ANTIBODIES, SPECIFIC TO BENZO[A]PYRENE AND ESTRADIOL, IN HEALTHY MEN AND LUNG CANCER PATIENTS

Full Text

Согласно классической теории химического канцерогенеза процесс возникновения злокачественных опухолей включает в себя две фазы: инициации и промоции [4]. Самыми распространёнными инициаторами являются полициклические ароматические углеводороды, в частности бензо[а]пирен (БП). Одним из наиболее изученных эндогенных промоторов является эстрадиол (ЭС). Многочисленные эксперименты по иммунизации животных конъюгатами химических канцерогенов и ЭС с белками показали следующее. Образование гаптен-специфических антител (АТ) сопровождалось угнетением транспорта канцерогенов из окружающей среды в кровь, изменениями распределения канцерогенов по органам и тканям, уменьшением количества аддуктов канцерогенов с ДНК, торможением воз 42 Экология человека 2017.05 Медицинская экология никновения и роста индуцированных опухолей [8, 10, 14, 15, 17, 19], а также изменениями содержания в крови стероидных гормонов [5, 9] и угнетением роста ЭС-зависимых опухолей [6]. Защитным действием обладали секреторные АТ, препятствующие проникновению канцерогенов в эпителиальные клетки, но не сывороточные АТ, способные усиливать транспорт канцерогенов из окружающей среды через эпителий [10, 12, 19]. Поэтому в качестве стратегии иммунопрофилактики рака авторы предлагают индуцировать синтез именно секреторных АТ [7, 11, 20]. Поскольку источником секреторных АТ являются сывороточные АТ класса А (IgA), но не класса G (IgG), для дальнейшего развития предлагаемой стратегии целесообразно исследовать раздельные и совместные эффекты IgA и IgG, специфичных к наиболее распространённым экзогенным инициаторам и эндогенным промоторам канцерогенеза, на риски возникновения злокачественных опухолей у человека. На основе результатов экспериментальных исследований, приведенных выше, можно предположить, что АТ против химических канцерогенов и ЭС, образующиеся у человека, обладают защитным антиканцерогенным действием, и при низком их содержании в сыворотке крови риск возникновения злокачественных опухолей должен возрастать. Однако в действительности у больных раком лёгкого (РЛ) и членов их семей обнаружены повышенные уровни АТ к БП и аддуктам БП-диолэпоксида с ДНК [2, 16], а также АТ к ЭС [3]. Это косвенно свидетельствует о том, что в естественных условиях у человека указанные АТ могут обладать проканцерогенным действием, а повышение их уровней может служить маркером онкологического риска. Настоящая работа является продолжением ранее проведенных исследований с целью выявить особенности образования АТ классов А и G, специфичных к БП и ЭС, у больных РЛ с учётом возможных индивидуальных комбинаций их содержания в сыворотке крови. Методы В настоящем аналитическом исследовании типа «случай - контроль» приняли участие 652 мужчины, проживающие на территории Кемеровской области. В исследуемую группу были включены 380 мужчин с установленным диагнозом немелкоклеточный рак лёгкого (НМРЛ), которые поступили на лечение в Областной клинический онкологический диспансер г. Кемерово. Диагноз НМРЛ в каждом случае подтвержден морфологически, рентгенологически и эндоскопически. У большинства больных диагностировали плоскоклеточную