Cytochrome p-450 and VKORC1 genetic polymorphisms in nenets - an indigenous ethnic group in the Arctic

Full Text

Бурно развивающееся техногенное освоение Арктического региона в мире и в России закономерно влияет на экологическое, медицинское здоровье коренного этноса Ненецкого автономного округа Архангельской области. Так, за последние годы от мечается негативная тенденция к существенному преобразованию традиционного уклада жизни, привычек, алиментарного статуса ненецкого народа. По отдельным публикациям, жизнестойкость коренных этносов к климатической, географической, 11 Экологическая физиология Экология человека 2020.09 экологической среде напрямую зависит от структуры исторически сложившегося генофонда [5-7, 9, 13]. При этом генотипические предикторы диктуют биохимическую специфичность гомеостаза организма в целом, определяя жизнестойкость человека в целом. В России проживает большое количество различных коренных народов. По мнению Корчагиной Р. П., исследование коренных этносов важно и в связи с тем, что в изолированных популяциях увеличивается степень метисации с пришлым населением. Данная тенденция, по ее и других авторов мнению, может способствовать привнесению новых генных вариантов в генофонды этносов и изменению их приспособленности к проживанию в суровых условиях среды и устойчивости к другим неблагоприятным факторам [1-4, 6, 8]. В экологической доктрине Российской Федерации приоритетным направлением является изучение связи между заболеванием человека и изменением качества окружающей среды. С позиции профилактической медицины, пропагандирующей комплекс медицинских, государственных мероприятий, направленных на предупреждение социально значимых заболеваний, важно отметить, что в реальную клиническую практику активно поступают новые лекарственные средства, с которыми ранее представители коренных народов Арктики не сталкивались. Это, в свою очередь, определяет актуальность изучения носи-тельства мутантных аллелей в разных популяциях с целью оптимизации и персонификации терапии путем фармакогенетического тестирования. В связи с этим новым перспективным направлением является персонификация фармакотерапии с учетом генетических особенностей системы биотрансформации, а именно изучения аллельных вариантов генов семейства цитохрома Р-450 и VKORC1 с учетом этнических особенностей популяции [12, 16, 17, 20]. В настоящее время хорошо известно, что с помощью ферментов семейства цитохрома Р-450 происходит окислительная биотрансформация многих лекарств и различных эндогенных биоорганических веществ [9, 10]. С участием системы цитохромов осуществляется метаболизм самых разнообразных классов лекарственных средств. В первую очередь необходимо отметить такие препараты, как ингибиторы протонной помпы, антигистаминные средства, ингибиторы ретровирусной протеазы, бензодиазепины, блокаторы кальциевых каналов, пероральные антикоагулянты, ряд противовирусных и антибактериальных средств [11]. Часто механизмом клинически значимых межлекарственных взаимодействий является ингибирование изоферментов цитохрома P-450 (рис. 1). Важно отметить, что в настоящее время выявлен ряд межпопуляционных различий в частотах встречаемости основных полиморфных вариантов гена VKORC1. При этом наиболее изученными являются локусы на участке, расположенном в промоторной зоне VKORC1 1639 G/A, а также в первом интроне в положении 1173 С/Т С клинической точки зрения следует отметить, что при детекции гетерозиготного аллельного варианта VKORC1 1639 G/A, а тем более гомозиготного варианта A/A, происходит значимая депрессия экспрессии гена, проявляющейся снижением содержания VKORC1 в гепатоцитах и активности данного фермента в цикле витамина К. Целью исследования явился анализ распространенности генотипов и аллельных вариантов в генах