UNEXPECTED REPRODUCTIVE EFFECT OF PROLONGED ORAL ADMINISTRATION OF SILVER NANOPARTICLES IN LABORATORY MICE

Full Text

В современном мире наночастицы поступают в уже достаточно большой объем доказательств токорганизм человека пока еще в малых дозах и чаще сичности наночастиц и наноматериалов, особенно всего естественными путями - с пищей и водой углеродных нанотрубок и тяжелых металлов, для перорально, с воздухом ингаляционно, через кожу и биологических тканей и органов даже в относительт. д. [1, 5]. Однако в мировой литературе накоплен но небольших концентрациях [4, 12, 13, 24-26]. 23 Эндоэкология Экология человека 2020.10 Проблема безопасности наноматериалов находится в центре внимания многих международных организаций примерно с начала 2000-х годов. В США исследования в этой области проводятся под эгидой FDA, в Евросоюзе - под эгидой OECD, IEC, EFSA, ECETOC. Такие международные организации, как ВОЗ, Продовольственная и сельскохозяйственная организация ООН (ФАО), Международный институт наук о жизни (ILSI), также не остаются в стороне и инициируют различные научные исследования. В России исследования по проблеме нанобезопасности стали проводиться по инициативе Роспотреб-надзора с конца 2006 года (Постановление Главного санитарного врача Российской Федерации (РФ) от 31/10/2007 № 79 «Об утверждении Концепции токсикологических исследований, методологии оценки риска, методов идентификации и количественного определения наноматериалов»). В 2010 году были утверждены гигиенические нормативы ГН 1.2.2633-10 «Гигиенические нормативы содержания приоритетных наноматериалов в объектах окружающей среды», которые впервые установили значения допустимых концентраций наноматериалов в воздухе рабочей зоны, в воде водоемов, а также в питьевой воде. Был разработан подход к оценке степени потенциальной опасности наноматериалов на основе метода математического моделирования, реализованный в методических рекомендациях (МР) по выявлению наноматериалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека (МР 1.2.2522 09. - 2009). При этом исходным положением МР является то, что наноматериалы во всех случаях должны быть отнесены к новым видам продукции, поэтому характеристика потенциального риска от них для здоровья человека и состояния среды обитания является обязательной в соответствии с законами РФ № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» и № 29-ФЗ «О качестве и безопасности пищевых продуктов». Степень токсичности наночастиц зависит от множества факторов: природы наночастиц, их концентрации, формы и размеров, площади поверхности, среды, в которой они находятся, и т. д. [1, 25, 26]. Сильно влияет также и характер контакта человека с наночастицами - разовый или хронический [1, 4]. Последний наиболее опасен и характерен, например, для работников производств, имеющих дело с наночастицами, производящими их, и т. п. Тем более установлено, что наночастицы способны проникать сквозь биологические барьеры [1, 17, 22, 26], в частности через плацентарный барьер [7], накапливаться в тканях и органах [17, 25, 29], влиять на беременность [14, 27]. Из-за малого размера и низкой растворимости наночастицы (например, металлов), как правило, не распознаются защитными системами организма, не подвергаются химическому разложению и медленно или вовсе не выводятся из организма [9-11]. Процесс их накопления в организме может быть на первых порах абсолютно незаметным для рабочего. Поэтому профессиональное сообщество врачей-профпатологов одними из первых забили тревогу и инициировали соответствующие исследования [1, 4, 10, 24]. Было даже высказано предположение, что в производственных условиях при хроническом контакте рабочих с наночастицами металлов и при их проникновении через гематоэнцефалический барьер в мозг у рабочих наноиндустрии могут возникать неизвестные ранее нозологические формы неврологических и психических профзаболеваний [1]. В том числе, безусловно, можно ожидать негативное влияние наночастиц металлов и на репродуктивное здоровье женщин, работающих на производстве наночастиц, потребляющих наночастицы с биологически активными пищевыми добавками, использующих косметику с наночастицами и т. д., а также на здоровье их детей, потенциально подвергающихся экспозиции наночастиц во время внутриутробного развития и/или в период грудного вскармливания [7, 14, 17, 22, 27]. На основании изложенного целью нашего основного трехлетнего исследования является изучение в эксперименте влияния хронического перорального приема коллоидного раствора наночастиц серебра (AgNP) на когнитивные способности потомства самок мышей, принимавших AgNP с начала периода спаривания до окончания периода лактации. Способность наночастиц металлов преодолевать плацентарный и гематоэнцефалический барьеры, их слабая растворимость и медленное выведение из организма, особенно после прохождения барьера, позволяет предположить возможное негативное влияние наночастиц не только на мозг матери, но и на когнитивные способности потомства. В своем исследовании мы изучаем когнитивные способности в экспериментах с пространственным научением и пространственной памятью [20]. Однако данное краткое сообщение посвящено наблюдению (case report) в рамках этого исследования неожиданного эффекта увеличения рождаемости у мышей, принимавших AgNP. В двух повторных одинаковых экспериментах наблюдалась практически удвоенная рождаемость в экспериментальных группах по сравнению с группами контроля, которые пили чистую воду вместо раствора AgNP. Методы В питомнике «Столбовая» (РФ, Московская область) были закуплены выведенные там мыши -белые, беспородные, аутбредной популяции (ICR), возраст 1,5-2 месяца. Генотип - генетически контролируемая закрытая колония нелинейных мышей. Данные мыши гетерозиготны по неопределённому числу генов, стандартно используются для оценки безопасности лекарственных препаратов, биологически активных добавок, косметических средств и т. д. Было закуплено для экспериментов 72 мыши: 50 самок и 10 самцов для первого эксперимента, 10 самок и 2 самца для второго эксперимента. Средний вес особи 24 Экология человека 2020.10 Эндоэкология составлял (25,2 + 1,3) г в первом эксперименте и (28,3 ± 1,0) г во втором. Методика экспериментов и условия содержания животных в виварии ГБУЗ МО «Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М. Ф. Владимирского» (МОНИКИ) были одобрены Этическим комитетом организации в 2019 году и соответствовали директиве Европейского парламента и Совета Европейского Союза 2010/63/ ЕС от 22 сентября 2010 года о защите животных, использующихся для научных целей. Всех животных содержали в виварии МОНИКИ в стальных клетках размером 31,5 х 23 х 15,7 см, первоначально группами по 2-5 особей в клетке (самцов и самок отдельно), при естественном освещении и средней температуре воздуха 22-24 оС, со свободным доступом к обычному комбикорму и питью (чистой воде). Клетки чистили раз в день. В качестве источника AgNP использовали коммерчески доступный и серийно выпускаемый концентрированный (13 мг/мл) коллоидный раствор AgNP «Арговит-С». Производитель - ООО НПЦ «Вектор-Вита» (г. Новосибирск, РФ). Чтобы избежать агрегации наночастиц в растворе, производитель использует наночастицы размером менее 20 нм, поверхностно-стабилизированные оболочкой из по-ливинилпирролидона (ПВП) с концентрацией ПВП в растворе 187 мг/мл. Согласно [16] ПВП не обладает ни генотоксичностью, ни острой токсичностью, ни канцерогенностью, ни репродуктивной токсичностью, в том числе при повторных дозах. Способ получения наночастиц и их основные характеристики указаны в патенте [3]. Производитель гарантирует, что раствор сохраняет свои свойства в течение двух лет. Для исследований закупался свежий раствор, срок годности в процессе всех исследований не истекал. Диаметр AgNP в закупленном препарате (среднее ± СКО) в (8,7 + 1,4) нм был подтвержден измерениями в НИЦ «Курчатовский институт». Для определения размеров AgNP использовался метод динамического рассеяния света на спектрометре Malvern [2]. Такой диаметр позволяет изучать проникновение наночастиц через гематоэнцефалический, плацентарный и любые другие биологические барьеры [1, 7, 26]. Экспериментальный раствор AgNP, покрытых оболочкой из ПВП, концентрацией 25 мкг/мл готовился авторами статьи путем разведения исходного концентрированного коллоидного раствора AgNP «Арговит-С» питьевой водой в соотношении 520:1. Раствор готовился в ходе эксперимента каждые 1-2 дня и разливался в питьевые бутылочки по мере их опорожнения мышами. Бутылочки имеют шаровую поилку, поэтому испарение раствора и изменение его концентрации за время опорожнения бутылочки мышами фактически исключено. Данная