ASSOCIATION OF POLYMORPHIC LOCI HSP1A GENES WITH THE DEVELOPMENT OF CHRONIC MERCURY INTOXICATION

Full Text

Элементарная ртуть является естественным металлом (Hg0), который используется в химической промышленности, применяется при изготовлении электротехнического и измерительного оборудования, электрических ламп. Токсическое воздействие паров металлической ртути на человека сопровождается нежелательными эффектами со стороны многих систем и органов, включая центральную нервную систему. Преимущественным путем поступления в организм Hg0 является ингаляционный, а основным источником для профессионально экспонированных когорт - несовершенные производственные технологии. Поступая через легкие, липофильная Hg0 растворяется в крови и легко преодолевает гемоэнцефалический барьер, вступает в реакцию с органическими соединениями, задерживаясь в мозгу значительное время [6]. При этом воздействие Hg0 сопровождается широким спектром когнитивных, личностных, сенсорных и двигательных нарушений [4, 6, 14]. По мнению О. Л. Лахмана и соавт. [2], патофизиологические механизмы формирования и прогрессирования тяжелого органического поражения головного мозга у больных в отдаленном периоде хронической ртутной интоксикации (ХРИ) недостаточно изучены. У таких пациентов регистрируются статистически значимые очаги субатрофии мозжечка (методом ЯМР-томографии), что расценивается как признак нейродегенеративных процессов. Данный факт определяет интерес к белкам теплового шока (HSPs), поскольку известна их цитопротекторная роль при различных нейродегенеративных заболеваниях [12]. В частности, белки семейства HSP70 (HSPA1) кооперируются с некоторыми другими шаперонами при фолдинге поврежденных или вновь синтезиро 10 Экология человека 2016.09 Экология труда ванных белков, осуществляют конформационную регуляцию сигнальных белков, являясь ключевым компонентом поддержания клеточного гомеостаза [7, 13]. Попадая в организм, ртуть вызывает индукцию синтеза и увеличение содержания HSP70 в крови и органах-мишенях, а ее поступление в головной мозг сопровождается накоплением аберрантных белков [5]. В литературе отсутствуют сведения, указывающие на развитие нейродегенеративных заболеваний у экспонированных ртутью лиц, за исключением сообщения о редком случае развития синдрома Паркинсона у пациента, который в течение длительного времени подвергался профессиональному воздействию паров Hg0 [9]. Имеются данные о значимом повышении частот -110 CC и +190 СС генотипов HSP1A1 у пациентов с синдромом Паркинсона относительно контроля [15]. В последнее время актуальны исследования ассоциаций полиморфных вариантов генов HSP70 с продуктами экспрессии. Так Singh et al. [10] предположили, что полиморфизм HSPA1L (T2437C) может влиять на шаперонную функцию HSP70, а носительство CC генотипа является неблагоприятным для продолжительности жизни человека. При этом остаются не выясненными ассоциации полиморфных вариантов генов HSPs с процессами развития и прогрессирования ХРИ, которые способствовали бы выработке критериев оценки индивидуальной чувствительности организма и риска развития заболевания. Цель настоящей работы заключалась в исследовании ассоциации полиморфных локусов генов HSPA1 с формированием ХРИ у рабочих производства каустика, подвергшихся хроническому воздействию парами металлической ртути. Методы Проведено обследование 87 мужчин, ранее занятых в производстве каустика методом ртутного электролиза и более 10 лет подвергавшихся хроническому воздействию паров металлической ртути на предприятиях Восточной Сибири. Обследуемые были распределены в две группы: группа 1 (n = 42) - контактировавшие с ртутью и не имеющие диагноза ХРИ, группа 2 (n = 45) - с установленным диагнозом ХРИ. Названные группы были сформированы из рабочих двух предприятий Иркутской области, расположенных в городах Саянск и Усолье-Сибирское. На первом предприятии технология ртутного электролиза применялась с 1979 по 2006 год, на втором - с 1943 по 1998 год, после чего использовалась диафрагменная технология производства каустика. Забор биологических образцов проводили в клинике Восточно-Сибирского института медикоэкологических исследований во время углубленного обследования в 2005-2012 годах. От каждого человека было получено информированное согласие на участие в обследовании, одобренное в установленном порядке Комитетом по биомедицинской этике. В литературе имеются данные, характеризующие загрязнение воздуха рабочей