CYP2C9, CYP2C19, VKORC1 в популяции коренного этноса Арктики в условиях постоянного островного проживания. Методы Проведено поперечное популяционное выборочное исследование коренного этноса, проживающего в Арктической зоне России (остров Вайгач - 70°01' с. ш. 59°33' в. д.) во время научной экспедиции (июль 2019), выполняемой в рамках финансирования гранта РФФИ КОМФИ (18-00-00478). Работа выполнена на базе Северного филиала ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедры клинической фармакологии и фармакотерапии ФГБОУ ВО «Северный государственный медицинский университет» (СГМУ) Министерства здравоохранения Российской Федерации г. Архангельск. Ингибитор Быстрое действие Прямое Снижение ингибирование метаболизма субстрата изофермента изофермента цитохрома Р-450 цитохрома Р-450 -N \\- Повышение концентрации Повышение эффектов и субстрата в плазме повышение токсического действия субстрата Межлекарственное взаимодействие ингибитора и субстрата изофермента цитохрома Р-450 (Ritter J.) [18] 12 Экология человека 2020.09 Экологическая физиология Дизайн исследования включал в себя получение информированного согласия, анкетирование участников исследования, молекулярно-генетический анализ с использованием аллель-специфичных праймеров с детекцией методом электрофореза в 3 % агарозном геле для определения полиморфизма в генах CYP2C9*2 (rs1799853), CYP2C9*3 (rs1057910), CYP2C19*2 (rs4244285), а также анализ методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с анализом кривых плавления для детекции вариантов в генах VKORC1 G3730A (rs7294) и C1173T (rs9934438). Исследованием охвачены 32 человека (выборка коренного населения - ненцы), на момент исследования постоянно проживающие на острове Вайгач. Сбор анамнестических и биологических данных выполнен в соответствии с правилами международного стандарта GCP. Протокол исследования рассмотрен и одобрен локальным этическим комитетом СГМУ (протокол № 03/5 от 27.05.2015 г.). Критерии включения в исследование: этническая принадлежность к ненцам (четвертое поколение включительно); постоянное островное проживание в Арктике (остров Вайгач); подписание добровольного информированного согласия на участие в исследовании. Критерии исключения: отказ от участия в исследовании; принадлежность к другим этносам и метисы. Объектом исследования явилось коренное население Ненецкого автономного округа (НАО) - ненцы, проживающее на острове Вайгач, предметом исследования - геномная ДНК. Этническую принадлежность определяли путём самоидентификации субъекта и их родителей [17]. Для забора цельной венозной крови использовались вакуумные пробирки Vacuette объемом 5,0 мл с добавлением в качестве антикоагулянта динатриевой соли этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) в конечной концентрации 2,0 мг/ мл, до транспортировки биообразцы замораживались при - 40 °С. Для определения генотипов и аллелей полиморфных локусов в генах CYP2C9*2, CYP2C9*3, CYP2C19*2 использовался метод ПЦР с аллель-специфичными праймерами методом электрофореза. Для определения генотипов и аллелей в генах VKORC1 C1173T и G3730A применялся метод ПЦР в режиме реального времени (Real-time PCR) на амплификаторе Real-time CFX96. Статистическая обработка базы данных проведена с использованием STATA 2014. Популяционные частоты аллельных вариантов вычисляли на основе наблюдаемых частот генотипов. Для описания качественных данных использовались абсолютные числа, проценты и 95 % доверительный интервал. Оценка отклонения распределений генотипов от распределения Харди - Вайнберга проводилась с использованием модифицированного критерия Х-квадрат Пирсона. Расчеты выполнены с помощью онлайн-программы «Hardy-Weinberg equilibrium calculator» (OEGE). Оценку достоверности различий по частотам аллелей по сравнению с