Fenotipicheskie i genotipicheskie osobennosti sistemy gemostaza u sportsmenov - urozhentsev Evropeyskogo Severa

Full Text

Физическая нагрузка и занятие спортом вызывают развитие неспецифических адаптационных реакций организма. В трудах H. Selye [19] неспецифический ответ организма на любой раздражающий фактор определяется термином «стресс», он является важнейшим процессом адаптации и тренировки ор ганизма, призванным повышать сопротивляемость, тренировать защитные механизмы тела и психики. Физическая нагрузка может быть рассмотрена в качестве стрессорного агента при достижении адаптационного порога ее воздействия на организм [1, 6]. В большей степени выраженным повреждающим 17 Экологическая физиология Экология человека 2016.10 действием обладает мультифакториальное действие стрессорных агентов, таких как травмы, неблагоприятные условия внешней среды Европейского Севера, режим питания, инфекции, генетические особенности и др. [7, 9, 12, 15]. Система гемостаза активно участвует в ответной реакции организма на внешнее воздействие, реализуя поддержание постоянства внутренней среды. Изменения ее показателей в процессе адаптации к физической нагрузке направлены на сохранение жидкого состояния крови в сосудах и обеспечение целостности сосудов [4]. По данным многочисленных исследований [4, 10, 14], в физиологических условиях при адекватности физической нагрузки адаптационным возможностям системы гемостаза происходит повышение коагулирующих и фибринолитических свойств крови. Определены показатели риска тромботических осложнений у спортсменов [3], установлено влияние физической нагрузки на компоненты системы гемостаза [5, 8, 11, 13], а также рассмотрены некоторые аспекты спортивной генетики [2]. В то же время практически отсутствуют материалы по исследованиям, объединяющим данные изменений показателей системы гемостаза в ответ на физические нагрузки в соответствии с генотипом исследуемого организма. Возникает необходимость оценить влияние высоких физических и психических нагрузок, которым подвергаются спортсмены, в совокупности с изучением генотипических особенностей организма спортсмена; определить изменения показателей системы гемостаза, тесно связанной с работой сердечно-сосудистой системы. Актуальным также является изучение работы системы гемостаза у спортсменов, проживающих в суровых условиях приарктической зоны (Европейский Север), и определение состояния нормы и патологии, характерных для организма, находящегося в этих условиях. Целью представленного исследования явилось выявление генотипических особенностей системы гемостаза у спортсменов Европейского Севера, соотнесение их с некоторыми фенотипическими параметрами системы гемостаза. Методы В рамках исследования определены аллели ряда генов белков системы гемостаза. Оценены некоторые показатели системы фибринолиза. Соотнесены генотипические и фенотипические особенности системы гемостаза у спортсменов. Тип проведенного исследования - поперечное. Принцип формирования групп в исследовании -стратифицированный. Группы были разделены в зависимости от спортивного мастерства исследуемых, от вида физических нагрузок (циклические, силовые, единоборства и т. д.), этапа тренировочной или соревновательной деятельности. Критериями включения в основную группу явились: постоянное занятие спортивной деятельностью, наличие спортивного разряда, посещение центра спортивной медицины для прохождения углубленного медицинского обследования. Виды спорта, представленные обследованными атлетами, - бокс, лыжи, борьба, хоккей, гимнастика, пауэрлифтинг, легкая атлетика, фигурное катание и др. Критерии исключения: отсутствие регулярной тренировочной деятельности, отсутствие согласия на участие в исследовании. В исследовании приняли участие 98 спортсменов, из которых 64 % составили юноши и 36 % - девушки. Спортсмены имели спортивный разряд от первого и выше, проходили углубленное медицинское