THE ROLE OF BIOSIMULATION IN HUMAN CHEMICAL SAFETY SYSTEM

Full Text

Профилактическая медицина призвана обеспечить сохранение состояния здоровья как работающего человека, так и всего населения, управляя компенсаторно-приспособительными механизмами для достижения максимально возможной адаптации организма к постоянно изменяющимся условиям окружающей среды [1, 3, 4, 10, 13]. В методологии изучения влияния химического загрязнения объектов окружающей среды на состояние здоровья человека одна из основных составляющих - эксперимен 46 Экология человека 2017.07 Медицинская экология тальные исследования на лабораторных животных, позволяющие изучить патогенетическую структуру и механизмы формирования исследуемых процессов. Современная доказательная медицина базируется на совокупности объективных данных, отражающих закономерности инициации и развития патологического процесса, этиопатогенетические факторы и механизмы при характерных для человека заболеваниях, в том числе возникающих при воздействии неблагоприятных экологических и производственных, прежде всего химических, вредных факторов. При этом результаты биомоделирования должны соответствовать основным принципам и постулатам доказательной медицины, в числе которых адекватность создаваемой модели патологии человека задачам исследований, допустимость переноса экспериментальных данных с модели на человека, корректный выбор информативных и доступных биомаркеров, критериев и методов оценки патологического процесса в организме лабораторных животных [6]. Конечным итогом биомоделирования должны являться лечебнопрофилактические рекомендации, направленные на выявленные при экспериментальных исследованиях точки приложения патологического процесса. Целью наших исследований явилось выяснение роли биомоделирования и разработка методологических подходов в решении вопросов, связанных с химической безопасностью человека в условиях возрастающего экологического прессинга населения Методы Модельные эксперименты проведены на 360 беспородных белых крысах и 120 морских свинках. Экспериментальных животных содержали в специальном помещении с 12-часовым светлым/тёмным циклом, регулируемой температурой и влажностью, со свободным доступом к чистой водопроводной воде и пище, включающей в себя все необходимые витамины и микроэлементы в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных целей (Страсбург, 1986), а также «Правил лабораторной практики» (приказ Минздравсоцраз-вития от 23 августа 2010 г. № 708н). Во всех сериях моделирования использовали половозрелых лабораторных животных, кроме отдельных экспериментов, в которых обследовали новорожденных крыс, при этом в каждой экспериментальной группе было по 8-10 животных. Умерщвление животных проводилось методом декапитации в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными приказом МЗ СССР от 12.08.1977 г. Экспериментальное моделирование биологических эффектов действия нового перспективного антимикробного нанобиокомпозита на основе трансмембранного биополимера арабиногалактана (АГ) и инкапсулированных в него наночастиц серебра - аргентумарабиногалактана (нАГ), разработанного в Институте химии им. А. Н. Фаворского [2], выполняли на беспородных белых крысах в подострых опытах путем внутрижелудочного введения (в течение 9 дней) нанобиокомпозита наносеребра (размер наночастиц 10-12 нм, содержание серебра - 16,73 %) в дозе 100 мкг/кг массы. Наночастицы серебра в биокомпозите инкапсулированы в полимерную матрицу -АГ, выделенную из лиственницы сибирской. Группа сравнения получала в эквивалентных дозах чистый АГ. Оценку воздействия нанобиокомпозита проводили интегрально, изучая состояние системы перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиокси-дантной системы (АОС), и на субклеточном уровне при помощи иммуногистохимического метода определения экспрессии белка bcl-2 и caspase 3 в нервных клетках в соответствии с протоколом, предложенным производителем (Menzel, Германия). Экспериментальное моделирование нейроинтоксикаций включало воздействие на лабораторных животных винилхлоридом, парами металлической ртути, сулемой, комплексом токсических веществ, образующихся при горении, при различных путях (ингаляционный, внутрижелудочный) и сроках (от двух до восьми недель) введения их в организм белых крыс. Обследование осуществляли сразу после окончания воздействия (ранний период) и через 6 месяцев после окончания воздействия (отдаленный период). Сочетанное воздействие биологического и химического факторов проводили путем сенсибилизации морских свинок белоксодержащей пылью (БСП) микробиологического производства и диоксидом серы в разных сочетаниях и последовательностях. Белоксодержащую пыль вводили морским свинкам по 500 мкг в смеси с неполным адъювантом Фрейнда под апоневроз задней лапки. Обязательным условием являлось создание у морских свинок низкодозной (НДТ) или высокодозной (ВДТ) толерантностей, индукцию которых вызывали по методике, предложенной Л. А. Дуевой, О. Г. Алексеевой, Т. И. Гришиной [5]. Ингаляционную затравку диоксидом серы осуществляли, помещая морских свинок в затравочные камеры на 4 часа в течение 10 дней. Концентрации диоксида серы (2-4 мг/м3), температура и влажность поддерживались на одном уровне. Ингаляционную экспозицию диоксидом серы проводили за 14 дней, или через 14 дней, или одновременно с сенсибилизирующими инъекциями БСП. Обследование животных осуществляли классическими методами, принятыми в токсико-гигиенических исследованиях, включающими биохимический, поведенческий, аллергологический, электронейрографиче-ский, гистологический, морфометрический анализ [7]. Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.0 (Statsoft, США). Статистическую значимость различий в независимых выборках определяли по методу Манна - Уитни. Достигнутый уровень значимости признаков - при p < 0,05. 47 Медицинская экология Экология человека 2017.07 Результаты На протяжении многих десятилетий нормирование факторов окружающей и производственной среды, включающее изучение зависимостей «доза - время - эффект» при изолированном, комбинированном, комплексном или сочетанном действиях, оставалось ведущим экспериментальным исследованием в гигиене и медицине труда. Именно на основании данного рода экспериментов основано законодательно утверждаемое регламентирование воздействия основных неблагоприятных факторов. Вместе с тем в последние годы стали появляться факты изучения биологических эффектов действия веществ, свидетельствующие о неполном соответствие основным принципам и подходам классической токсикологии. В большой степени это относится к наноструктурированным веществам и материалам. При экспериментальном изучении интегральной ответной реакции организма лабораторных животных на введение нанобиокомпозита нАГ с позиций классической токсикологии нами установлено повышение активности процессов АОС (SH-глутатиона, каталазы), отсутствие изменений в системе ПОЛ. При изучении среднесмертельной дозы нАГ при внутрижелудочном его введении белым крысам нанокомпозит отнесен по параметрам токсикометрии к 4 малоопасному классу веществ, имеющих DL50 при внутрижелудочном введении более 5 000 мг на кг массы животного. Однако результаты проведенного нами исследования свидетельствуют о неблагоприятных эффектах наночастиц серебра даже при заключении их в матрицу природного полимера АГ, уникальные свойства которого позволяют с легкостью преодолевать биологические мембраны организма, что дает возможность доставлять наночастицы к клеткам организма. Анализ активности регуляторных белков в нейронах при воздействии изучаемого нанобиокомпозита свидетельствовал об увеличении экспрессии в нейронах анти/про-апоптотических белков Ьс1-2 и caspase3 (табл. 1). Таблица 1 Экспрессия bcl-2 и caspase-3 при воздействии арабинога-лактана (АГ), аргентумарабиногалактана (нАГ), % от общего количества клеток в 0,2 мм2 Med (Q25-Q75), n = 10 Группа Bcl-2 Caspase-3 Погибшие клетки с экспрессией белка Живые клетки с экспрессией белка Погибшие клетки с экспрессией белка Живые клетки с экспрессией белка Контроль (интактные крысы) 0,59 (0,520,62) 2,07 (1,552,19) 0,68 (0,520,96) 1,93 (1,762,09) АГ 0,57 (0,430,99) 3,89 (2,465,92) 0,33 (0-0,67) 1,92 (1,66-2,1) нАГ 0,93 (0,531,68> 5,04 (4,3-5,35)4 1,1 (0,491,4> 4,9 (2,3412,8> Примечания:* - различия статистически значимы по сравнению с контрольной группой при р < 0,01; ♦ - различия статистически значимы по сравнению с группой АГ при р < 0,01. Статистическая значимость рассчитывалась по критерию Манна - Уитни. Иммуногистохимическое исследование экспрессии белкового фактора bcl-2, одной из функций которого, как известно, является предотвращение запуска процесса апоптоза, показало значимое