зоны ртутью и ее со держание в биосубстратах персонала названных предприятий [1, 3]. Многолетние наблюдения за рабочими (с конца 70-х годов прошлого века) и клиническое обследование индивидов из сформированных групп были выполнены специалистами в области профессиональной патологии на базе клиники института. У пациентов с диагнозом профессиональной ХРИ выявлено прогрессирование тяжести клинических проявлений интоксикации и формирование органического поражения нервной системы [2]. Для исследования полиморфных локусов генов HSPA1B (2074G/C и 1267A/G, rs1061581) и HSPA1L (2437T/C, rs2227956) использовали венозную кровь. Образцы крови были получены от обследованных по стандартной процедуре в Vacuette tube K3E (с K3 EDTA), которые до выполнения анализов хранили при температуре -70 °С, ДНК выделяли с помощью комплекта реагентов «ДНК-сорб-В» (Институт эпидемиологии, Москва, Россия). Последовательно выполняли ПЦР в амплификаторе «Терцик» («ДНК-Технология», Россия) и анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов. Для генотипирования использовали праймеры, синтезированные фирмой «Медиген» (Новосибирск, Россия), эндонуклеазы рестрикции от «Fermentas» (Литва). Структура праймеров, типы рестриктаз и условия проведения амплификации детально описаны в работе [8]. Электрофорез осуществляли в 1,5 % агарозном геле, результаты реакций оценивали в проходящем УФ-свете после окрашивания этидиумом бромидом. Статистический анализ выполнен с использованием пакета прикладных программ «STATISTICA 6.1» (StatSoft, USA) и программы с открытым доступом SNPStats (http://bioinfo.iconcologia.net/SNPstats_ web). Различия между группами по частотам аллелей и генотипов оценивали с помощью метода сравнения относительных частот при выборе двухстороннего критерия статистической значимости. Логистическую регрессию выполняли для выявления ассоциаций изученных полиморфных локусов с ХРИ для трех видов генетических моделей - рецессивной, доминантной и аддитивной. Результаты анализа представляли в виде отношения шансов (OR), 95 % доверительного интервала (CI) и точного уровня значимости р. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез p < 0,05. Использовали х2-тест для проверки соответствия равновесию Харди - Вайнберга. Результаты Распределение частот изученных генотипов полиморфных вариантов генов HSPA1 в обследованных группах соответствовало равновесию Харди - Вайнберга (табл. 1). При этом значимые отличия между группами были выявлены как для аллелей, так и для генотипа GG локуса 1267A/G гена HSPA1B. Это выражалось в повышенной частоте G аллеля (p = 0,029) и названного генотипа в группе пациентов с диагнозом ХРИ относительно группы 1 (p = 0,003). GG генотип был обнаружен у 11 из 45 пациентов 11 Экология труда Экология человека 2016.09 из группы с диагнозом ХРИ, что составляло 24,4 %. При этом 11 из 12 носителей такого генотипа имели ХРИ (91,7 %). Каких-либо отличий в распределении частот аллелей или генотипов других изученных ло-кусов не обнаружено. Таблица 1 Распределение аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов HSP1A Ген (полиморфный Группа 1 Группа 2 локус), аллели, (n=42) (n=45) p генотипы абс. (%) абс. (%) HSPA1B ( + 1267A/G) A 61 (73) 51 (57) 0,029 G 23 (27) 39 (43) AA 20 (48) 17(38) 0,348 AG 21 (50) 17 (38) 0,263 GG 1 (2) 11 (24) 0,003 HSPA1B (+2074G/C) G 50 (60) 63 (70) 0,168 C 34 (40) 27(30) GG 16 (38) 23 (51) 0,226 GC 18 (43) 17(38) 0,636 CC 8 (19) 5 (11) 0,298 HSPA1L (+2437T/C) T 66 (79) 77 (86) 0,225 C 18 (21) 13 (14) TT 27 (64) 33(73) 0,368 TC 12 (29) 11 (24) 0,599 CC 3 (7) 1 (2) 0,260 Таблица 2 Ассоциация полиморфных локусов генов HSPA1 с формированием хронической ртутной интоксикации Ген (полиморфный локус) Ред кий ал лель Модель OR, 95% CI, p* AIC HSPA1B ( + 1267A/G) G AA/AG+GG AA+AG/GG AA-AG-GG 1,50, 0,64-3,52, 0,350 13,26, 1,63-107,91, 0,001 2,0, 1,05-3,81, 0,030 123,6 114,2 119,8 HSPA1B (+2074G/C) C GG/GC+CC GG+GC/CC GG-GC-CC 0,59, 0,25-1,38, 0,220 0,53, 0,16-1,78, 0,300 0,66, 0,36-1,20, 0,170 123,0 123,4 122,6 HSPA1L (+2437T/C) C TT/TC+CC TT+TC/CC TT-TC-CC 0,65, 0,26-1,63, 0,360 0,30, 0,03-2,96, 0,260 0,64, 0,30-1,38, 0,250 123,7 123,3 123,2 Примечание. * - представлены результаты логистической регрессии для трех генетических моделей (сверху вниз): доминантной, рецессивной и аддитивной. Результаты логистической регрессии для трех генетических моделей представлены в табл. 2. Проведенный анализ выявил, что маркером риска