MORPHOLOGY OF INTRAVASCULAR AUTOROSETTES AT HEALTHY CHILDREN

Full Text

Феномен розеткообразования in vitro впервые был описан J. H. Jandle и A. S. Tomlinson в 1958 году [20]. Это открытие явилось доказательством способности лимфоцитов присоединять к своей поверхности эритроциты, нагруженные антигенным материалом. С помощью этого метода было выявлено, что у здоровых людей В-лимфоциты образуют Fc-розетки (26 %), С3в (комплементарные)-розетки (15 %) и антиглобулиновые розетки (34 %). Дальнейшее интенсивное изучение феномена розеткообразования (in vitro) позволило использовать этот метод для оценки Т- и В-системы иммунитета. В последующем И. В. Петрова и соавторы [15, 17] установили, что к розеткообразованию in vitro способны не только лимфоциты, но и нейтрофилы, ими было показано, что у здоровых людей в крови имеется 25-35 % спонтанных и до 14-20 % комплементарных розеткообразующих нейтрофилов. В 1981 году у больных с послеожого-выми рубцами впервые было отмечено образование спонтанных контактов (in vivo) между лейкоцитами (Л) и эритроцитами в периферической крови [19]. В этот период времени исследования межклеточных взаимодействий в крови были единичными. В 1990 году Д. И. Бельченко было независимо выявлено, что в крови (in vivo) интактных животных [1] наблюдается розеткообразование, а именно в небольших количествах циркулируют клеточные ассоциации, идентичные розеткам, образуемым in vitro иммуноцитами из эритроцитов. Установлено, что в центре клеточной ассоциации находится розеткообразующий Л, с его поверхностью плотно контактируют три и более аутологичных эритроцитов. Такое взаимодействие клеток в крови полу 19 Экология детства Экология человека 2017.06 чило название ауторозеткообразования (АРО) и их единичная ассоциация - ауторозетки (АР). Наиболее часто АР образуют нейтрофилы, реже - моноциты и как единичное явление - эозинофилы и базофилы. Завершается процесс межклеточных взаимодействий в крови лизисом эритроцитов. Предполагается, что через АРО из гемоциркуляции удаляются измененные и поврежденные эритроциты [2, 3]. Установлено, что АРО имеет общебиологическое значение, так как отмечается у животных [1], взрослых людей [4, 10, 11] и детей [5, 7, 11 - 13]. У здоровых лиц его интенсивность незначительная и резко увеличивается под воздействием различных эндогенных и экзогенных факторов [10, 11], в частности, под влиянием заболеваний [4, 5, 7], лекарственных препаратов [11], токсических веществ [4]. В связи с этим представляется важным изучение АРО у практически здоровых подростков под воздействием приземного атмосферного воздуха, содержащего техногенные загрязнители. Цель исследования - оценить морфотип АР в периферической крови у детей, обучающихся в школах, расположенных на территориях с различным индексом загрязнения атмосферы (ИЗА) и в условиях их обычной жизни. Методы Обследованы 613 детей, обучающихся в школах, расположенных в районах с различной экологической обстановкой. Они были разделены на две группы. В первую вошли школьники I-II (Приказ № 621 МЗ РФ от 30.12.2003 г.) группы здоровья (198 детей, мальчиков 93, девочек 105, возраст от 10 до 18 лет) из школ районов относительного экологического благополучия с ИЗА 1,94-1,97 (в среднем 1,96). Вторую группу составили учащиеся I-II группы здоровья (415 детей, мальчиков 203, девочек 212, возраст от 10 до 18 лет), обучающиеся в условиях неблагоприятной экологической обстановки с ИЗА 7,59-5,97 (в среднем 6,78). Основными загрязнителями атмосферного воздуха на пришкольных территориях были продукты выхлопа автомобильного транспорта (оксид углерода, диоксид