возрастание количества нейронов, экспрессирующих bcl-2, однако протективное действие данного белка в полной мере не реализуется. Исследование при воздействии нАГ экспрессии эффекторного белка caspase-3, который активирует процесс апоптоза, выявило значимое повышение количества клеток, экспрессирующих caspase-3. Полученные результаты свидетельствуют об активации апоптотических процессов уже на 10-й день от начала введения нанобиокомпозита. Это сочетается с данными экспрессии ингибитора апоптоза bcl-2, который в ответ на активацию апоптотического процесса при воздействии изучаемого нанобиокомпозита начинает в эти же сроки оказывать протективное действие [8, 12]. Завершен цикл экспериментально-гигиенических исследований, включающих теоретические и прикладные вопросы оценки воздействия биотехнологических продуктов на организм человека. Биомоделирование позволило выстроить логическую схему проведения экспериментов, подчиненных основной цели - выявлению закономерностей биологических процессов, протекающих в организме животных [9]. При этом экспериментальное моделирование упрощает рассуждения, а принцип интегральной оценки ответной реакции облегчает понимание сущности получаемых явлений. Научно обоснована методология изучения и оценки характера сочетанного действия биологических и химических факторов в эксперименте, включающая несколько принципиально значимых моментов: • обязательным условием при постановке эксперимента является создание трех исходных базовых моделей (сенсибилизация, НДТ, ВДТ), формирующихся при воздействии биологического фактора любой природы; • введение химического вещества необходимо проводить соответственно при каждом состоянии в трех последовательностях: до, после и одновременно с введением БСП, что позволит выявить наиболее неблагоприятную последовательность сочетания биологического и химического факторов; • для понимания сущности ответных реакций организма предлагаем сжать полученную информацию посредством обобщенных показателей, облегчающих оценку состояния организма животных сравниваемых групп, и не анализировать изменения гомеостаза по отдельным параметрам или системам, а использовать принцип «доза - статус организма», позволяющий всю сумму развившихся эффектов оценивать как единое целое (рис. 1). По результатам нашего экспериментального исследования, в половине случаев сочетанного действия отмечался сенсибилизирующий эффект, интенсивность которого была в одних случаях выше, чем 48 Экология человека 2017.07 Медицинская экология Рис. 1. Схема постановки эксперимента при моделировании сочетанного действия биологического (БФ) и химического (ХФ) факторов при изолированном действии, в других - на том же уровне. Эффект, характерный для симптомокомплек-са «аллергопатии», получен в 25 % случаев, как и количество реакций, отнесенных нами к токсико-аллергопатическому типу (рис. 2). Рис. 2. Долевое распределение ответной реакции организма белых крыс при сочетанном воздействии биологического и химического факторов Проведенными многолетними экспериментальными исследованиями по моделированию на лабораторных животных (белых крысах) токсической энцефалопатии при воздействии различных химических токсикантов установлено, что формирование нейротоксического процесса у белых крыс при воздействии различных нейротоксикантов имело как общие закономерности, так и свои отличительные особенности, обусловленные специфическими свойствами изучаемых токсикантов. Во всех случаях у экспериментальных животных наблюдали значительное изменение видоспецифического поведения, характерного для грызунов, стойкое нарушение нормального соотношения между процессами возбуждения и торможения в коре головного мозга. При интоксикации парами металлической ртути, сулемы и комплекса токсических веществ первоначально Сравнительная характеристика патоморфологических нарушений в ткани головного мозга при воздействии неорганических соединений ртути в динамике эксперимента Таблица 2 Морфологический признак Пары металлической ртути Сулема Обследование в ранний период Обследование в отдаленный период Обследование в ранний период Обследование в отдаленный период Периваскулярный отек ткани головного мозга Ярко выраженный Сохраняется Выраженный Сохраняется Перицеллюлярный отек Отмечается Сохраняется Отмечается Сохраняется Число дистрофически измененных нейронов в коре головного