MITOCHONDRIAL WAY OF INITIATION OF APOPTOSIS OF LYMPHOCYTES AGAINST THE BACKGROUND OF SUPPRESSION OF PROLIFERATION OF T-CELLS AT LIMFOPENIA AT ALMOST HEALTHY INHABITANTS OF THE ARCTIC

Full Text

Среди различных вариантов дисбалансов иммунологической реактивности у практически здоровых жителей Архангельской области значительную долю - (23,2 ± 0,35) % занимают лимфопения, или дефицит содержания в крови циркулирующих лимфоцитов менее 1,5 X 109 кл/л (рис. 1). Рис. 1. Частота регистрации лимфопении у взрослых жителей Арктики (на 1 000 человек) Лимфопения может служить признаком сокращения адаптивного иммунного ответа, в результате чего снижается количество клонов лимфоцитов, несущих специфические антигенраспознающие рецепторы и корецепторы. Кроме того, может наблюдаться недостаточность в процессе формирования иммунных клеток памяти, экспрессирующих на своей мембране ингибирующие активацию молекулярные структуры. При повторном попадании антигена в организм человека в условиях лимфопении повышается вероятность развития инфекционного процесса с формированием хронических патологий. У обследованных практически здоровых женщин 35-45 лет лимфопения выявлена в 32 % случаев [1]. Для данных лиц характерен низкий уровень спонтанной лимфопролиферации как по содержанию больших гранулярных лимфоцитов в структуре лимфоцитограммы, так и в условиях in vitro при культивировании лимфоцитов без митогена. Значительные уровни лимфопении установлены у детей Приморского, Каргопольского, Вилегодского районов, на Соловецких островах. Недостаток содержания лимфоцитов в крови отражается в снижении общей концентрации Т-лимфоцитов CD5+ и функционально активных CD3+, высоком уровне Т-хелперных иммунодефицитов, меньшем количестве клеток с рецептором к IL-2. У взрослых жителей городов Новодвинска и Коряжмы, проживающих в условиях влияния целлюлозно-бумажного производства, уровень дефицита Т-лимфоцитов CD5+, CD3+ выражен в большей степени, чем в среднем по Архангельской области [2]. Сравнительный анализ результатов выявления лимфопений и лимфопролифераций свидетельствует, что лимфопении развиваются, как правило (в 85 % случаев), после продолжительных или частых лимфо-пролифераций с увеличением в крови молодых форм клеток. Такие реакции, половина из которых явля ются скрытыми и выявляются только повышенным содержанием CD7+ и CD 10+ лимфоцитов, могут возникать на инфекцию, переохлаждение, смену фотопериодики, иономагнитные возмущения. Возможно, причиной возникновения лимфопений у практически здоровых людей служит активизация апоптоза, или программируемая гибель клеток. В связи с этим целью работы было исследование процесса апоптоза в развитии лимфопений, регистрируемых среди дефектов иммунологической реактивности жителей Архангельской области. Апоптоз - это безопасная элиминация отработанных, мутировавших, инфицированных клеток, проявляющаяся фрагментацией хроматина, кариорексисом, лизисом ядра с образованием апоптотических телец (участков клетки, окруженных мембраной). Программируемая гибель отличается от некроза тем, что она обеспечивается нарушением целостности клеточной мембраны с последующим повреждением внутриклеточных органелл и ядра. Клетки метятся к апоптозу сигнальными молекулами семейства фактора некроза опухоли (TNF) при внешнем пути инициации апоптоза; внутренний путь определяется нарушениями митохондриальной функции. Методы Проведено обследование 76 практически здоровых людей в возрасте от 20 до 60 лет, проживающих и работающих в Архангельской области Российской Федерации. Обследуемые являлись клинически здоровыми добровольцами, не страдавшими острыми