азота, углеводороды, фенол, ксилол, хлористый водород, бенз(а)пирен, аммиак и формальдегид). Исследование атмосферного воздуха по загрязняющим веществам проводилось химической лабораторией ЗАО «НИТцентр» (аттестат аккредитации № РОСС Ни.0001.21ЭК83 от 28.03.2008 г.) в соответствии с «Методикой определения выбросов автотранспорта для проведения сводных расчетов загрязнения атмосферы городов», утвержденной приказом Госкомэкологии России № 66 от 16 февраля 1999 г. [16] и включенной Минприроды России в «Перечень методик, используемых в 2010 г.». Определение химических веществ осуществлялось согласно «Руководству по контролю загрязнения атмосферы» (РД 52.04.186-89. М., 1991.). Для комплексной гигиенической оценки факторов среды обитания использовались методические рекомендации «Комплексное определение антропотехногенной нагрузки на водные объекты, почву, атмосферный воздух в районах селитебного освоения» (№ 01-19/17-17 от 26.02.1996 г.), разработанные в Федеральном научном центре гигиены им. Ф. Ф. Эрисмана. Рассчитывали единичные ИЗА по отдельным веществам и определяли комплексный ИЗА, равный сумме единичных индексов по всем веществам, по которым велось наблюдение. Увеличение комплексного ИЗА указывало на неблагоприятную экологическую обстановку прилегающей к школе территории. Обследование детей проводилось в рамках плановых диспансерных осмотров согласно Приложению № 1 к «Порядку прохождения несовершеннолетними медицинских осмотров, в том числе при поступлении в образовательные учреждения и в период обучения в них», утвержденному приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации № 1346н от 21 декабря 2012 г., совместно с врачами и педагогами детских учреждений на основе информированного добровольного согласия родителей или законных представителей детей. Тема и порядок проведения научной работы был одобрен этическим комитетом ГБОУ ВПО «Тверская государственная медицинская академия» Минздрава РФ (2012). У всех детей забирали капиллярную кровь в стандартных условиях, в мазках крови (окраска по Романовскому - Гимзе) подсчитывали общее количество АР и АР с лизисом. Определяли общее количество Л (автоматический анализатор MEK-6400J/K фирмы Nihon Kohden, Япония). За АР принимали клеточную ассоциацию, состоящую из Л и плотно прикрепленных к его поверхности трех и более эритроцитов. Оценку мембраны эритроцитов проводили по классификации, предложенной В. Н. O’Conner (1984). К пойкилоцитам относили эритроциты с измененной формой. К обратимо деформированным эритроцитам относили эхиноциты и стоматоциты, к необратимо деформированным - сфероциты, кодоциты, дакриоциты, планоциты. Рассчитывали [8, 15] индекс обратимости (Кидалов В. Н., 1986, Назаров С. Б., 1995): ИО = ОДЭ% / НОДЭ% (соответственно обратимо деформированные эритроциты / необратимо деформированные эритроциты). Использовали бинокулярный микроскоп «Биолам X5Z-H» (фирма «Ломо», Россия). Статистическую обработку проводили с использованием пакета программы StatSoft Statistica versio 6.0, Biostat. Данные представлены в виде М (средней) ± SD (стандартного отклонения). Нормальность распределения оценивали по критерию Шапиро - Уилка. В зависимости от нормальности распределения количественных показателей при их сравнении применяли t-критерий Стъюдента, критерий Вилкоксона. Результаты Полученные результаты показали (таблица), что у детей второй группы, обучающихся в школах, расположенных в районах с высоким ИЗА (6,98), по отношению к первой группе (ИЗА = 1,96) общее число Л не различалось. При этом количество АР (на 100 Л) в периферической крови у них было больше в 3,0 раза (р = 0,001), АР с лизисом - в 3,6 раза (р = 0,001). 