обследование на базе ГБУЗ АО «Архангельский центр лечебной физкультуры и спортивной медицины» города Архангельска. Все дали письменное информированное согласие на участие в исследовании. Лабораторная часть выполнялась на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории ФГБОУ ВО «Северный государственный медицинский университет» г. Архангельска и ФГБУ «Северный филиал Гематологического научного центра» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Определены полиморфизмы шести генов: ген фактора V (Лейден-мутация), ген метилентетраги-дрофолатредуктазы (полиморфизм 677 C>T), ген протромбина (полиморфизм G20210-A), ген ингибитора активатора плазминогена (полиморфизм 675 5G>4G), ген фибриногена (полиморфизм G/A-455), ген тромбоцитарного рецептора фибриногена GpIIIa (полиморфизм 1565 T>C). Проведена оценка трех параметров системы фибринолиза: количественное определение активности тканевого активатора плаз-миногена, урокиназного активатора плазминогена и комплекса плазмин - антиплазмин. Материалом исследования являлась венозная ЭДТА кровь, цитратная плазма. Для выявления полиморфизмов использовался метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией на агарозном геле, для количественной оценки параметров системы фибри-нолиза - метод иммуноферментного анализа (ИФА). Оборудование - амплификатор «ДНК-технология» (Россия). Реагенты - НПФ «Литех» наборы для выявления полиморфизмов в геноме человека методом ПЦР с электрофоретической схемой детекции результата. Реагенты для оценки факторов системы фибринолиза: TECHNOZYM® PAPComplexELISAKit, TECHNOZYM® t-PAELISAKit, TECHNOZYM® u-PAELISAKit («Technoclone», Австрия). Для выполнения исследований забиралась кровь из локтевой вены натощак в вакуумные одноразовые пробирки. Условия взятия, транспортировки, первичной обработки образцов соответствовали требованиям ГОСТ Р 53079.4-2008 «Обеспечение качества клинических лабораторных исследований», часть 4 - правила ведения преаналитического этапа. Статистическая обработка осуществлялась с помощью пакета прикладных программ Excel и SPSS17 с учетом распределения признаков в группах. Проверка проводилась по показателям асимметрии и эксцесса, а 18 Экология человека 2016.10 Экологическая физиология также более точно по тесту Колмогорова - Смирнова и х2-критерию. В случае нормального распределения для сравнения признаков использовали t-критерий Стьюдента для независимых выборок, если признаки не подчинялись нормальному закону распределения, то использовали непараметрический тест Краске-ла - Уоллиса. Применялись методы описательной статистики качественных данных и их интервальная оценка методами Вальда с коррекцией по Агрести - Коулу, Уилсона, Клоппера - Пирсона. Результаты Исходя из полученных результатов, с 95 % вероятностью было выявлено, что уровень тканевого активатора плазминогена у спортсменов находился в интервале 0,61-0,88 нг/мл. На основании результатов одностороннего t-критерия Стьюдента можно отвергнуть нулевую гипотезу о равенстве среднего значения уровня тканевого активатора плазминогена у спортсменов и средним значением референтного диапазона данного параметра (2-8 нг/мл). Уровень урокиназного активатора плазминоге-на варьировал в пределах от 0,96 до 9,66 (Ме = 1,78) нг/мл. У 50 % спортсменов он находился в границах 1,3 - 3,13 нг/мл. При сравнении с принятым референтным диапазоном (1,2 -2,4 нг/мл) можно говорить о повышении данного показателя у ряда (26 %) спортсменов. Уровень комплекса плазмин - антиплазмин изменялся у исследуемой группы спортсменов от 10,21 до 260,79 нг/мл (Ме = 88,45). У 50 % спортсменов он находился в пределах 41,87-187,03 нг/мл. Граница референтного диапазона (0-520 нг/мл) не была превышена ни у одного из обследованных спортсменов, что в соответствии с характеристикой данного показателя как маркера внутрисосудистого свертывания позволяет судить о его отсутствии у выборки