концентрация была выбрана в наших экспериментах как наибольшая из возможных для получения значимого токсического эффекта, но которая еще не приводит к повышенной смертности в группе животных [19]. Хотя ранее мы сообщали об отсутствии токсического воздействия AgNP вплоть до концентраций в 100 мкг/мл [8] (при анализе гистологических препаратов сердца, печени, почек и селезенки мышей патологических изменений отмечено не было), в ряде последующих неудачных экспериментов мы наблюдали повышенную смертность животных в группе с концентрацией AgNP в 50 мкг/мл. В одном из таких экспериментов у нас погибло около 40 % животных в экспериментальной группе, поэтому упор в описываемых исследованиях был сделан на концентрации в 25 мкг/мл. Для проведения исследования животных далее распределяли по двум равным группам, по 25 самок и 5 самцов в каждой в первом эксперименте и по 5 самок и 1 самцу в каждой во втором эксперименте. Через неделю после распределения животных по группам самцов посадили в клетки к самкам для размножения, по 1 самцу на 5 самок в одной клетке на три дня. С этого момента на протяжении 2 месяцев и одной недели, т. е. до окончания лактации (до момента, когда потенциальная передача наночастиц от матерей к потомству в принципе прекращается), экспериментальные самки пили раствор AgNP, к которому у них был свободный доступ, а контрольные самки - чистую воду тоже со свободным доступом (рис. 1). Самцы в период спаривания в экспериментальной группе так же свободно контактировали с раствором AgNP, как и самки. После спаривания и фиксации факта беременности самок самцов от них отсаживали. Таким образом, в экспериментальной группе рожденные детеныши, как минимум, могли контактировать с AgNP, прошедшими через плацентарный барьер во время пренатального развития, и с AgNP, получаемыми от матерей с молоком. Возможно и влияние самцов, подвергшихся экспозиции AgNP в период спаривания, на последующее зачатие и развитие плода. Потомство подсчитывали дважды: в недельном возрасте (рождаемость) и по окончании лактации (выживаемость). Потомство оценивалось и сравнивалось по головам, в абсолютном выражении, какие-либо статистические методы оценки здесь не применялись в силу очевидности результата. Потребление раствора мышами в эксперименте контролировалось ежедневно по уменьшению количества раствора в поилке. В эксперименте предполагалось, что в среднем каждая особь в клетке выпивает примерно равное количество жидкости в стуки в сравнении с сородичами, поэтому оценка потребления раствора AgNP в клетке на одну особь проводилась усредненно: общее выпитое количество жидкости делилось на число мышей в клетке. Предварительно было оценено среднее суточное потребление жидкости одной мышью при потреблении стандартного комбикорма в условиях вивария МОНИКИ: одна особь за сутки выпивает в среднем (5,43 ± 0,40) мл жидкости [6]. Таким образом, одна мышь в клетке в 25 Эндоэкология Экология человека 2020.10 Рис. 1. Свободный доступ животных к комбикорму и питью (раствору AgNP или воде) условиях эксперимента с AgNP в среднем должна была потреблять в сутки порядка 135 мкг AgNP (5,4 мл х 25 мкг/мл = 135 мкг). В исследование по изучению когнитивных дисфункций и уровня накопления AgNP в тканях и органах далее были включены только самки и их потомство, тогда как самцов использовали только для размножения. Оценку когнитивных способностей матерей и потомства в сравнении экспериментальной и контрольной групп проводили в водном лабиринте Мориса [19, 20]. Эти результаты детально будут описаны в других работах и не являются предметом данной статьи. Для оценки накопления AgNP в тканях и органах экспериментальных животных в первом эксперименте по окончании лактации часть самок и потомства (по 5 особей соответственно) были усыплены методом внутрибрюшинного введения водного раствора уре-тана (из расчета 1,2 г сухого уретана на кг массы тела), и от каждой мыши были взяты образцы органов (головной мозг, печень, почки, легкие) и тканей (кровь). Образцы были упакованы в алюминиевую фольгу, высушены в течении 24 часов при температуре 75 °С и переданы в Лабораторию нейтронной физики им. И. М. Франка Объединенного института ядерных исследований (ОИЯИ, г. Дубна) для количественного определения содержания в образцах серебра методом нейтронно-активационного анализа [2, 7, 28, 29]. Метод