20 Экология человека 2017.06 Экология детства Содержание общего числа лейкоцитов (х109/л), ауторозеток и ауторозеток с лизисом (х109, на 100 лейкоцитов и %) у школьников, обучающихся в школах, расположенных на территориях с различным индексом загрязнения атмосферы (М ± SD) Показатель 1-я группа (n=198) 2-я группа (n=415) Индекс загрязнения атмосферы 1,96 6,98 Лейкоциты (абс.) 7,68±0,67 7,8±0,75 Общее число ауторозеток (абс.) - на 100 Л 0,288±0,9 3,7±1,7 0,872±0,89 11,4±6,7 * Ауторозетки с лизисом (абс.) - на 100 Л - % от общего числа АР 0,117±0,09 1,5±0,9 40,5% 0,421±0,12* 5,4±1,8* 47,4% Примечания: * - статистически значимое различие между 1-й и 2-й группой, Л - лейкоциты, абс. - абсолютное число. Морфотип образованных АР зависел от характера розеткообразующей клетки. Во всех случаях преобладали ауторозетки, образованные нейтрофилами (НАР), реже отмечались образованные моноцитами, еще реже - эозинофилами, во второй группе наблюдались единичные базофилы. Помимо лейкоцитарных АР были выявлены тромбоцитарные агрегаты. В первой группе школьников содержание нейтрофильных ауторозеток (НАР) составило 73 % от общего числа АР, моноцитарных (МАР) - 9,3 %, эозинофильных (ЭАР) - 0,7 %, тромбоцитарных агрегатов (ТАГ) - 17,0 %. Во второй группе содержание НАР было 61.4 %, МАР - 10 %, ЭАР - 1,2 %, базофильных (БАР) - 0,18 %, ТАГ - 27,22 %. Установлено, что во второй группе обследованных, несмотря на статистически значимое увеличение общего числа АР, процентное содержание каждого морфотипа АР от их общего количества не различалось, однако наблюдалась тенденция к уменьшению числа НАР за счет увеличения числа МАР (на 0,7 %), ЭАР (на 0,5 %), ТАГ (на 10,22 %) и появления БАР (0,18 %). Содержание АР с лизисом в первой и второй группе составило соответственно 40.5 и 47,4 % от общего числа АР. Как показано на рис. 1, 2, 3, розеткообразующие клетки плотно контактируют с аутологичными эритроцитами, их клеточная ассоциация имеет розеткообразный вид. В среднем к поверхности Л (см. рис. 1, 2, 3) присоединяется 4-5 эритроцитов, все с измененной формой. Как видно на рис. 1, к поверхности розеткообразующего нейтрофила прикреплено 5 эритроцитов: один из них сфероцит, второй - эхи-ноцит, три других - пойкилоциты. В образованных АР (см. рис. 1, 2) наблюдается лизис эритроцитов, вокруг них в большом количестве располагаются измененные эритроциты (пойкилоциты). У школьников второй группы по отношению к первой было увеличено число пойкилоцитов на 20,4 % (35,0 % против 14,6; р = 0,001). У них было больше количество эритроцитов (на 12,0 %) с обратимыми формами (18,5 % против 6,5 в первой группе; р = 0,001) и необратимыми формами (на 5,3 %; 12,4 против 4,1 %; р = 0,003), при этом индекс обратимости составил 1,49 ед. против 1,59 ед. Рис. 1. Микрофото. Нейтрофильная ауторозетка с лизисом эритроцитов (указан стрелкой). Окраска по Романовскому - Гимзе. Ув. X 100 Рис. 2. Микрофото. Нейтрофильная ауторозетка с лизисом эритроцитов (указан стрелкой). Окраска по Романовскому - Гимзе. Ув. X 100 Рис. 3. Микрофото. Моноцитарная ауторозетка без лизиса эритроцитов. Окраска по Романовскому - Гимзе. Ув. х 100 Розеткообразующие Л имели нормальную форму и размеры. При детальном рассмотрении у некоторых розеткообразующих Л наблюдалось увеличение, раз-рыхленность, фрагментация, фестончатость ядер и пикноз, у отдельных моноцитов обнаруживалось ядро неправильной формы с децентрализацией (см. рис. 3). В среднем ядро у розеткообразующих нейтрофилов было сегментировано на 4-5 фрагментов, но отмечались клетки с количеством сегментов 2-3 (см. рис. 1) и более 