POTENTIAL DANGER OF NANOSIZED POWDER BLUE TO HUMAN HEALTH

Full Text

Активное развитие исследований в области нанообъектов и наноструктур свидетельствует об особой актуальности вопросов оценки потенциальной опасности и токсиколого-гигиенической безопасности продуктов наноиндустрии для здоровья человека и объектов среды обитания. Нанодисперсный оксид кобальта входит в перечень наноматериалов, которые активно внедряются в сферу электропотребления, нанооптики, биодиагностики (в качестве биохимических сенсоров), нанохимии, ме таллургии [8]. Он используется в качестве исходного материала для формирования магнитных полимерных микросфер, контрастного агента в магнитно-резонансной томографии в комбинации с золотом, железом, графитом и платиной, при терапии злокачественных новообразований, в анаэробной очистке сточных вод, в кобальтохромовых сплавах в имплантах [12], накопителях энергии [9], в производстве электрохромных и газовых сенсоров, как анодный материал в литий-ионных микробатареях, в системах доставки лекарств 36 Экология человека 2018.01 Экология труда и для получения нанолекарств (наночастицы кобальта, стабилизированные додецилсульфатом натрия, имеют значительную антимикробную активность против грамположительных бактерий Bacillus subtilus). Это свойство обусловливает большой потенциал для получения лекарственных препаратов с бактерицидным эффектом действия и может служить начальной платформой направленной доставки лекарств [14], адъювантом для вакцинации человека [13, 19]. Принимая во внимание широкий спектр производств и ассортимент выпускаемой продукции с применением наноразмерного оксида кобальта, объем производства можно оценить как массово выпускаемый продукт (1-1 000 т в год). Прямое экспонирование наночастицами кобальта возможно на производстве, из объектов окружающей среды или при использовании в качестве фармакологических препаратов и средств медицинского назначения. С учетом активного внедрения нанодисперсного оксида кобальта в различные сферы производства, контактировать с которыми предполагается широкой категории населения и работающих, актуальным является оценка его потенциальной опасности для здоровья при различных путях поступления в организм человека. Цель работы - оценка потенциальной опасности биологического действия и научное прогнозирование токсичности наноразмерного оксида кобальта для здоровья человека. Аналитическое обобщение информации, представленной в аннотируемых зарубежных и отечественных источниках литературы, а также собственные результаты исследования показали, что наночастицы оксида кобальта в поперечнике имеют размеры в диапазоне от 41,2 до 77,9 нм, характеризуются преимущественно сферической формой частиц. Удельная площадь поверхности составляет (42,1 + 0,3) м2/г, по данным других авторов, удельная площадь, установленная ВЕТ-методом, достигает 73,70 м2/г, что свидетельствует о потенциальной высокореакционноспособности частиц [13]. Однозначного мнения о гидрофобности и гидрофильности наночастиц оксида кобальта не выявлено [10]. Нанодисперсный оксид кобальта относится к слегка растворимым в воде соединениям (доля растворимых частиц составляет 0,00156 г/дм3 при температуре 20 °С) [8]. Эффективный заряд наночастиц в водной суспензии отрицательный, что потенциально увеличивает их способность проникновения через тканевые барьеры [20]. Частицы склонны к агрегации. Установлено, что дзета-потенциал наночастиц оксида кобальта в воде составляет 15,3 мВ, что характеризуется как низкое значение и свидетельствует о склонности частиц к агрегации и, как следствие, снижении устойчивости дисперсии [4]. Нанодисперсный оксид кобальта способен генерировать свободные радикалы, что подтверждается в исследованиях in vitro, результаты которых показали индукцию ионов на клеточном уровне с помощью механизма троянского коня, которые связываются с везикулами и являются причиной индукции активных форм кислорода (АФК) [12, 18]. Способность индуцировать АФК проверена на эндотелиально-подобных (ECV-304) и гепатомных (HepG2) клеточных линиях. Выявлено дозозависимое индуцирование АФК в обеих клеточных линиях, хотя HepG2 