реализован на установке РЕГАТА импульсного быстрого реактора ИБР-2 с кадмиевым низкотемпературным каналом. Температура в каналах облучения ИБР-2 не превышает 60-70 °С, обеспечивая анализ биологических образцов без их повреждения. Для определения содержания изотопов серебра и железа образцы облучаются в кадмиевом канале потоком резонансных нейтронов с 3,31 х 1012 нейтронов на cм2 в секунду. Затем активность образцов, т. е. количественное содержание изотопов металлов, измеряется дважды после времени охлаждения в 4 и 20 дней. Время одного измерения варьировало от 1,5 часа до 5 часов. Этот метод позволяет отдельно определять накопление серебра в крови и в клеточных мягких тканях, включая нейрональные ткани мозга, путем отдельного определения содержания активированного серебра в крови, в мягких клеточных тканях с кровью, и отдельного определения содержания крови в мягкой клеточной ткани по уровню содержания активированного железа, входящего в гемоглобин крови. То есть с помощью этого метода можно, например, для мозга определить содержание серебра именно от AgNP, прошедших гематоэнцефалический барьер. В плане обработки результатов в программе OpenEpi version 3.01 (www.OpenEpi.com) был проведён анализ частот рождаемости на одну самку с расчётом двусторонних 95 % доверительных интервалов (95 % ДИ) и расчётом соотношений рождаемости в двух группах в каждом эксперименте. Статистическая значимость различий рассчитывалась с помощью точного критерия Фишера. Дополнительно оценивалось отдельно для самок и потомства в обеих группах среднее арифметическое содержание серебра в образцах тканей и органов, а также стандартное отклонение (среднее ± СКО). В программе IBM SPSS Statistics v25 (IBM corp., USA) проверялась гипотеза различия содержания серебра в образцах группы контроля и группы эксперимента отдельно для самок и их потомства. В силу невыполнения условий применения параметрических критериев сравнение содержания серебра в двух группах проводили с помощью критерия Манна -Уитни. Статистически значимыми считали различия при p < 0,05. Во избежание эффекта случайности наблюдаемой повышенной рождаемости после первого случая наблюдения, как уже указывалось во введении, был проведен второй эксперимент, идентичный первому, но 26 Экология человека 2020.10 Эндоэкология только для оценки рождаемости без оценки накопления серебра в тканях в целях сохранения животных. Результаты В первом эксперименте рождаемость в экспериментальной группе была зафиксирована в количестве 117 детенышей, что значительно превышало таковую в контрольной группе (62 детеныша) почти в два раза. Выживаемость потомства была примерно равной в обеих группах: 97,4 % (114 из 117) и 100 % соответственно (точный критерий Фишера, p = 0,552). Средний показатель рождаемости (95 % ДИ) на одну самку составил в экспериментальной группе 4,68 (3,87-5,61) детёныша, в контрольной - 2,48 (1,9-3,18), точный критерий Фишера, p < 0,001. Таким образом, рождаемость в экспериментальной группе была статистически значимо в 1,89 раза выше, чем в контрольной (95 % ДИ: 1,39-2,57). Во втором эксперименте были получены схожие данные: 29 детенышей родилось у экспериментальных самок и 17 у контрольных, и все потомство выжило (100 % выживаемость в обеих группах). Средний показатель рождаемости на самку (95 % ДИ) в экспериментальной группе составил 5,8 (3,88-8,33) детёныша, в контрольной - 3,4 (1,98-5,44), p = 0,077. Соотношение рождаемости в экспериментальной группе к контрольной во втором эксперименте составило 1,71 (95 % ДИ: 0,94-3,1). Наглядно эти результаты представлены на рис. 2. 9 т ГО . I • -г >s 8 : й> • І 7І-і : Эксперимент I Эксперимент II □ Контроль □ Эксперимент Рис. 2. Сравнение рождаемости на одну самку во время экспериментов I и II в контрольной и экспериментальной группах. Линии погрешности на графике представлены границами 95 % двустороннего доверительного интервала; * - статистически значимые различия между группами В образцах органов и тканей экспериментальных самок и их потомства содержание серебра составило (среднее ± СКО): в мозге (серебро, прошедшее ге-матоэнцефалический барьер) - (0,36 ± 0,08) и (0,38 ± 0,10) мкг/г (р = 0,371) для самок и их потомства соответственно; в крови - (1,40 ± 0,62) и (3,77 ± 1,19) мкг/г (р = 0,001); в печени - (3,94 ± 0,91) и (3,7 ± 1,04) мкг/г (р = 0,733); в