PRESENT ALTERNATIVE STUDY METHODS USED IN PRODUCT SAFETY ASSESSMENT

Full Text

Для комплексной оценки безопасности продукции пищевого и непищевого назначения необходимо выполнение токсикологических исследований. Недостатками методов in vivo являются большие материальные затраты, длительность эксперимента, также использование млекопитающих затруднено с этической точки зрения. В связи с этим в последние десятилетия интенсивно ведутся поиски новых биологических тест-объектов, которые были бы способны достоверно отражать воздействие различных токсикантов на организм человека. Вместе с тем исследования на животных остаются необходимым звеном при установлении токсичности, т. к. только in vivo можно выявить весь объем прямых и опосредованных эффектов, нарушающих физиологические механизмы, что позволяет экстраполировать получаемые данные на человека и другие виды животных. Поиск методов ускоренной регламентации химических факторов окружающей среды относится к важнейшим прикладным задачам нашего времени. Большую актуальность в связи с 21 Экологическая безопасность Экология человека 2017.03 этим приобретает разработка методологических и теоретических вопросов применения при токсикологических исследованиях биологических тест-объектов (культур клеток, микроорганизмов, простейших и т. д.), которые позволяют, как правило, в короткие сроки получить ценную информацию о биологическом действии веществ [1, 16-19]. Большое значение имеет применение альтернативных методов при исследовании парфюмерно-косметической продукции, так как 1! марта 2013 года в странах Европейского союза (ЕС) вступил в силу запрет на тестирование косметических продуктов и ее ингредиентов на животных. Следствием этого стал запрет продажи косметической продукции, протестированной на животных, как произведенной на территории ЕС, так и ввозимой на эту территорию. С 1 июля 2012 года вступил в силу Технический регламент Таможенного союза «О безопасности парфюмерно-косметической продукции» 009/201!, в котором законодательно закреплена возможность оценки безопасности продукции по токсикологическим показателям с использованием не только лабораторных животных, но и с применением методов in vitro как альтернатива исследованиям на лабораторных животных [21]. Таким образом, наряду с традиционными методами контроля для оценки безопасности продукции применяются различные альтернативные токсикологические методы исследования с использованием биологических тест-объектов, так называемые методы биологического тестирования или методы in vitro. Альтернативные токсикологические методы исследования основаны на оценке степени опасности исследуемого объекта по реакции живых организмов (тест-объектов) на воздействие вредного фактора, а информация, получаемая при использовании методов биотестирования, отражает комплексное токсическое воздействие всех содержащихся в данной среде токсикантов, их совместного присутствия. Полученные результаты анализируются и обобщаются с помощью таблиц, графиков, формул, на основе которых можно делать заключение о степени токсичности исследуемых сред [1, 17]. Для оценки безопасности продукции непищевого назначения по токсикологическим показателям с использованием альтернативных биологических моделей исследованию подлежат общетоксическое и раздражающее действие, а тест-объектами служат сперма крупного рогатого скота, люминесцентные бактерии, хориоаллантоисная мембрана развивающегося куриного эмбриона, культуры клеток и изолированные органы (рисунок). С использованием данных тест-объектов проводят исследования полимерных материалов, резин, химических веществ и различных изделий из них, товаров бытовой химии, парфюмернокосметической продукции, изделий, контактирующих с пищевыми продуктами, текстильных материалов, одежды, строительных и отделочных материалов [21-23]. Для скрининговой оценки парфюмернокосметической продукции, определения ее общетоксических свойств наиболее часто применяются методы исследования с использованием в качестве тест-объекта спермы крупного рогатого скота и люминесцентных бактерий [2, 8, 12]. Токсикологические методы исследования in vitro используются и для оценки токсичности алкогольной продукции, в частности спиртов и водок, в данном случае исследуется острая токсичность с применением в качестве тест-объектов спермы крупного рогатого скота и люминесцентных бактерий [5, 7, 11]. Сперма быка в гранулах - стандартный, доступный и дешевый биологический материал, который используется в токсикологических исследованиях для определения индекса токсичности товаров народного потребления. Замороженные клетки спермы в гранулах хранятся в жидком азоте в сосудах Дьюара при температуре -196 °С, что обеспечивает неограниченный срок хранения. Оценка цитотоксичности осуществляется с использованием аттестованных методик оценки токсичности разнообразных сред на Альтернативные биологические модели, используемые для оценки безопасности продукции 22 Экология человека 