результатами других исследований проводили по критерию хи-квадрат Пирсона. За критический уровень значимости брали 0,05. Результаты У здоровых добровольцев из ненецкой этнической группы, постоянно проживающих на острове Вайгач, методом молекулярно-генетического анализа были проанализированы аллельные варианты генов CYP2C9*2 (Arg144Cys), CYP2C9*3 (Ile359Leu), CYP2C19*2 (681G>A), VKORC1 G3730A, VKORC1 С1173Т. Распределение аллельного полиморфизма в изучаемых генах представлено в табл. 1. Таблица 1 Частота генотипов и аллелей изучаемых генов в популяции ненцев острова Вайгач Генотипы и аллели Частота, % CYP2C9*2 (rs1799853) CC 90,63 (29) TT 0 (0) CT 9,38 (3) C 93,75 (60) T 4,69 (3) CYP2C9*3 (rs1057910) АА 100 (32) АС 0 СС 0 А 100 (64) С 0 CYP2C19*2 (rs4244285) GG 40,63 (13) GA 46,88 (15) AA 12,5 (4) G 64,06 (41) A 35,94 (23) VKORC1 G3730A (rs7294) GG 56,25 (18) GA 43,74 (14) AA 0 (0) G 78,13 (50) A 21,88 (14) VKORC1 С1173Т (rs993443) СС 50 (16) СТ 21,88 (7) ТТ 28,13 (9) С 60,94 (39) Т 39,06 (25) Примечание. В скобках приведено количество лиц с определенным генотипом и количество аллелей. 13 Экологическая физиология Экология человека 2020.09 Таблица 2 Распределение частот генотипов и аллелей изучаемых генов в популяции ненцев острова Вайгач Генотипы и аллели CYP2C9*2 rs1799853 CYP2C9*3 rs1057910 CYP2C19*2 rs4244285 VKORC1 rs7294 VKORC1 rs9934438 Всего субъектов (^/всего аллелей (n) 32/64 32/64 32/64 32/64 32/64 *1/*1, % (N) 90,63 (29) 100 (32) 40,63 (13) 56,25 (18) 50 (16) *1/*X, % (N) 9,38 (3) 0 46,88 (15) 43,75 (14) 21,88 (7) *X/*X, % (N) 0 0 12,5 (4) 0 28,13 (9) *1, % (n) 93,75 (60) 100 (64) 64,06 (41) 78,13 (50) 60,94 (39) *X, % (n) 4,69 (3) 0 35,94 (23) 21,88 (14) 39,06 (25) X2 Харди - Вайнберга 0,0774 - 0,0104 2,5088 9,3489 Примечание. *1 - частая аллель, ассоциированная с неизмененной работой цитохрома; *Х - мутантная аллель, ассоциированная с измененной работой цитохрома; *1/*1 - «дикий генотип»; *1/*Х - гетерозиготный генотип; *Х/*Х - гомозиготный генотип по мутантной аллели. По результатам детекции гена CYP2C9*2 было выявлено, что наиболее распространенным вариантом в исследуемой выборке являлся генотип СС (90,63 %). Аллельного генотипа ТТ, а значит, и мутантной аллели Т в исследуемой популяции выявлено не было (0 %). Важно отметить, что молекулярно-генетический анализ гена CYP2C9*3 идентифицировал только один генотип АА (100 %), при этом вариантов с патологической (мутантной аллелью) в данном изоляте выявлено не было. Детекция полиморфного локуса 681G > A определила три аллельных варианта - GG, GA, AA, где наиболее распространенным являлся гетерозиготный аллельный полиморфизм GA (46,88 %, n = 15). По результатам молекулярно-генетического анализа гена VKORC1 G3730A идентифицированы два генотипа - генотип GG и генотип GA. Анализ распределения частот генотипов и аллелей полиморфных локусов в генах CYP2C9*2, CYP2C9*3, CYP2C19*2, VKORC1 G3730A и VKORC1 C1173T выполнен с помощью онлайн программы OEGE (табл. 2). Следующим этапом работы стало проведение сравнительного анализа распространенности мутантного Таблица 3 Сравнительный анализ частот аллелей CYP2C9*2 в различных этнических группах Популяция Выборка (Ы)/общее число аллелей (n) Частота CYP2C9*2 (n (%)) Островные ненцы* Островные ненцы* 32/64 3 (4,69) - Тундровые ненцы [5, 6] 313/626 16 (2,56) X2 = 0,9 p = 0,3 Нанайцы [12] 70/140 0 (0) X2 = 6,7 p = 0,010 Селькупы [5] 330/660 32 (4,85) X2 = 0,03 p = 0,96 Лесные ненцы [5] 303/606 41 (6,77) X2 = 0,4 p = 0,5 Чукчи [5, 6] 114/228 15 (6,60) X2 = 0,3 p = 0,6 Узбеки [4] 30/60 1 (1,65) X2 = 0,9 p = 0,3 Русские Северной Сибири [6] 345/690 95 (13,77) X2 = 4,3 p = 0,04 Примечание. * - данные настоящего исследования. аллеля CYP2C9 144Cys, CYP2C9 359Ile, CYP2C19 681A, VKORC1 1173T в исследуемой и других