форму (63,4 %), аденокарцинома выявлена у 22,4 %, крупноклеточный рак - у 6,0 %, и на долю всех остальных типов пришлось 8,2 %. Среди мужчин исследуемой группы было 326 (85,8 %) курящих и 54 (14,2 %) некурящих. В группу сравнения включили 272 здоровых до норов из Кемеровского центра крови, не имеющих злокачественных новообразований легких и других заболеваний дыхательных путей. Среди них 124 (45,6 %) курящих и 148 (54,4 %) некурящих. Все обследуемые мужчины были старше 40 лет. Забор периферической крови осуществлялся согласно этическим стандартам в соответствии с Хельсинкской декларацией 1975 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ № 266 от 19.06.2003 г. Все лица, участвовавшие в исследовании, дали информированное письменное согласие на участие в нем. Антитела классов A и G к БП и ЭС исследовали с помощью неконкурентного иммуноферментного анализа в собственной модификации [2]. В качестве адсорбированных антигенов использовали конъюгаты БП и ЭС с бычьим сывороточным альбумином (БСА). Класс связавшихся АТ определяли с помощью козьих АТ против иммуноглобулинов А и G человека, меченных пероксидазой хрена (Novex, США). Уровни АТ к БП, ЭС выражали в относительных единицах и вычисляли по формуле: IgA(G)-X = ^Мса^бСа№бса, где Х = БП, ЭС; ODx бСа - связывание АТ с конъюгатом гаптен-БСА, OD^A - связывание с БСА. Уровень АТ показывает, во сколько раз связывание АТ с гаптеном превышает фоновое связывание с белком-носителем. Статистическую обработку результатов проводили с использованием Statistica 6.0 (StatSoft Inc., USA). Ненормальный характер распределения показателей был выявлен с помощью критерия Шапиро - Уилка, и в дальнейшем различия в исследуемых группах оценивали с помощью U-критерия Манна - Уитни и непараметрического критерия х2 с поправкой Йейтса на непрерывность вариации. При расчете критерия х2 исследуемые признаки группировались в четырехпольную таблицу (d.f. = 1). Количественные признаки представлены в виде медианы (Ме) и ин-терквартильного размаха (25-й и 75-й процентили). За критический уровень значимости принималось значение p < 0,05. Ассоциации исследуемых АТ с РЛ оценивали с помощью величины отношения шансов (OR) с доверительным интервалом (CI) при 95 % уровне значимости. Для выявления пороговых значений уровней АТ (cut-off) был проведен ROC-анализ [13]. Результаты По содержанию в сыворотке крови IgA- и IgG-АТ, специфичных к БП и ЭС, не было статистически значимых различий между курящими и некурящими как здоровыми мужчинами, так и больными НМРЛ (табл. 1 ). Количество исследуемых АТ у курящих мужчин незначительно превышает таковое у некурящих, как у больных НМРЛ, так и в группе сравне 43 Медицинская экология Экология человека 2017.05 ния. Однако эти различия статистически не значимы (р > 0,05). Между больными плоскоклеточным РЛ, крупноклеточным РЛ и аденокарциномой легкого статистически значимых различий также не обнаружено (табл. 2). Таблица 1 Медианы (Me) уровней IgA и IgG к бензо[а]пирену и эстрадиолу у здоровых мужчин и больных немелкоклеточным раком легкого, Me (Q25-Q75) Здоровые мужчины (п = 272) Больные НМРЛ (п = 380) АТ Некурящие (п = 148) Курящие (п = 124) Р Некурящие (п = 54) Курящие (п = 326) Р IgA-БП 2,2 (1,7-3,55) 2,4 (1,5-3,2) 0,81 2,8 (1,7-4,1) ,7) 31 (2, 0,06 IgA-ЭС 2,0 (1,2-3,3) 2,1 (1,3-3,5) 0,78 2,6 (1,4-4,4) 3,2 (1,9-5,0) 0,09 IgG-БП (о Ю (JD & 1 3 ,3 (2, 4,1 (2,6-6,4) 0,75 5,7 (3,0-9,2) 6,4 (3,7-10,5) 0,17 IgG-ЭС 4,6 (2,9-7,3) 4,7 (2,8-7,7) 0,88 6,8 (3,2-8,7) 6,4 (3,9-10,3) 0,57 Таблица 2 Медианы (Me) уровней IgA и IgG к бензо[а]пирену и эстрадиолу у больных немелкоклеточным раком легкого разных гистологических форм, Me (Q25 Q75) АТ 1. Плоскоклеточный РЛ (п = 241) 2. Аденокарцинома (п = 85) о-й ) н ы 3 Е* - CS 11 .ч е coS ^ P1-2 P1-3 P 2-3 IgA-БП ,8) 3,3 -5, 31 (2, 2,9 (1,7-5,2) 4,1 (1,4-6,7) 0,27 0,75 0,38 IgA-ЭС 3,2 (1,8-4,7) 3,0 (1,9-4,7) 2,9 (2,5-5,1) 0,99 0,84 0,58 IgG-БП 6,4 (3,6-11,0) 5,7 (3,6-9,1) 6,1 (2,2-9,7) 0,29 0,70 0,83 IgG-ЭС 6,4 (3,9-10,6) 6,5 (3,8-9,7) 5,8 (2,5-8,7) 0,99 0,45 0,46 С помощью ROC-анализа рассчитали пограничные значения уровней исследуемых АТ, по которым здоровые мужчины и больные НМРЛ имели наиболее значимые различия. Таковыми оказались: IgA-БП = 3, IgA-ЭС = 3, IgG-БП = 5, IgG-ЭС = 6. При математическом анализе двух факторов (в нашем случае АТ двух классов) с двумя количественными показателями (низкие и высокие уровни АТ) для АТ, специфичных к БП и ЭС, выделили по четыре возможные комбинации. В табл. 3 приведены результаты сравнения здоровых доноров с больными НМРЛ по частоте обнаружения комбинаций IgA и IgG, специфичных отдельно к БП и к ЭС. Отсутствие или низкие уровни IgA и IgG к БП (комбинация 1.1) у больных НМРЛ выявлялись значимо реже (24,2 %), чем у здоровых (44,9 %, х2 = 29,7, р < 0,001). В сравнении со всеми остальными случаями (при наличии высокого содержания IgA и/ или IgG к БП) показатель OR снижался до 0,4 с доверительным интервалом (95 % CI), равным 0,3-0,5. Высокие уровни АТ только одного класса (IgA или IgG) в отсутствие или низких уровнях АТ другого клас- Таблица 3 Количество (п) и частота встречаемости (%) комбинаций низких (<) и высоких (>) уровней исследуемых антител с учетом изотипа у здоровых мужчин и больных немелкоклеточным раком легкого, п/% Комбинация антител Здоровые мужчины (п = 272) Больные НМРЛ (п = 380) х2 (Р) OR (95%CI) 1.1. ^А-БП<3 IgG-БП^ 122/44,9 92/24,2 29,7 (<0,001) 0,4 (0,3-0,5) 1.2. ^А-БП>3 IgG-БП^ 45/16,5 54/14,2 3,2 (0,07) 1,6 (0,9-2,6) 1.3. ^А-БП<3 IgG-БП^ 61/22,4 82/21,6 6,5 (0,01) 1,8 (1,2-2,7) 1.4. ^А-БП>3 IgG-БП^ 44/16,2 152/40,0 49,3 (<0,001) 4,8 (2,9-7,0) 2.1. ^А-ЭС<3 IgG-ЭС^ 135/49,6 111/29,2 27,3 (<0,001) 0,4 (0,3-0,6) 2.2. ^А-ЭС>3 IgG-ЭС^ 43/15,8 63/16,6 5,5 (0,02) ,8) 0° 7 2.3. ^А-ЭС<3 IgG-ЭС^ 55/20,2 72/18,9 4,04 (0,04) 1,6 (1,0-2,5) 2.4. ^А-ЭС>3 IgG-ЭС^ 39/14,3 134/35,3 42,4 (<0,001) 4,2 (2,7-6,5) са (комбинации 1.2 и 1.3) выявляли в обеих группах с одинаковой частотой. По сравнению с комбинацией 1.1 OR возрастал до 1,8 с доверительным интервалом 1,2-2,7 при наличии только IgG-БП (х2 = 6,5, р = 0,01) и до 1,6 с доверительным интервалом 0,9-2,6 при наличии только IgA-БП (х2 = 3,2, р = 0,07). Одновременное повышение содержания и IgA, и IgG, специфичных к БП (комбинация 1.4), у больных НМРЛ (40,0 %) встречалось значительно чаще, чем у здоровых (16,2 %). В сравнении с комбинацией 1.1 OR возрастал до 4,8 с доверительным интервалом 2,9-7,0 (х2 = 49,2, р < 0,001). Таким образом, показатель