легких - (6,6 ± 1,36) и (5,3 ± 1,75) мкг/г (р = 0,129); в почках - (2,49 ± 0,85) и (2,93 ± 1,16) мкг/г (р = 0,513). Как видно, кроме данных по крови, где содержание серебра отличается почти в 3 раза, у потомства больше, а у самок меньше, статистически значимых отличий содержания серебра в других тканях и органах между экспериментальными самками и их потомством зафиксировано не было. В среднем содержание серебра в органах и тканях экспериментальных самок и их мышат составило соответственно (3,77 + 2,03) и (4,13 ± 1,52) мкг/г (р = 0,369). В контрольной группе содержание серебра в образцах как самок, так и потомства не превышало фонового уровня в (0,05 ± 0,04) мкг/г (р < 0,001) при чувствительности метода в 2-3 нг/г [7]. Таким образом, во всех образцах экспериментальных животных и их потомства содержание серебра было минимум в 10 раз выше, чем у контрольных мышей. Обсуждение результатов В результате проведенных исследований было обнаружено содержание серебра в органах и тканях экспериментальных животных, как самок, так и их потомства, минимум в 10 раз превышающее таковое у контрольных животных. Повышенный уровень накопления серебра был зафиксирован в том числе и в нейрональной ткани мозга, причем как у матерей, так и у их потомства. Таким образом, хронический и непрерывный контакт самок с AgNP в период спаривания, беременности и лактации приводит не только к существенному накоплению AgNP в их тканях и органах, в том числе защищенных биологическими барьерами, но и к проникновению AgNP в организм потомства с преодолением минимум гематоэнцефа-лического барьера уже у детенышей. Однако этот результат можно считать в целом ожидаемым в свете высказываемых гипотез, теоретических положений и уже опубликованных результатов исследований других авторов [1, 7, 17, 24, 25, 27, 29]. Более неожиданной оказалась практически удвоенная рождаемость в экспериментальных группах по сравнению с группами контроля, причем она наблюдалась дважды подряд. Единственным различием между группами животных в обсуждаемом исследовании было наличие или отсутствие длительного контакта самок с AgNP, поэтому логично сделать предположение о влиянии на рождаемость либо AgNP, либо материала их покрытия - ПВП. Механизм такого влияния пока авторам не известен и требует, безусловно, дальнейшего изучения и объяснения (если результаты будут четко воспроизводиться в после -дующих экспериментах), особенно ввиду того, что обычно рассматривается токсическое и угнетающее воздействие AgNP на процесс размножения [23]. Особенностью проведенного и обсуждаемого исследования было то, что самки (и самцы) в данном исследовании начали потреблять AgNP в период спаривания, с ежедневным потреблением порядка 135 мкг AgNP, и продолжали контакт с ними длительно (хронически) на протяжении порядка двух месяцев. Известные на сегодня авторам из литературы 27 Эндоэкология Экология человека 2020.10 схожие эксперименты по оценке влияния наночастиц металлов на потомство животных [7, 8, 18] несколько различаются методически. Например, мы в своем исследовании 2011 года сообщали [8], что различий в потомстве экспериментальных и контрольных групп мышей при приеме самками AgNP нами не обнаружено. Однако в том исследовании экспериментальные самки подвергались хронической экспозиции AgNP на протяжении одного месяца и до периода спаривания. В период спаривания и беременности они уже пили чистую воду. То есть налицо меньшая продолжительность контакта самок с AgNP и другая схема эксперимента. Наоборот, в исследовании [7], которое проводилось на крысах, AgNP вводились самкам уже после зачатия в период беременности, один раз на 20-й день беременности. Средний размер AgNP был существенно больше, порядка 35 нм, и отсутствовала контрольная группа для оценки изменения рождаемости. Таким образом, если сравнивать полученный результат с результатами этих исследований, то можно сделать вывод, что ключевое отличие - воздействие AgNP в период спаривания. Более или менее схожий с нашим эксперимент описан в [18]. Раствор AgNP серебра, размером (7.9 ± 0.95) нм, покрытие - цитрат, ежедневно вводили крысам принудительно через рот (через зонд): самцам - 42 дня (14 дней до спаривания, 14 дней во время спаривания, 14 дней после спаривания), а самкам - до 52 дней (начиная с 14 дней до спаривания и по первые 4 дня