этнических группах. Результаты анализа представлены в табл. 3, 4, 5, 6. Таблица 4 Сравнительный анализ частот аллелей CYP2C9*3 в различных этнических группах Популяция Выборка (Ы)/общее число аллелей (n) Частота CYP2C9*3 (n (%)) Островные ненцы* Островные ненцы* 32/64 0 (0) - Тундровые ненцы [5] 313/626 24 (3,99) X2 = 2,5 p = 0,1 Нанайцы [12] 70/140 8 (5,7) X2 = 3,8 p = 0,05 Лесные ненцы [5] 303/606 6 (0,99) X2 = 0,6 p = 0,4 Селькупы [5] 330/660 54 (8,18) X2 = 5,7 p = 0,018 Чукчи [5] 114/228 7 (3,00) X2 = 2,0 p = 0,2 Аварцы [8] 90/180 28 (15,5) X2 = 11,2 p < 0.001 Русские [8, 2] 290/580 39 (6,7) X2 = 4,6 p = 0,033 Узбеки [4] 30/60 2 (3,3) X2 = 2,2 p = 0,1 Примечание. * - данные настоящего исследования. Таблица 5 Сравнительный анализ частот аллелей CYP2C19*2 в различных этнических группах Популяция Выборка (Ы)/общее число аллелей (n) Частота CYP2C19*2 (n (%)) Островные ненцы* Островные ненцы* 32/64 23 (35,94) - Нанайцы [12] 70/140 34 (24,3) X2 = 2,9 p = 0,086 Русские [8] 89/178 20 (11,3) X2 = 19,7 р < 0,001 Аварцы [8] 90/180 22 (12,2) X2 = 17,7 р < 0,001 Японцы [19, 14] 186/372 108(29) X2 = 1,2 p = 0,3 Примечание. * - данные настоящего исследования. 14 Экология человека 2020.09 Экологическая физиология Таблица 6 Сравнительный анализ частот аллелей VKORC1 H73T в различных этнических группах Популяция Выборка (^/общее число аллелей (n) Частота VKORC1 1173T (n (%)) Островные ненцы* Островные ненцы* 32/64 25 (39,06) - Селькупы [5] 330/660 558 (84,6) X2 = 76,9 p < 0,001 Тундровые ненцы [5] 310/620 463 (74,7) X2 = 35,9 p < 0,001 Русские Северной Сибири [6] 346/692 256 (36,9) X2 = 0,123 p = 0,73 Китайцы [17] 390/780 717 (92,0) X2 = 155,6 p < 0,001 Примечание. * - данные настоящего исследования. Обсуждение результатов Важно отметить, что большинство исследований по фармакогенетике ранее было выполнено и результаты внедрены в реальную клиническую практику фармакотерапии на объектах европеоидной расы. По нашему мнению, это значимо затрудняет экстраполяцию полученных ранее научных результатов на представителей других недостаточно изученных малых этносов. Именно поэтому, по нашему мнению и мнению отдельных ученых, научный анализ частоты носительства полиморфных генов особенно актуален для такой многонациональной страны, как Российская Федерация, и в частности для северных районов, где проживают малочисленные коренные народы. Результаты нашей работы продемонстрировали вариабельность распределения частот генотипов и аллелей полиморфизма генов CYP2C9*2, CYP2C9*3, CYP2C19*2, VKORC1G3730A, VKORC1C1173T в сплошной выборке ненцев, постоянно проживающих в условиях Арктики на острове Вайгач. Аналогичные нашим результатам детекции гена CYP2C9*2, где преобладал генотип СС, ранее были получены в нанайской этнической группе [12]. Сравнительный анализ показал, что распространенность мутантного аллеля гена CYP2C9*2 была статистически значимо выше в выборке русских Северной Сибири (13,77 %), чем в выборке изучаемых островных ненцев (4,69 %, p = 0,04). Частота мутантного варианта в популяции островных ненцев также являлась наименьшей в сравнении с популяциями селькупов (4,85 %), лесных ненцев (6,77 %), чукчей (6,60 %), но данные различия не являлись значимыми (p > 0,05), за исключением сравнения с популяциями тундровых ненцев, нанайцев, где мутантный аллель не был обнаружен. Результаты исследования демонстрируют, что в анализируемой выборке островных ненцев мутантного аллеля в гене CYP2C9*3 выделено не было. Что касается частот в других популяциях, то они варьировали в широких пределах, так, наименьшую частоту мутантного аллеля имела популяция лесных ненцев (0,99 %) [6]. Анализ парного сравнения популяции островных ненцев с другими этносами не показал значимых различий (p > 0,05), за исключением сравнения с популяциями