OR при одновременном повышении уровней IgA и IgG к БП статистически значимо превышал таковые при возрастании уровней только ^А-БП или только IgG-БП. Аналогичные результаты получены при анализе АТЭС. Отсутствие или низкое содержание в сыворотке АТ обоих классов у больных НМРЛ (комбинация 2.1) наблюдалось значительно реже, чем у здоровых, со снижением OR до 0,4. Высокие уровни и IgA, и IgG, специфичных к ЭС (комбинация 2.4), имели место у больных НМРЛ чаще, чем у здоровых. При этом OR возрастал до 4,2 с 95 % CI = 2,7-6,5. Эти значения были значимо выше, чем при наличии только IgA или только IgG, специфичных к ЭС. В табл. 4 приведены результаты аналогичного анализа АТ с учётом и класса, и специфичности. Отсутствие или низкие уровни IgA и IgG, специфичных к БП и к ЭС (комбинация 1), у больных НМРЛ встречались значимо реже, чем у здоровых, со снижением ОR до 0,3. Высокое содержание IgA и IgG к БП и ЭС (комбинация 4) обнаружено значимо чаще у больных НМРЛ. OR при этом возрастал до 7.1 с CI = 4,1-12,6 и был значимо больше, чем при наличии только IgA или только IgG к БП и ЭС (комбинации 2 и 3). 44 Экология человека 2017.05 Медицинская экология Таблица 4 Количество (n) и частота встречаемости (%) комбинаций низких (<) и высоких (>) уровней исследуемых антител с учетом изотипа и специфичности у здоровых мужчин и больных немелкоклеточным раком легкого, n/% Комбинация антител Здоровые мужчины (n = 272) Больные НМРЛ (n = 380) (Р) OR (95%CI) 1. ^А-БП<3 ^А-ЭС<3 ^0-БП<5 IgG^C<6 93/34,2 58/15,3 30,9 (<0,001) 0,3 (0,2 - 0,5) 2. ^А-БП>3 ^А-ЭС>3 IgG-BO<5 IgG^C<6 21/7,7 28/7,4 4,6 (0,03) 2,1 (1,1 4,1) 3. ^А-БП<3 ^А-ЭС <3 IgG-БП^ IgG^C>6 35/12,9 43/11,3 5,2 (0,02) ,4) “ I 4. ^А-БП>3 ^А-ЭС>3 IgG-БП^ IgG^C>6 22/8,1 98/25,8 49,5 (<0,001) 7,1 (4,1-12,6) Обсуждение результатов В настоящем исследовании не выявлено различий по содержанию IgA- и IgG-АТ, специфичных к БП и ЭС, между курящими и некурящими здоровыми мужчинами и больными НМРЛ (р > 0,05). Ранее аналогичный результат получен при анализе АТ, специфичных к аддуктам БП-диолэпоксида с ДНК, - различия между показателями рабочих коксохимического производства при значительной канцерогенной нагрузке полициклическими ароматическими углеводородами и контрольной группой отсутствовали [18]. Очевидно, что повышение количества АТ к химическим канцерогенам зависит не столько от содержания последних в окружающей среде, сколько от индивидуальных особенностей иммунной реакции каждого человека даже на минимальные их количества. Иными словами, уровень АТ зависит не столько от интенсивности экзогенной канцерогенной нагрузки, сколько от иных, эндогенных факторов. Это предположение согласуется с мнением других авторов [18], которые не обнаружили взаимосвязи между количеством аддуктов БП с ДНК и количеством соответствующих АТ. Кроме того, не обнаружено каких-либо ассоциаций АТ к БП и ЭС с различными гистологическими формами НМРЛ (p > 0,05). Это свидетельствует о возможном участии исследуемых АТ в злокачественной трансформации и плоскоклеточного, и железистого эпителия бронхов. В модельных экспериментах in vitro искусственно полученные моноклональные АТ, имитирующие действие секреторных АТ in vivo, препятствовали проникновению химических