мозга, шт/0,2 мм2 14,2 (11,6-16,8) 11,0 (9,0-16,0) 12,0 (10,0-15,0) 9,0 (7,0-11,0) Численная плотность нормальных нейронов на единицу площади (по сравнению с контролем) і на 50,0% і на 51,0% і на 26,8% і на 42,0% Площадь митохондрий і на 62,1% і на 37,6% і на 38,5% Достигла контрольных значений Площадь ядер нейронов Î на 66,0% Î на 50,0% Î на 25,0% Î на 31,9% Число глиальных клеток коры головного мозга на единицу площади (по сравнению с контролем) і на 43,6% і на 10,3% Î на 55,0% Î на 7,0% Экспрессия кислого глиального белка-GFAP іі і і і Экспрессия белка S-100 іі і і і Толщина гранулярного слоя мозжечка, мкм 13,8 (13,5-4,2) 9,7 (8,7-11,3) 10,2 (9,8-13,3) 8,7 (8,3-11,2) Дистрофия клеток Пуркинье, шт/0,2 мм2 3,6 (3,2-4,9) 5,6 (5,3-8,4) 7,2(5,4-7,9) 4,13(1,03-6,1) Примечание. і - значение показателя снижается; Î - значение показателя повышается. 49 Медицинская экология Экология человека 2017.07 преобладали процессы возбуждения с последующим динамическим развитием процессов торможения [8], в то время как длительное воздействие винилхлоридом вызывало нарушение тормозного компонента с преобладанием патологически выраженного возбуждающего компонента. При воздействии как препаратов ртути, так и винилхлорида в показателях биоэлектрической активности головного мозга преобладала патологическая медленноволновая активность, выявлялись нарушения корково-подкорковых взаимосвязей, проявляющиеся в изменении коркового зрительного ответа в виде отставания по времени реакции коры, увеличении латентности Р200 и длительности всего ответа. Во всех случаях по данным электро-нейромиографического исследования выявлялись значимые изменения состояния нервного ствола, соответствующие аксональному типу поражения. Патоморфологическая верификация поражения нервной ткани изучаемыми нейротоксическими соединениями не имела существенных качественных различий и характеризовалась однотипными структурно-морфологическими повреждениями. В табл. 2 представлена сравнительная характеристика морфофункционального состояния нервной ткани при воздействии неорганических соединений ртути. Периваскулярный и перицеллюлярный отек, дистрофия нейронов коры головного мозга и клеток Пуркинье; структурное нарушение слоев сенсомоторной коры и гиппокампа, нарушение метаболической активности нервных клеток имели неспецифический характер и были обусловлены гипоксией, нарушениями церебральной гемодинамики, внутриклеточного метаболизма и др. Обращало на себя внимание наличие выраженного спонгиоза при воздействии винилхлорида, нарушение миелиновой оболочки аксонов и гибели клеток в отдельных случаях по апоптозному типу при воздействии препаратами неорганической ртути и комплексом токсических веществ. Морфометрический анализ показал снижение площади митохондрий и возрастание площади ядер нейронов коры; сокращение плотности расположения нейронов коры, клеток Пуркинье на единице площади; пролиферацию глиальных элементов. Высокоинформативная иммуногистохимическая идентификация изменений ткани головного мозга выявила снижение экспрессии кислого глиального белка, S-100 и повышение нейронспецифической енолазы. Обсуждение результатов Экспериментальные исследования дают возможность объективно оценивать воздействие различных факторов окружающей среды на организм, выявлять точки приложения и механизмы их неблагоприятного действия. Визуализация патологического процесса при экспериментальном моделировании с позиций доказательной медицины направлена на прицельные, патогенетически обоснованные лечебно-профилактические мероприятия: первоначально, в экспериментальных условиях, а в дальнейшем и при реабилитации больных или пострадавших. Проведенные нами исследования по оценке особенностей биологического действия наноструктурирован-ных препаратов позволяют высказать утверждение, что нельзя их токсичность рассматривать, используя только методы классической токсикологии. К сожалению, традиционные подходы для оценки токсичности химических веществ недостаточны для веществ в нанофазе, так как методология изучения биологических свойств наночастиц, основанная на принципах классической токсикологии с определением стандартных параметров токсикометрии, не всегда обеспечивает безопасность наноструктурированных препаратов. Развивающаяся при этом ответная реакция основных регулирующих систем чаще всего не укладывается в