инфекционными заболеваниями, у которых не было выявлено признаков аутоиммунных и лимфопролифе-ративных заболеваний, частота острых респираторных заболеваний составляла не более 1 раза в год. Исследование проводили с соблюдением основных норм биомедицинской этики, утвержденных Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации об этических принципах проведения медицинских исследований (2000). Для изучения взаимосвязи содержания циркулирующих лимфоцитов и состояния программируемой клеточной гибели были выделены две группы обследуемых лиц: с нормальным (2,5-4,0 X 109 кл/л, n = 44) и пониженным (<1,5 х 109 кл/л, n = 32) уровнем лимфоцитов в крови -средние значения составляли (2,97 ± 0,04) и (1,23 ± 0,04) X 109 кл/л соответственно, p < 0,001. Группы были практически равноценны по возрасту - (25,9 ± 1,6) и (25,3 ± 1,5) года и полу (65-70 % женщин и 30-35 % мужчин). Программируемую гибель лимфоцитов периферической крови оценивали с помощью FITC-аннексина-У специфически связывающегося с участками фос-фатидилсерина на мембранах апоптозных клеток, и пропидиума йодида, позволяющего дифференцировать клетки с интактной и проницаемой мембраной. Анализ апоптотически измененных лимфоцитов AnV+/PI-проводился на проточном цитофлуориметре Epics XL (Beckman Coulter, США). В мазках крови, окрашенных 23 Эндоэкология Экология человека 2018.05 по Романовскому - Гимзе, определяли лимфоцитограм-му с выделением малых (диаметр клетки до 8 мкм), средних (8-12 мкм) и больших (более 12 мкм) лимфоцитов. Методом твердофазного иммуноферментного анализа в сыворотке крови выявляли концентрации TNF-a, IFN-y, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, sFasL, TRAIL, цитохрома с (Bender MedSystems, Австрия). Данным методом также детектировали уровни трансферрина и ^А в крови, используя реактивы компаний DiaSys и Seramun Diagnostica (Германия). Реакцию оценивали с помощью фотометра Multiskan MS (Labsystems, Финляндия) при длине волны 450 нм. Содержание фенотипов лимфоцитов определяли методом двойной пероксидазной метки с использованием моноклональных антител (НПЦ «МедБиоСпектр», Россия). Результаты исследования обработаны с использованием пакета прикладных программ Statistica 6 (StatSoft, США). Тип исследования - ретроспективный, выборки случайные, одномоментные. Генеральная совокупность - жители севера европейской территории России. Границы нормального распределения количественных показателей определяли при помощи критерия Шапиро - Уилка. При анализе полученных результатов использовали среднее значение и стандартное отклонение, медиану и нижний, верхний квартили. Значимость различий между группами оценивали с помощью параметрического t-критерия Стьюдента для независимых выборок и непараметрического критерия Уилкоксона. Статистическая значимость присваивалась при значении p < 0,05. Результаты Дефицит лимфоцитов в крови менее 1,5 х 109 кл/л у обследованных практически здоровых жителей Арктики сопровождается сокращением относительного содержания фенотипов CD10 + , CD16+, CD23+, CD25+, CD95+, HLADR (рис. 2). Уровень цитотоксических лимфоцитов CD8+, наоборот, растет без изменения со стороны зрелых Т-клеток (CD3+), Т-хелперов (CD4+) и клеток с рецептором к трансферрину (CD71 + ). При лимфопении наблюдается увеличение количества само го трансферрина с 204,5 (185,3-235,8) до 285,3 (204,2-419,1) мг/дл, р = 0,001. Апоптоз лимфоцитов в процентном выражении не имеет статистически значимых различий у лиц с нормальным и пониженным уровнем лимфоцитов в крови (таблица), как и показатель их некроза. При лимфопении уменьшается абсолютное содержание апоптотических