канцерогенов через полупроницаемую мембрану и в/через монослой эпителиальных клеток [10, 19]. Напротив, моноклональные АТ, имитирующие действие сывороточных АТ in vivo, усиливали транспорт химических канцерогенов через полупроницаемую мембрану в/через монослой эпителиальных клеток. В последнем случае в клетках повышалось содержание генотоксичных метаболитов химических канцерогенов. Коль скоро in vivo источником секреторных АТ являются сывороточные IgA, можно было бы предполагать, что содержание потенциально защитных сывороточных IgA, специфичных к экзогенным канцерогенным факторам (БП и фитоэстрогенам), у здоровых людей должно быть больше, чем у больных раком. Однако в нашем исследовании установлено, что высокие уровни IgA-БП и IgA-ЭС отмечаются, наоборот, у больных НМРЛ. Одновременное повышение уровней IgG-БП и ^А-ЭС при РЛ наблюдается еще чаще, чем у здоровых доноров. Одновременное повышение уровней IgA и IgG, специфичных к указанным соединениям, отмечается в значительно большем числе случаев у больных НМРЛ. Ранее выявлены прямые взаимосвязи уровней IgA и IgG к БП и ЭС у здоровых доноров и у больных РЛ [2]. Это даёт основание предполагать, что стимуляция секреторного иммунного ответа против экзогенных химических канцерогенов с большой вероятностью может привести к повышению уровней сывороточных IgA одновременно с IgG, специфичных и к канцерогенам, и к ЭС, и тем самым повышать риск возникновения РЛ. Таким образом, к развитию стратегии иммунопрофилактики рака путём активной иммунизации человека против химических канцерогенов следует относиться с особой осторожностью. В качестве альтернативной стратегии целесообразно рассмотреть возможности разработки пассивной иммунологической защиты путём применения генетически модифицированных микроорганизмов естественной микрофлоры человека и пищевых продуктов, экспрессирующих АТ человека против наиболее распространённых химических канцерогенов [1]. Выводы 1. Повышение содержания в сыворотке крови IgA или IgG, специфичных к БП и ЭС, ассоциировано с умеренным возрастанием риска возникновения РЛ у мужчин. 2. Более значимые ассоциации с РЛ обнаружены при одновременном повышении уровней IgA и IgG, специфичных к БП и ЭС. 3. Одновременный анализ IgA и IgG, специфичных к БП и ЭС, рекомендуется для исследования индивидуальных рисков возникновения РЛ в условиях воздействия химических канцерогенов группы по-лициклических ароматических углеводородов.

About the authors

A N Glushkov

The Federal Research Center of Coal and Coal Chemistry of Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Institute of Human Ecology; Kemerovo State University

Institute of Human Ecology Kemerovo

E G Polenok

The Federal Research Center of Coal and Coal Chemistry of Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: egpolenok@mail.ru
Institute of Human Ecology Kemerovo

M V Kostyanko

The Federal Research Center of Coal and Coal Chemistry of Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; Kemerovo State University

Institute of Human Ecology Kemerovo

V A Titov

Regional clinical oncology hospital

Kemerovo

I A Vafin

Regional center of blood

Kemerovo

S E Ragozhina

Regional center of blood

Kemerovo

References

Supplementary files