2017.03 Экологическая безопасность анализаторе токсичности, который сертифицирован и внесен в реестр средств измерений. Критерием токсического действия является изменение двигательной активности сперматозоидов под воздействием токсиканта. Принцип работы анализатора основан на автоматическом компьютерном анализе микроскопических видеоизображений суспензии сперматозоидов. Как правило, индекс токсичности менее 70 и более 120 % свидетельствует о цитотоксичности вытяжки [2, 3, 12]. Методы люминесцентного бактериального теста широко распространены во многих странах в качестве первичного быстрого лабораторного теста на токсичность и безопасность проб воды и водных вытяжек из различных объектов. Люминесцентные бактерии (препараты лиофилизированных люминесцентных бактерий, ферментных препаратов бактериальной люциферазы) используются для определения индекса токсичности. В России в качестве тест-объекта используются препараты лиофилизированных люминесцентных бактерий или ферментные системы из этих бактерий серии «Эколюм». Токсическое действие исследуемой пробы на тест-объект определяется по уменьшению интенсивности биолюминесценции (интенсивного свечения в видимой области спектра, отражающего специфическую ферментативную функцию и общую метаболическую активность организмов) за определенный период экспозиции. Уменьшение интенсивности биолюминесценции пропорционально токсическому эффекту. Данный метод можно использовать для быстрого определения общих токсикологических характеристик образца, мониторинга в режиме реального времени [9-11]. При исследовании различных видов продукции и веществ оценку раздражающего действия на конъюнктиву глаз возможно провести с использованием НЕТ-САМ-теста - метода, основанного на оценке воздействия вещества на хориоаллантоисную мембрану развивающегося куриного эмбриона в течение определенного времени после начала тестирования по появлению гиперемии, геморрагии, тромбоза, разрушения сосудов и денатурации белков. Согласно методикам выполнения измерений оценка раздражающего действия осуществляется визуально или с использованием метода ультразвуковой допплерографии на сосудах. Этот тест хорошо зарекомендовал себя и используется для скрининговой оценки возможного раздражающего действия исследуемых продуктов на конъюнктиву глаза с целью исключения тестирования на лабораторных животных продуктов с выраженными раздражающими свойствами [4, 15]. Для оценки раздражающего действия веществ на конъюнктиву глаза также используют изолированные органы животных (например, глазные яблоки, полученные с бойни от животных, умерщвленных для других целей - например, на мясо). Тестируемое вещество наносится на роговицу, и через определенное время оценивается его действие по помутнению и проницаемости роговицы, изменению ее толщины и нарушению клеточных структур. В данных целях часто используется изолированная роговица крупного рогатого скота. Использование культуры клеток человека и животных позволяет оценить общетоксическое действие различных веществ и готовой продукции, которое определяется по выявлению цитотоксического действия, повреждению или гибели клеток или отсутствию таковых после обработки их исследуемым веществом (например, для этих целей используют фибробласты из эмбрионального кожно-мышечного лоскута) [6, 14]. Таким образом, токсикологические исследования необходимы для комплексной оценки качества и безопасности разнообразной продукции. Альтернативой исследованиям на животных являются методы биотестирования или методы in vitro. Исследования с использованием млекопитающих длительны по времени, затруднены с этической точки зрения и требуют больших материальных затрат. Методы in vitro более экспрессны (время выполнения одного исследования некоторых из них может составлять 30 мин и меньше), относительно дешевы и просты в исполнении, проводятся с использованием различных тест-объектов, а методики выполнения исследований позволяют анализировать самую разнообразную продукцию. Кроме того, информация, получаемая при использовании методов биотестирования, отражает комплексное токсическое воздействие всех содержащихся в данной среде токсикантов, их совместного присутствия. Поэтому в настоящее время альтернативные методы исследования широко распространены и используются в практической деятельности для подтверждения безопасности товаров народного потребления и спиртсодержащей продукции, используемой в пищевых целях.

About the authors

E V Zaritskaya

North-West Public Health Research Center

Email: zev-79@mail.ru; ilc@s-znc.ru

E V Polozova

North-West Public Health Research Center; North-Western State Medical University named after I. I. Mechnikov

V V Shilov

North-West Public Health Research Center; North-Western State Medical University named after I. I. Mechnikov

A S Bogacheva

North-West Public Health Research Center; North-Western State Medical University named after I. I. Mechnikov

References

Supplementary files