спортсменов. Далее спортсмены были разделены на группы по видам спорта и уровню спортивного мастерства (в зависимости от спортивного разряда). При сравнении групп спортсменов, разделенных по видам спорта, статистически значимых различий в уровне тканевого активатора плазминогена обнаружено не было. Использовался критерий Краскела - Уоллиса, достигнутый уровень значимости различий р = 0,075. Были выявлены высокие ранги у силовых видов спорта и тенниса, низкие у плавания и легкой атлетики. При сравнении групп спортсменов, разделенных по видам спорта, статистически значимых различий в уровне урокиназного активатора плазминогена обнаружено не было. Использовался критерий Краскела - Уоллиса, достигнутый уровень значимости различий р = 0,641. Наиболее высокие ранги наблюдались у силовых видов спорта, наименьшие - у гимнастики и тенниса. При сравнении групп спортсменов, разделенных по видам спорта, статистически значимых различий в уровне комплекса плазмин - антиплазмин обнаружено не было. Использовался критерий Краскела - Уоллиса, достигнутый уровень значимости различий р = 0,042. Наибольшие значения в рангах наблюдались у лыжников, наименьшие у спортсменов, занимающихся силовой борьбой. Разделение спортсменов на группы в зависимости от уровня спортивного мастерства (спортивного разряда) с использованием критерия Краскела - Уоллиса не выявило статистически значимых различий в уровне тканевого активатора плазминогена (р = 0,384), в уровне урокиназного активатора плазминогена (р = 0,104), в уровне комплекса плазмин - антиплазмин (р = 0,920). Уровень ингибитора активатора плазминоге-на 1 (PAI-1 ) варьировал в пределах от 3,1 до 133,4 (Ме = 29,89) нг/мл. Уровень PAI-1 у 50 % спортсменов находился в границах 22,3 - 47,3 нг/мл. Согласно установленным референтным значениям концентрация ингибитора активатора плазминогена в норме составляет 7-43 нг/мл. Концентрация PAI-1 свыше 100 нг/мл, как правило, свидетельствует об опасности возникновения тромбозов и угнетении фибринолитической системы. При сравнении групп спортсменов, разделенных по видам спорта, статистически значимых различий в уровне ингибитора активатора плазминогена обнаружено не было. Использовался критерий Краскела - Уоллиса, достигнутый уровень значимости различий р = 0,125. Наиболее высокие ранги наблюдались у силовиков и у борцов (среднее 57,2 и 55,8), наименьшие - у пловцов и легкоатлетов (среднее 23,0 и 25,1). Разделение спортсменов на группы в зависимости от уровня спортивного мастерства (спортивного разряда) не выявило статистически значимых различий в уровне ингибитора активатора плазминогена. Применен критерий Краскела - Уоллиса, достигнутый уровень значимости различий р = 0,227 (табл. 1). Таблица 1 Результаты оценки показателей фибринолитической системы Показатель Нормальные значения, нг/мл Результат (среднее), нг/мл Примечание Тканевой активатор плазминогена 2, 0 1 0 0,73 95 % ДИ: 0,61-0,88 нг/мл Урокиназный активатор плазминогена 1,2-2,4 1,78 Q1 = 1,3; Q3=3,13 Плазминантиплазминовый комплекс 0 - 520,0 88,45 QQ 1 Il II 1 , 7 ; Ингибитор активатора плазминогена 1 7,0-43,0 34,77 Q1=22,3; Q3=47,3 Генетическое типирование по системе гемостаза у исследуемых спортсменов позволило получить следующие результаты по исследованным шести генам. Известно, что Лейден-мутация - мутация гена (замена в одном из положений аденина на гуанин), кодирующего V фактор свертывания крови, приводит к замещению в его молекуле аргинина глутамином в положении 506. По результатам проведенного ис 19 Экологическая физиология Экология человека 2016.10 следования 3,6 % спортсменов (ДИ: 0,6-8,5 %) имели данный полиморфизм. Далее мы изучили полиморфизм гена метилен-тетрагидрофолатредуктазы - замена основания цитозина (С) на тимин (T) в положении 677. По результатам исследования, у 45,2 % спортсменов (ДИ: 34,1-56,5 %) встречается данный вид полиморфизма. Исследование полиморфизма G20210A гена