были менее чувствительны. Повышенное образование АФК вызывает окислительный стресс (в частности, окислительное повреждение белков и ДНК), участвует в процессах апоптоза. Окислительный стресс оценивался путем измерения уровня АФК, перекисного окисления липидов, глутатиона, супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы в клеточной культуре HepG2. Результаты показывают, что нанодисперсный оксид кобальта способствует внутриклеточной генерации АФК в зависимости от времени. О том, что наночастицы кобальта вызывают окислительный стресс, также свидетельствует истощение глутатиона и индукции липид пироксида, СОД и каталазы [4, 14, 16]. Повышенное образование АФК, с одной стороны, вызывает окисление белков и окислительное повреждение ДНК, с другой - оказывает нейропротекторное действие на окислительный стресс, индуцированный гипоксией. Не исключено, что эти противоречивые результаты могут быть вызваны различием в клеточном поведении или в экспериментальных условиях [15]. Исследование окислительного стресса по результатам измерения уровня АФК, перекисного окисления липидов (ПОЛ), глутатиона, СОД и каталазы в культуре клеток HepG2 показало, что исследуемое вещество способствует внутриклеточной генерации АФК в зависимости от времени. О том, что наночастицы оксида кобальта вызывают окислительный стресс, также свидетельствует истощение глутати-она и индукция ПОЛ, СОД и каталазы. При этом выявлены токсичные эффекты растворенных ионов Со2+ в той же культуре клеток в виде снижения показателей МТТ-теста, ЛДГ, окислительного стресса (АФК, ПОЛ, глутатион и СОД), апоптоза (каспаза-3 и конденсация хроматина) и повреждение ДНК, но эффекты были менее значительные, чем при аналогичных концентрациях наночастиц [4]. По полученным данным о молекулярно-биологических характеристиках можно судить о том, что наночастицы оксида кобальта способствуют прямому повреждению ДНК [4, 7]. Об этом свидетельствуют результаты исследования культуры клеток альвеолярного эпителия человека (А549) при концентрации 40 мкг/см3 после 2-часовой экспозиции, 20 и 40 мкг/см3 после 24-часовой экспозиции. Окислительное повреждение ДНК с дозозависимой тенденцией было статистически значимым для концентраций 20 и 40 мкг/см3 для 2- и 24-часовой экспозиции. В культуре клеток бронхиального эпителия человека (BEAS-2B) зафиксировано прямое повреждение ДНК после 2- и 24-часовой экспозиции при тех же дозах исследуемого вещества. Окислительное повреждение ДНК с дозозависимой тенденцией являлось статистически значимым только при кон 37 Экология труда Экология человека 2018.01 центрации 40 мкг/см3 при 2-часовой экспозиции. В линии клеток А549 после 24-часовой экспозиции нанодисперсным оксидом кобальта окислительное и прямое повреждение ДНК, при концентрациях 40 и 20 мкг/см3 соответственно, существенно выше, чем в линии клеток BEAS-2B [2]. В культуре клеток HepG2 выявлено индуцирование каспазы-3, которая играет ключевую роль в апоптозе клеток, через 24 часа после обработки нанодисперсным оксидом кобальта. Кроме того, замечена конденсация хроматина. Активация каспазы-3 и конденсация хроматина в HepG2 предположительно вызывает смерть клеток в результате апоптоза. Подверженные воздействию клетки показали более высокое повреждение ДНК, чем в контрольной группе. Постепенный нелинейный рост повреждений в ДНК замечен в клетках, где доза и время воздействия увеличены. Наибольшее повреждение ДНК зафиксировано при концентрациях от 15 мкг/см3 [5]. Активные формы кислорода могут вызвать повреждение ДНК. Кинетическая стадия профиля экспрессии генов, индуцированной вдыханием на-нодисперсного оксида кобальта, в клетках легочного эпителия показала снижение регуляции транскрипции генов. Около 14 % дифференциально выраженных транскриптов были вовлечены в иммунные процессы [16]. Тест микроядра показал для наночастиц кобальта статистически значимую индукцию хромосомной аберрации [17]. Наночастицы оксида кобальта при взаимодействии с мембраной клетки вызывают ее повреждение (цитотоксичность), о чем свидетельствует их способность адсорбироваться на поверхности, приводя к образованию отверстий, что