью к пролиферации, а также, пройдя дифференцировку, преобразуются через собственно моноциты в полиморфно-ядерные моноциты [2]. Тот факт, что концентрация промоноцитов в венозной крови нарастает, а в крови, выделяемой с поверхности папул, снижается (рис. 3), а также наличие статистически значимых корреляций с молекулами адгезии LFA-1 и ICAM-1, проявляющих свои функции на этапах прочной адгезии и миграции, дают возможность предполагать, с одной стороны, усиленную миграцию промоноцитов в псориатическую папулу, а с другой - усиленную пролиферацию и диффе-ренцировку их именно в псориатическую папулу. Наибольшие изменения касались содержания в венозной крови больших лимфоцитов, уровень которых существенно был снижен, тогда как в псо-риатической папуле, наоборот, резко повышен. Как известно, большие лимфоциты являются свидетельством лимфопролиферации [7, 10]. Складывается впечатление, что в условиях гиперпролиферации кератиноцитов увеличивается миграция именно больших, но не средних, а тем более малых лимфоцитов. Подтверждением увеличения миграционной активности больших лимфоцитов может служить тот факт, что воспалительный процесс сопровождается лимфопролиферацией, и псориаз в этом смысле не исключение [8]. К тому же наличие статистически значимых корреляций между концентрациями больших лимфоцитов (см. рис. 7) и уровнями лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы к LFA-1, ICAM-1, LFA-3 и PECAM-1, при отсутствии таковых корреляций в группе сравнения может дополнительно указывать на преимущественную миграцию лимфоцитов, вступивших в лимфопролиферацию. Таким образом, механизмы экспрессии молекул адгезии у разных популяций лейкоцитов различаются, что обеспечивает точную настройку миграции сквозь эндотелий. Сложно взаимодействуя между собой, эти реакции ведут к прогрессированию иммунного 42 Экология человека 2018.11 Медицинская экология воспаления, каждая стадия которого имеет свои маркеры, таковыми являются клеточные молекулы адгезии. Изучение механизмов миграции лейкоцитов обусловливает поиск новых клинически значимых мишеней для противовоспалительной терапии, в роли которых могут выступать молекулы адгезии. Авторство Кашутин С. Л. внес существенный вклад в концецию и дизайн исследования, получение и интерпретацию данных, окончательно утвердил присланную в редакцию рукопись; Шерстенникова А. К. внесла существенный вклад в получение, анализ и интерпретацию данных, в концепцию и дизайн исследования, подготовила первый вариант статьи; Николаев В. И., Неклюдова В. С. участвовали в анализе и интерпретации данных; Шагров Л. Л., Шутский Н. А. внесли существенный вклад в сбор первичных данных, Ключарева С. В. и Пирятинская В. А. внесли существенный вклад в интерпретацию данных статьи.

About the authors

S L Kashutin

Northern State Medical University

SPIN-code: 7623-7216

A K Sherstennikova

Northern State Medical University

Email: a.sherstennikova@yandex.ru
SPIN-code: 7473-3278

V I Nikolaev

North-Western I.I. Mechnikov State Medical University

SPIN-code: 3871-4801

V S Neklyudova

Northern State Medical University

SPIN-code: 3364-2284

L L Shagrov

Northern State Medical University

SPIN-code: 3842-2145

N A Shutsky

Northern State Medical University

SPIN-code: 1430-4970

S V Klyuchareva

North-Western I.I. Mechnikov State Medical University

SPIN-code: 9701-1400

V A Pyryatynsky

North-Western I.I. Mechnikov State Medical University

SPIN-code: 9274-7322

References

Supplementary files