лактации). Экспериментальных животных разделили на три группы по 10 особей, 5 самцов и 5 самок, с различными суточными дозами получаемых AgNP: 62,5, 125 и 250 мкг на 1 г массы животного (существенно больше доза). Контрольным животным давали равный таковому у экспериментальных крыс объем дистиллированной воды. При подсчете потомства статистически значимых различий в рождаемости в группах эксперимента и контроля не зафиксировано, однако приведенное в публикации среднее на самку количество рожденных крысят в каждой из экспериментальных групп примерно на единицу выше группы контроля. Такой результат, отличный от нашего, может быть объяснен, например, очень большими дозами AgNP, использованием крыс вместо мышей (слабый довод), строгим использованием пар для размножения вместо группы из 5 самок на 1 самца, как в нашем эксперименте, или другими веществом покрытия наночастиц. Последнее заставляет задуматься над тем, что действующим фактором может оказаться не серебро как металл и не сами металлические наночастицы, а, в нашем случае, вещество покрытия - ПВП. Безусловно, еще одним недостатком проведенного нами исследования в свете обсуждаемых результатов является отсутствие контроля гормонального статуса у самок и самцов в период их спаривания, в том числе отсутствие доказательства равного гормонального статуса в группах эксперимента и контроля, т. к. механизм влияния AgNP может быть связан, напри мер, с нарушением гормонального баланса в присутствии AgNP в организме самок [14]. Не исключено и влияние AgNP на гормональный статус самцов в период спаривания, т. к. известны, например, данные о влиянии AgNP на морфологию спермы [21]. Нельзя исключить и просто случайного факта наличия по каким-либо причинам повышенного гормонального статуса самок или самцов в группах эксперимента (самцы даже более вероятно, т. к. их было меньше, чем самок, в 5 раз). Вместе с тем удвоенная рождаемость может указывать и на повышенное рождение однояйцевых близнецов (наиболее интересная гипотеза, по мнению авторов). Из экспериментов известно [15], что у млекопитающих для достижения полиэмбрионии (для искусственного разделения групп клеток зародыша на разных стадиях его развития) достаточно выполнить отделение бластомеров друг от друга путем химического растворения блестящей оболочки (zona pellucida) или механически разделять морулу или бластоцисту, например, микро-лезвием на примерно равные по количеству клеток части. Если AgNP или материал их покрытия каким-то образом ослабляют структурные связи между гликопротеинами блестящей оболочки, вызывая ее преждевременный распад на 2-3-й день после оплодотворения, или препятствуют формированию клеточных контактов при образовании морулы (бластоцисты), то появление однояйцевых близнецов в таком эксперименте становится объяснимым. Безусловно, подтверждение существования влияния AgNP или их покрытия на рождаемость и объяснение механизма - это предмет дальнейших исследований. Сегодня можно лишь осторожно констатировать сам факт полученного результата. Возможно, это было исключительно случайное стечение обстоятельств. Однако эффект был нами отмечен дважды, а это может также указывать и на его закономерное проявление. Заключение Неожиданный эффект увеличения почти в два раза рождаемости у самок мышей, хронически контактировавших с AgNP в период спаривания, беременности и лактации, по сравнению с группой контроля наблюдался дважды в эксперименте. Удвоенная рождаемость может указывать на повышенное количество однояйцевых близнецов. Однако это может быть и эффект от влияния AgNP на гормональный статус самок и/или самцов, а также быть случайным стечением обстоятельств. В любом случае требуется последующее воспроизведение эксперимента для подтверждения (опровержения) закономерности наблюдаемого эффекта с обязательным контролем гормонального статуса мышей-родителей и проверкой наличия однояйцевых близнецов в выводках.

About the authors

I. Zinicovscaia

Joint Institute for Nuclear Research

A. L. Ivlieva

Moscow Regional Research and Clinical Institute named after M. F. Vladimirskiy

E. N. Petritskaya

Moscow Regional Research and Clinical Institute named after M. F. Vladimirskiy

D. A. Rogatkin

Moscow Regional Research and Clinical Institute named after M. F. Vladimirskiy

Email: d.rogatkin@monikiweb.ru

References

Supplementary files