белка протромбина (замена гуанина на аденин в некодирующей области гена PRT) не выявило его в изучаемой нами выборке. Заслуживают внимание результаты по изучению полиморфизма гена SERPINE1 (белок ингибитор активатора плазминогена-1 ), проявляющегося в изменении количества повторов гуанина (G) в про-моторной (регуляторной) области гена. Существуют два варианта гена с разным количеством повторов гуанина в позиции -675: 5G обозначает наличие последовательности из пяти оснований гуанина; 4G обозначает наличие последовательности из четырех оснований гуанина - это неблагоприятный вариант, приводящий к ослаблению фибринолитической активности крови. По данным, полученным нами в исследовании, 77,4 % спортсменов (ДИ: 67,985,7%) имели данный полиморфизм. Последующий корреляционный анализ с расчетом коэффициента Спирмена (0,29) показал прямую связь между наличием полиморфизма 5G>4G гена PAI и повышением концентрации PAI-1. Полиморфизм -455 G->A гена фибриногена связан с заменой нуклеотида гуанин (G) на аденин (А) в промоторном участке гена, где вариант А сопровождается повышенной экспрессией гена, что приводит к увеличению содержания фибриногена в крови и повышает вероятность образования тромбов Таблица 2 Результаты определения полиморфизмов генов белков системы гемостаза Показатель Европейская частота встречаемости неблагоприятного полиморфизма, % Частота встречаемости полиморфизма у обследованных спортсменов, % Примеча ние Фактор V, Лейден-мутация 3-7 3,6 ДИ: 0,6-8,5% Метилентетрагидрофо-латредуктаза, полиморфизм 677 C>T 35-55 45,2 ДИ: 34,156,5% Протромбин, полиморфизм G20210-A 1-4 0 Ингибитор активатора плазминогена 1, полиморфизм 675 5G>4G 53-61 77,4 ДИ: 67,985,7%) Фибриноген, полиморфизм G/A-455 20 40,5 ДИ: 30,351,1% Тромбоцитарный рецептор фибриногена GpIIIa, полиморфизм 1565 T>C 13 25 ДИ: 16,334,8% [15]. В нашем исследовании 40,5 % спортсменов (ДИ: 30,3-51,1 %) имели рассматриваемый полиморфизм. В качестве тромбоцитарного компонента изучили белок интегрин бета-3 (ITGB3) - мембранный тромбоцитарный гликопротеин Ша. Известно, что на мембране тромбоцитов GPIIIa образует комплекс с GPIIb, представляющий собой тромбоцитарный рецептор фибриногена. Полиморфизм проявляется в замене тимина (T) на цитозин (С) в позиции 1565. Маркер связан с изменением свойств рецептора фибриногена и изменением агрегации тромбоцитов. По результатам лабораторного теста, у спортсменов частота встречаемости этого полиморфизма составила 25 % (ДИ: 16,3-34,8 %). Общие сведения по генотипированию белков системы гемостаза представлены в табл. 2. Обсуждение результатов Оценка отдельных параметров системы фибрино-лиза, включавшая в себя определение тканевого и урокиназного активаторов плазминогена, комплекса плазмин - антиплазмин, ингибитора активатора плазминогена, позволила нам сделать следующие заключения. В выборке исследуемых спортсменов отмечено значительное снижение уровня тканевого активатора плазминогена, являющегося наиболее ценным показателем активности фибринолиза. Полученный результат противоречит литературным данным о нормальной реакции фибринолитической системы на стресс и свидетельствует об ее угнетении [11, 18, 20]. Таким образом, полученные результаты предполагают наличие угнетения фибринолитической системы у спортсменов, проживающих на Европейском Севере, проявляющееся в снижении уровня тканевого активатора плазминогена. Однако нормальный и в отдельных случаях повышенный уровень урокиназ-ного активатора плазминогена может предполагать компенсацию низкого уровня тканевого активатора плазминогена. Данных, указывающих на рассогласование систем гемостаза, не получено, так как уровень комплекса плазмин - антиплазмин у спортсменов находился в пределах референсных значений. Различий в состоянии фибринолитической системы у спортсменов, занимающихся разными видами спорта, не обнаружено. Также не выявлено различий в состоянии системы фибринолиза