селькупов, аварцев и русских (p = 0,018; p < 0.001; p = 0,033 соответственно) [2, 6, 8]. Сравнительный анализ выявил, что по частоте мутантного аллеля в гене CYP2C19*2 достоверно лидирует исследуемая популяция островных ненцев (35,94 %), кроме частоты в японской популяции (p = 0,3). Наше исследование показало, что частота мутантного аллеля гена VKORC1 1173T была выше в выборке китайцев (92,0 %) [17], чем в изучаемой популяции островных ненцев (39,06 %), (p < 0,001). Кроме того, по сравнению с данными других популяций выборка островных ненцев отличалась наименьшей частотой проявления мутантного аллеля, за исключением популяции русских Северной Сибири, где частота составляла 36,9 %, но при этом данные различия не являлись статистически значимыми (p = 0,730) [5, 6]. В настоящее время благодаря успехам и разработкам в области клинической фармакологии активно внедряются протоколы фармакотерапии с использованием фармакогенетического анализа. Так, предлагаются клинические рекомендации отдельных профессиональных сообществ Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium (CPIC) и Dutch Pharmacogenetics Working Group (DPWG) по фармакогенетическому тестированию полиморфизма в гене CYP2C9 с целью персонализации и оптимизации продленной терапии антикоагулянтами, гипогликемическими [11, 15]. Результаты, полученные в нашем популяционном исследовании, согласуются с данными других авторов о том, что исследование полиморфизма генов, отвечающих на биотрансформацию и метаболизм лекарственных препаратов, может быть актуальным для персонифицированной фармакотерапии коренных этносов [16]. Таким образом, результаты нашей работы показали вариабельность распределения частот генотипов и аллелей полиморфизма генов CYP2C9*2, CYP2C9*3, CYP2C19*2, VKORC1G3730A, VKORC1C1173T в сплошной выборке ненцев, постоянно проживающих на острове Вайгач, при этом наибольшую частоту имел аллель «дикого» типа, наличие гомозиготного генотипа по нормальному аллелю гена CYP2C9*3 отмечено в 100 % случаев, что является особенностью ненцев острова Вайгач. Статистический анализ сравнения частот встречаемости мутантного аллеля с частотами в других этнических популяциях выявил более низкую распространённость мутантного аллеля в исследуемой популяции островных ненцев за исключением аллельного полиморфизма гена CYP2C19*3. Полученные нами данные дополняют знания об эпидемиологии полиморфных вариантов генов системы детоксикации и гена VKORC1, имеющих большое значение в метаболизме ксенобиотиков в отдельных 15 Экологическая физиология Экология человека 2020.09 этнических популяциях Арктики. По нашему мнению, подобные пилотные популяционные исследования вносят дополнительный вклад в представление о роли генетического полиморфизма генов CYP и VKORC1 в адаптации коренного населения Арктики к суровым условиям окружающей среды, что необходимо учитывать при проведении фармакотерапии. Так, полученные нами данные могут иметь существенное значение для персонифицированной медицины при прогнозировании риска развития осложнений фармакотерапии препаратами, которые метаболизируются ферментами цитохрома Р-450 hVKORC1. С научной и практической точки зрения поиск ассоциаций полиморфных вариантов генов позволяет не только уточнить патогенез самого заболевания, но и научно разработать оптимальную стратегию терапии, профилактики с учетом биохимической индивидуальности пациента, а также обосновать превентивные мероприятия, что отвечает современной мировой концепции персонализированной медицины.

About the authors

N. A. Vorobyeva

Northern State Medical University; National Research Center of Hematology Northern branch

Email: nadejdav0@gmail.com
Arkhangelsk; Arkhangelsk, Russia

A. I. Vorobyeva

Northern State Medical University

Arkhangelsk

References

Supplementary files