развития ХРИ является гомозиготный по редкому аллелю генотип GG локуса HSPA1B (1267A/G), о чем свидетельствовали OR = 13,26, p = 0,0013 для рецессивной модели. Аддитивная модель для локуса HSPA1B (1267A/G), оценивающая вклад редкого G аллеля, также была статистически значима (OR = 2,0, p = 0,030). Однако рецессивная модель более правдоподобно описывает результаты генотипирования, поскольку имеет меньшее значение информационного критерия Акаике (AIC = 114,2 по сравнению с 119,8 для аддитивной модели). Отметим, что ни одна из изученных моделей для локусов HSPA1B (2074G/C) и HSPA1L (2437T/C) не выявила значимых искомых ассоциаций. Обсуждение результатов Центральная нервная система является одной из мишеней токсического воздействия ртути. Обнаружение признаков нейродегенеративных процессов у пациентов с диагнозом ХРИ позволило предположить, что различия в чувствительности к воздействию Hg0 и формировании ХРИ могут зависеть от генотипов полиморфных локусов генов, в частности, белков теплового шока семейства 70. Проведенное исследование показало ассоциацию ХРИ с локусом HSPA1B (1267A/G), а гомозиготный генотип по редкому аллелю GG является маркером формирования и прогрессирования заболевания. Выявлен высокий риск (OR = 13,26, p = 0.0013) для GG-HSPA1B (+1267A/G) генотипа у пациентов с ХРИ относительно группы рабочих без этого заболевания. Temple et al. [11] не исключают, что G аллель HSPA1B (+1267A/G) может ассоциировать с повышением уровня экспрессии HSPA1A и HSPA1B. Поэтому выявленная нами высокая частота генотипа GG в группе пациентов с диагнозом ХРИ может указывать на наличие ассоциации между повышенной экспрессией HSP1A mRNA и развитием нейродеге-неративных заболеваний. Установлено носительство GG-HSPA1B (+1267A/G) генотипа у нескольких пациентов с диагнозом ХРИ. Важно отметить, что носительство данного генотипа было также выявлено у одного обследованного из группы 1 (возраст - 33 года, продолжительность контакта с парами Hg0 13 лет). Полученные нами результаты подчеркивают необходимость наблюдения этого молодого человека, имеющего высокий потенциальный риск развития ХРИ в будущем. Обоснованность такой рекомендации подтверждается фактами постановки диагноза ХРИ рабочим, которые на первом этапе обследования были отнесены к группе не имеющих данного заболевания. Несмотря на значимость полученных результатов, необходимо отметить ряд ограничений. Прежде всего это касается относительно небольшого количества обследованных лиц в каждой группе. При этом различия в распределении изученных генотипов оценивалось относительно другой хронически экспонированной 12 Экология человека 2016.09 Экология труда парами Hg0 группы, у представителей которой к моменту обобщения результатов клинического обследования не была диагностирована интоксикация. Вполне возможно, что у некоторых рабочих из этой группы сформируется ХРИ в будущем. Отсутствие группы сравнения из индивидов, не имевших профессионального контакта с ртутью, не позволяет получить представление о доле в популяции носителей редкой гомозиготы, которая, как продемонстрировано в нашем исследовании, высоко ассоциировала с формированием ХРИ. С другой стороны, в работе были изучены только три полиморфных локуса двух HSPA1 генов, что не исключает значимости других локусов. В совокупности вышеизложенное подчеркивает важность и перспективность проверки наших выводов для исследований с использованием когорт пациентов с ХРИ из различных популяций. Таким образом, выявлена сильная генетическая ассоциация GG-HSPA1B ( + 1267A/G) генотипа с развитием ХРИ. Высокая частота GG генотипа в группе пациентов с ХРИ указывает на вовлеченность HSPA1 в механизмы формирования и прогрессирования этого заболевания. Полученные результаты могут дополнить представления о механизмах формирования хронической ртутной интоксикации, имеющей признаки нейродегенеративных процессов, и будут способствовать выработке критериев оценки индивидуальной чувствительности организма и риска развития ХРИ. Автор выражает благодарность Мериновой А. П. за техническую ассистенцию, сотрудникам клиники за организацию обследования и формирование групп, доктору биологических наук Корытиной Г. Ф. (Институт биохимии и генетики УНЦ РАН, Уфа) за рекомендации по обработке результатов.

About the authors

Yu I Chernyak

ast-Siberian Institute of Medical and Ecological Research

Email: yuri_chernyak@hotmail.com
Angarsk, Russia

References

Supplementary files