увеличивает вероятность транспорта посторонних примесей токсикантов из внешней среды во внутреннюю среду организма, так как максимальная емкость адсорбции метиленового синего красителя на поверхности нанодисперсного оксида кобальта в водной суспензии равна 5 000 - 5 500 мг/г [2, 6, 20]. Индикатором повреждения мембраны служит выброс лактатдегидрогеназы из клеток. В культуре клеток A549 не обнаружено увеличения ЛДГ, в то время как индукция повреждения мембраны обнаружена в культуре BEAS-2B после 2-часовой экспозиции концентрациями 5 и 40 мкг/ см3 [7]. Наночастицы оксида кобальта вызывают дозозависимую утечку ЛДГ из мембраны HepG2 [4]. Для оценки цитотоксичности нанодисперсного оксида кобальта в культуре клеток HepG2 исследована митохондриальная функция (снижение показателей МТТ-теста) и повреждение мембраны (утечка ЛДГ). Результаты МТТ-теста демонстрируют зависимость цитотоксичности от концентрации вещества и времени воздействия. Снижение показателей МТТ-теста наблюдалось после 24- и 48-часовой экспозиции при концентрациях нанодисперсного оксида кобальта в суспензии 5, 10, 15 и 25 мкг/см3. Морфологические изменения в клетках были заметны после 24-часовой экспозиции концентрацией 10 мкг/см3. Клетки, обрабатываемые концентрацией 25 мкг/см3, после 48 часов приняли сферическую форму [11, 19]. Цитотоксичность в культуре клеток HaCaT оценена по показателям митохондриальной активности и общей жизнеспособности клеток. Клетки были подвержены воздействию возрастающими концентрациями нанодисперсного оксида кобальта (0,023 1 500 мкг/см3) в течение различного времени (24 ч, 48 ч, 7 суток). Тесты на общую жизнеспособность показывают, что при концентрации 1 500 мкг/см3 вещество значительно снижает жизнеспособность клеток: митохондриальная активность снизилась до (47,1 ± 1,6) %, общая жизнеспособность - до (47,6 ± 7,3) % после 24 часов экспозиции, до (25,4 ± 3,9) и (37,3 ± 9,5) % соответственно после 48 часов экспозиции [13]. При воздействии нанодисперсного оксида кобальта на культуру клеток ECV-304 и HepG2 наблюдалась массовая интернализация частиц. Через 30 минут инкубации агломераты наночастиц проникали внутрь клеток. Объем наночастиц увеличивался со временем воздействия. Хотя механизм поглощения не исследовался, более вероятно, что наночастицы были усвоены в агломерированной форме. Наночастицы обнаружены в ядрах клеток. Способность индуцировать АФК проверена на тех же культурах клеток. Дозозависимая тенденция наблюдалась в обеих клеточных линиях, хотя HepG2 были менее чувствительны [10, 19]. Цитотоксичность нанодисперсного оксида кобальта проверена на линии легочных эпителиальных клеток человека (BEAS-2B и A549). В клетках А549 не зафиксировано значимых цитотоксических эффектов с точки зрения жизнеспособности клеток и повреждения мембраны. Прямое и окислительное повреждение ДНК зафиксировано только при наивысших концентрациях, повышения образования цитокинов не обнаружено. По данным ряда авторов, в клетках BEAS-2B зафиксировано статистически значимое повышение образования IL-8 при концентрации вещества 20 мкг/см3 и незначительное повышение образования IL-6 при 10 и 40 мкг/см3 после 24-часовой экспозиции. Кроме того, ранее было замечено значительное увеличение TNF-альфа при концентрации 1 мкг/см3. Подтвержден малый цитотоксический эффект для культуры клеток ECV-304 и HepG2. Повышение образования IL-8 также замечено в клетках аорты (HAECs) и пупочной вены человека (HUVECs) [7]. Митоген-стимулированные человеческие первичные лимфо/моноциты, подверженные действию наночастиц кобальта, оказывают влияние на аутофа-гические вакуоли, связанные с изменением клеточного цикла, в частности с пролонгацией G1-фазы, и в случае гемопоэтических клеток-предшественников - с пролонгацией фазы G2/M. Задержка фаз клеточного цикла, вероятно, происходит из-за привязанности репликации ДНК к «контрольно-пропускным пунктам» (checkpoints), что в случае неудачи вызывает мутации и генетические механизмы, способствующие развитию рака [16]. 