6. В их цитоплазме в местах плотного контакта 21 Экология детства Экология человека 2017.06 с эритроцитами наблюдалось большое количество гранул, а в местах уже проходящего лизиса выявляли разрушение мембраны эритроцитов и вакуолизацию цитоплазмы (см. рис. 1, 2). Чаще лизис наблюдался в АР, образованных нейтрофилами. Розеткообразующие тромбоциты организовывали мелкие, средние и крупные агрегаты, а также осуществляли лизис прикрепленных эритроцитов. Обсуждение результатов Представленные результаты показали, что с повышением содержания техногенных загрязнителей в атмосферном воздухе на территории школ у практически здоровых детей отмечается изменение межклеточных соотношений в периферической крови. Резкое увеличение общего числа АР и АР с лизисом наблюдается параллельно нарастанию в гемоциркуляции количества модифицированных эритроцитов. Можно полагать, что техногенные загрязнители атмосферного воздуха, проникая в организм ингаляционным путем, при резорбции в крови вызывают повреждение мембран эритроцитов, при этом последние распознаются Л ксеногенными и удаляются из циркуляции. Известно, что Л могут функционировать не только как фагоциты, но и как секреторная клетка [18], выделяющая биологически активные вещества путем экзоцитоза. В цитоплазме розеткообразующих Л обнаруживается большое количество гранул, расположенных близко к поверхности клетки в местах плотного контакта с мембраной эритроцита, где наблюдается лизис. В основном лизис эритроцитов осуществляют нейтрофилы и тромбоциты. Ранее было доказано, что гранулоциты и моноциты, а также тромбоциты [6] могут разрушать клетки-мишени, покрытые IgG, то есть осуществлять реакции антителозависимой цитотоксичности. Цитолизу в этом случае предшествует агрегация и активация клеток-эффекторов вокруг мишени (образование розеток). Можно полагать, что повышение числа АР с лизисом свидетельствует о возрастании цитолитической активности [14] розеткообразующих клеток и усилении эритродиереза. Вероятно, пусковым моментом активации розеткообразующих клеток в крови является наличие в циркуляции большого количества модифицированных эритроцитов. Морфотип и структура образованных АР в крови всех обследованных лиц не отличались, за исключением БАР, которые были обнаружены только во второй группе. Во всех случаях нейтрофильных АР было достоверно больше, чем моноцитарных, эозинофильных и агрегатов, образованных тромбоцитами. Размеры образованных АР (см. рис. 1, 2, 3) превосходили размеры единичных клеток [9], и предполагается, что нарастание количества первых в гемоциркуляции способствует нарушению микроциркуляции. Таким образом, под воздействием техногенных загрязнителей у практически здоровых школьников отмечается статистически значимое увеличение количества трансформированных эритроцитов и нарастание числа АР в периферической крови. Морфотип АР зависит от характера розеткообра зующей клетки, наиболее часто отмечаются НАР и тромбоцитарные агрегаты. Можно полагать, что загрязненный атмосферный воздух является фактором риска для здоровья детей и подростков, увеличение при этом лейкоцитарных АР в крови и появление тромбоцитарных агрегатов с лизисом указывает на неблагополучие в их организме. Повышение частоты АРО в периферической крови можно рассматривать дополнительным биологическим маркером увеличения в гемоциркуляции модифицированных эритроцитов.

About the authors

L N Korichkina

Tver State Medical Academy Tver, Russia

A V Yesipova

Email: leks.maksimov@yandex.ru
Clinical children's hospital № 2 Tver, Russia

I A Zhmakin

Tver State Medical Academy Tver, Russia

References

Supplementary files