прямолинейную классическую зависимость «доза - эффект». Возникающее при внутрижелудочном поступлении нанобиокомпозита нАГ нарушение клеточной и внутриклеточной организации нейронов следует рассматривать как патогенетический фактор, играющий определенную роль в формировании соматической патологии. В связи с вышеизложенным относить нанобиокомпозит нАГ к малоопасным веществам представляется по меньшей мере необоснованным и преждевременным. Существует потребность в разработке новых подходов к оценке общебиологического риска воздействия нанопрепаратов, обладающих высокой специфичностью к биомишеням, на клеточном и внутриклеточном уровнях на основании результатов электронно-микроскопических исследований клеток-мишеней с изучением внутриклеточной протеомики и наблюдением в течение длительного периода. Экспериментальное изучение сочетанного действия факторов биологической и химической природы дает основание утверждать как минимум следующее: • конечный ответ организма при сочетанном воздействии биологического и химического факторов определяется его исходным донозологическим состоянием; • последовательность воздействия биологического и химического факторов является определяющей в формировании качественной и количественной ответной реакции организма; • для оценки ответной реакции организма на сочетанное действие биологического и химического факторов следует учитывать как специфические, так и неспецифические показатели функционирования основных физиологических систем организма при определяющей роли изменений иммунного статуса. Основными проявлениями реализации ответных реакций организма при моделировании различных вариантов и уровней сочетанного воздействия биологического и химического факторов являются формирование в одних случаях сенсибилизации или аллергопатии, в других - токсико-аллер-гопатических реакций. Учитывая возрастающее биологическое загрязнение атмосферного воздуха населенных мест, считаем, что предложенные методические подходы будут являться актуальными и лежать в основе биомоделирования при изучении 50 Экология человека 2017.07 Медицинская экология Рис. 3. Критерии достоверности формирования экспериментальной токсической энцефалопатии сочетанного действия различных биологических и химических факторов. Разрабатываемые в последнее десятилетие в институте методологические подходы к моделированию на лабораторных животных (белых крысах) токсической энцефалопатии при воздействии различных химических токсикантов позволили выявить основные точки реализации патологического процесса и факторы, обусловливающие формирование и прогрессирование токсической энцефалопатии. Для объективной визуализации нейротоксического эффекта воздействия различных ксенобиотиков нами разработан и адаптирован комплекс высокочувствительных методов, позволяющий оценить различные звенья патологического процесса в центральном и периферическом отделах нервной системы: тесты «открытое поле», «крестообразный лабиринт», «чужак-резидент», длительность удержания на вращающемся стержне, выработка условного пищедобывательного рефлекса дифференцировки освещенности, электроэнцефалография (ЭЭГ) с фотостимуляцией и вызванными потенциалами, электронейромиография (ЭНМГ) периферических нервов и мышц, обзорная микроскопия, морфометрия и иммуногистохимия нервной ткани с определением антител к нейронспецифической енолазе, глиофибриллярному кислому протеину, белку S-100, синаптофизину, электронная микроскопия. Следует сразу оговориться, что не все методы из приведенных выше были одинаково информативны, порой некоторые из них имели противоположную направленность. В связи с чем нами предложены критерии верификации токсической энцефалопатии у белых крыс (рис. 3) [11]. В целом при решении фундаментальных вопросов профилактической медицины экспериментальные исследования дают возможность управлять рисками и механизмами формирования патологических процессов при воздействии экологических факторов на организм человека и существенно повышают эффективность разработанных способов диагностики, лечения, профилактики и реабилитации.

About the authors

L. M. Sosedova

Email: sosedlar@mail.ru
East-Siberian Institute of Medical and Ecological Research Angarsk State Technical University Angarsk, Russia

T. M. Filippova

Angarsk State Technical University Angarsk, Russia

References

Supplementary files