38 Экология человека 2018.01 Экология труда Частицы нанодисперсного оксида кобальта вызывают нарушение протеомного и метаболомного профиля [5, 16]. В исследовании in vitro на культурах эндотелиальных клеток (HAECs) и (HUVECs) установлено, что наночастицы оксида кобальта повышают антиоксидантный энзим экспрессии генов НО-1 в клетках HAECs на восьмом часу экспонирования, в клетках HUVECs увеличивают экспрессию на протяжении всех 24 часов эксперимента. Повышают образование цитокинов МСР-1 и IL-8 в обеих культурах клеток [5]. Экспериментальные доказательства предполагают, что клетки врожденной иммунной системы реагируют на наночастицы через те же механизмы, что и на болезнетворные патогены. Моноциты/макрофаги крови человека, подвергнувшиеся воздействию микрочастиц кобальта, через активацию TRL-4 активируют сигнальный путь, высвобождающий IL-8 (воспалительный цитокин). Предположительно это ведет к привлечению нейтрофилов, которые могут фагоцитировать и устранять частицы. Аналогичный IL-8 опосредованный механизм может функционировать на эпителиальных клетках различных типов. В лимфо/ моноцитах периферической крови человека нанодисперсный оксид кобальта увеличивает TNF-альфа и выпускает IFN-гамма наряду с ингибированием IL-10 и IL-2. Исследуемое вещество благоприятствует производству TH1 цитокинов периферическими моноцитами, что гипотетически вызывает аутоиммунные заболевания [16]. Наночастицы оксида кобальта поддерживают нейтрофилез, прослеживается увеличение количества макрофагов и лимфоцитов в бронхоальвеолярном смыве, что указывает на продолжающееся воспаление [12]. При контакте с кожей могут вызывать аллергические реакции, при вдыхании могут вызывать приступы бронхиальной астмы, затрудненное дыхание. Длительное воздействие может привести к фиброзу и интерстициальной пневмонии [8, 12, 16, 19]. Соединения кобальта в микроразмерном состоянии относятся к 1 группе и определяются как канцерогенные для человека в соответствии с классификацией Международного агентства по изучению рака (International Agency for Research on Cancer) [8, 17]. Канцерогенное действие наночастиц кобальта обусловлено увеличением уровня внутриклеточного АФК, активацией стресс-индуцированных сигнальных каскадов, повреждением макромолекул - белков и ДНК. Оценка комплекса физико-химических, молекулярно-биологических, цитологических, токсикологических характеристик, ранжирование критериальных признаков опасности и потенциальной опасности нанодисперсного оксида кобальта для здоровья человека показали, что значение «частной» опасности (D) наночастиц оксида кобальта составило 1,86, что соответствует диапазону 1,780-2,449, оцениваемому как «высокая степень потенциальной опасности», с достоверной степенью оценки имеющейся инфор мации (U = 0,092 укладывается в диапазон 0-250, оцениваемый как «оценка достоверна») [3]. Таким образом, нанодисперсный оксид кобальта относится к наноматериалам и используется в процессе производства продукции наноиндустрии, обладает высокой степенью потенциальной опасности. Для обеспечения безопасности персонала, участвующего в процессе производства, и населения, которое контактирует с нанопродукцией, необходимо учитывать высокую степень его потенциальной опасности и разрабатывать своевременные меры, направленные на минимизацию риска и профилактику нарушений здоровья человека. Список литературы

About the authors

M A Zemlyanova

Federal Budget Science Institution "Federal Scientific Center for Medical and Preventive Health Risk Management Technologies"; Federal State Educational Institution of Higher Education "Perm State National Research University"; Federal State Educational Institution of Higher Education "Perm National Research Polytechnic University"

Email: zem@fcrisk.ru

A I Tiunova

Federal State Educational Institution of Higher Education "Perm State National Research University"

M S Stepankov

Federal Budget Science Institution "Federal Scientific Center for Medical and Preventive Health Risk Management Technologies"; Federal State Educational Institution of Higher Education "Perm State National Research University"

A S Ivanova

Federal State Educational Institution of Higher Education "Perm State National Research University"

References

Supplementary files