AnV+/PI- и некротизированных AnV+/PI+ клеток по сравнению с таковым уровнем у людей с нормальным содержанием циркулирующих лимфоцитов. Кроме того, в крови падает концентрация TRAIL, но увеличивается количество цитохрома с и sFasL. Содержание иммунологических показателей в крови практически здоровых людей в зависимости от общего уровня лим( юцитов Показатель Лимфоциты 2,5-4,0 х 109 кл/л Лимфоциты <1,5 х 109 кл/л р Апоптотические лимфоциты AnV+/PI-, % в абс., х 109 кл/л 4,37 ± 0,58 5,04 ± 0,91 0,083 0,13 ± 0,02 0,06 ± 0,01 0,032 Некротические лимфоциты AnV+/PI+, % в абс., х 109 кл/л 1,81 ± 0,55 1,39 ± 0,41 0,076 0,05 ± 0,01 0,01 ± 0,004 0,023 TNFa, пг/мл 20,8 (29,442,6) 36,2 (15,1114,6) 0,014 IFNy, пг/мл 8,2 (2,3-19,9) 32,9 (4,291,1) 0,002 IL-2, пг/мл 12,3 (2,716,3) 3,7 (2,3-11,8) 0,013 IL-4, пг/мл 3,5 (1,7-6,9) 10,6 (4,972,7) 0,024 IL-6, пг/мл 9,1 (3,5-10,8) 10,7 (7,214,5) 0,078 IL-10, пг/мл 0,52 (0,140,88) 0,34 (0,060,74) 0,022 TRAIL, пг/мл 14,6 (5,249,1) 11,9 (11,455,6) 0,031 sFasL, нг/мл 0,07 (0,040,12) 0,12 (0,060,17) 0,014 Цитохром с, нг/мл 0,07 (0,050,10) 0,1 (0,070,12) 0,028 Лимфоцитограмма периферической крови в условиях лимфопении характеризуется повышением Рис. 2. Содержание фенотипов лимфоцитов в крови практически здоровых жителей Арктики в зависимости от общего уровня лимфоцитов 24 Экология человека 2018.05 Эндоэкология Рис. 3. Лимфоцитограмма крови практически здоровых жителей Арктики в зависимости от общего содержания лимфоцитов относительного уровня малых клеток и снижением числа больших без изменения со стороны средних лимфоцитов (рис. 3). Цитокиновый профиль людей с дефицитом содержания лимфоцитов характеризуется увеличением концентрации IFNy, IL-4 и TNFa на фоне уровня IL-6, практически одинакового по сравнению с таковым у лиц с нормальным содержанием лимфоцитов в крови (см. таблицу). Однако при лимфопении регистрируется снижение концентраций IL-2 и IL-10. Обсуждение результатов Выявленное снижение уровня активизации лимфоцитов за счет сокращения чувствительности к IL-2 и антигенам главного комплекса гистосовместимости класса II, уменьшение пролиферативной реакции в системе лимфоцитов и их дифференцировки в совокупности обусловливает развитие выраженной лимфопении у практически здоровых людей. Относительный показатель апоптоза лимфоцитов при этом не меняется, как и клеточной гибели путем некроза. Однако изменяется путь инициации апоп-тоза: подавляется внешний рецепторный механизм активизации программируемой гибели, замещаясь митохондриальным вариантом инициации апоптоза. Так, содержание CD95+ и концентрация апоптоз-индуцирующего лиганда TRAIL снижается, но возрастает уровень цитохрома с. В результате угасания программируемой гибели лимфоцитов по механизму Fas повышается уровень протеолитического шеддинга (сброса) отработанных молекул FasL в межклеточное пространство. Можно сделать вывод, что апоптоз не является ведущей причиной развития лимфопении. Вероятно, дефицит лимфоцитов в крови практически здоровых людей объясняется снижением активности процессов пролиферации, ассоциированных с низкими уровнями содержания IL-2 и клеток с рецептором к данному цитокину (CD25 + ). Известно, что IL-2 стимулирует пролиферацию лимфоцитов с рецептором CD25+ сразу после появления на клеточной мембране рецептора к трансферрину (CD71+) [6]. Экспрессия гена рецептора к трансферрину при лимфопении не возрастает, содержание самого трансферрина в сыворотке крови заметно повышается. Появление мембранного CD71 ассоциировано с ростом потребности клетки в энергетическом ресурсе и железе, транспортируемом железосодержащими белками, главным