в зависимости от уровня спортивной подготовки. Со стороны молекулярно-генетического анализа были выявлены следующие особенности. Точечная мутация гена пятого фактора свертывающей системы приводит к тому, что активированная форма фактора V (Va) становится устойчивой к расщепляющему действию активированного протеина С и возникает состояние относительной гиперкоагуляции [16-18]. Частота встречаемости Лейден-мутации у обследованной группы спортсменов соответствует частоте 20 Экология человека 2016.10 Экологическая физиология встречаемости в Европе и США (3-7 %). Частота встречаемости полиморфизма гена метилентетраги-дрофолатредуктазы у европеоидной расы, по данным литературы [2], 35-55 %, и она совпадает с полученной в ходе исследования. Известно, что белок ингибитор активатора плазминогена-1 ингибирует работу тканевого активатора плазминогена и урокиназы, которые, в свою очередь, активируют переход плазминогена в плазмин, расщепляющий фибрин тромбов. Таким образом, SERPINE1 негативно воздействует на фи-бринолиз и препятствует растворению тромбов, что повышает риск сосудистых осложнений, различных тромбоэмболий [12]. В европейской популяции частота встречаемости рассматриваемого полиморфизма 53 - 61 %. При сравнении частот можно сделать заключение о повышенной частоте встречаемости полиморфизма 675 5G>4G гена ингибитора активатора плазминогена среди обследованных нами спортсменов. При сравнении фенотипических и генотипических маркеров системы фибринолиза выявлены: снижение уровня тканевого активатора плазминогена М = 0,73 нг/мл (2-8 нг/мл), тенденция к повышению уровня ингибитора активатора плазминогена. Таким образом, у спортсменов наблюдалась депрессия системы фибринолиза, что в условиях стрессовых воздействий может приводить к гиперкоагуляции и опасности тромбозов. Молекулярно-генетическое исследование системы фибринолиза подтвердило высокую вероятность сбоя в работе фибринолитической системы и наличие высокого риска тромбофилических состояний у спортсменов. Так, 77,4 % спортсменов имели неблагоприятный полиморфизм гена ингибитора активатора плазминогена 5G>4G. Сравнительно с европейской частотой встречаемости полиморфизма -455 G->A гена фибриногена 20 % в выборке исследованных спортсменов эта частота была в два раза выше. По данным литературы [2], в европейской популяции частота встречаемости полиморфизма гена тромбоцитарного рецептора фибриногена GpIIIa (1565 T>C) - 13 %, что при сравнении демонстрирует увеличение частоты встречаемости у группы спортсменов в два раза. Результатом анализа состояния фибринолитической системы у людей с регулярной высокой физической активностью явилось выявление снижения показателей ее активации. По результатам ранее проведенных другими авторами исследований [8, 10, 12], тканевой активатор плазминогена признан маркером, изменяющимся прямо пропорционально интенсивности и длительности физической нагрузки. Вследствие чего наблюдается разбалансированность в работе свертывающей и фибринолитической систем, несущая опасность тромбообразования. Однако данных о наличии внутрисосудистого свертывания у обследованной группы спортсменов не найдено. Таким образом, при соотнесении результатов оценки состояния системы фибринолиза с генетическим анализом соответствующих аллелей нами показана предрасположенность у обследованной группы спортсменов к депрессии фибринолитического звена гемостаза. Кроме того, наблюдалась тенденция к усилению коагулирующих свойств крови за счет наличия соответствующих аллелей гена фибриногена и тромбоцитарного рецептора к фибриногену.

About the authors

N A Bushueva

Northern State Medical University; Center of Therapeutic Physical Culture and Sport Medicine

Arkhangelsk, Russia

N A Vorobyeva

Northern State Medical University; Northern Department of Hematologic Scientific Center

Email: nadejdav0@gmail.com
Arkhangelsk, Russia

References

Supplementary files