из которых является трансферрин. Транс-феррин активирует Т-лимфоциты, стимулирует выработку IL-2, синтез ДНК и пролиферацию клеток [16]. Трансферриновый рецептор широко экспрессируется на незрелых клетках, тканях плаценты и быстро делящихся клетках как в норме, так и при опухолях [19]. В нашем исследовании снижение уровня лимфопро-лиферативной активности при изучаемых вариантах лимфопении у практически здоровых на момент эксперимента людей доказывается низкими концентрациями активированных клеток и лимфоцитов, способных к пролиферации (CD10+). Мембранный CD10 характерен для молодых пролиферирующих клеток различного типа, в том числе нейтрофилов, эпителиоцитов, моноцитов, Т- и В-лимфоцитов, тимоцитов, гепатоцитов, клеток лейкемии [7, 12, 14, 15]. Известно, что CD10 имеет активность цинксвязывающей металлопроте-азы, которая гидролизует брадикинин, энкефалин и субстанцию Р. Повышение экспрессии гена CD 10 связано с активизацией клеток, повышением в сыворотке крови TNFa и С5а; считается, что мембранный CD10 обусловливает способность клетки отвечать на множество воспалительных пептидов [20]. Популяция CD8+ является неоднородной, выполняющей цитолитические функции Т-лимфоцитов, которые могут обеспечивать, в том числе, иммуно-депрессивные эффекты. Активизация Т-лимфоцитов приводит к формированию двух независимых субпопуляций, одна из которых запрограммирована на киллерно/супрессорную функцию, вторая призвана помогать другим типам клеток в иммунном ответе [5, 8]. Молекулам HLADRII, содержание которых ниже на фоне лимфопении, отводится ключевая роль в регуляции активности всех антигенпредставляющих клеток [3, 4]. Аутокринный сигнал IFN-y, уровень которого также растет при лимфопении, промоти-рует дифференцировку CD8 и стимулирует усиление эффекторной их функции [11]. Превращение индукторной антиген-реактивной Т-клетки в супрессорную происходит, скорее всего, по типу обратной связи, ибо степень супрессорной 25 Эндоэкология Экология человека 2018.05 активности увеличивается пропорционально уровню активирования индукторов. Мишенью действия супрессоров являются те же индукторные клетки, ответственные за активацию данного пути диффе-ренцировки [9, 10]. Считается, что приобретение цитолитической функции связано с потерей предшественниками дифференцирующих молекул [13, 17]. Таким образом, активизация цитотоксических Т-клеток на фоне лимфопении фактически может отражать компенсаторную регуляцию уровня пролиферации на фоне лимфопении. Известно, что снижение содержания лимфоцитов в крови происходит параллельно увеличению митотической активности в лимфатических узлах: увеличиваются размеры па-ракортикальной зоны, нарастает содержание малых, больших лимфоцитов и бластов [18]. Позже (от 6 часов до 3-7 дней) лимфопролиферативные процессы появляются в паракортикальной зоне и зоне фолликулов с формированием плазмоклеточной реакции. Недостаток содержания лимфоцитов в крови практически здоровых жителей Арктики ассоциирован с ингибицией процессов пролиферации в системе лимфоцитов со снижением уровня CD 10+ и концентрации IL-2. Активность апоптоза лимфоцитов на фоне лимфопении не изменяется, но регистрируется преобладание митохондриального пути его инициации, что взаимосвязано с недостаточностью энергетического обеспечения клетки.

About the authors

O A Stavinskaya

Institute of Environmental Physiology of Federal Center for integrated Arctic research of the Russian Academy of Sciences

L K Dobrodeeva

Institute of Environmental Physiology of Federal Center for integrated Arctic research of the Russian Academy of Sciences

References

Supplementary files