THE EXPRESSION LEVEL OF THE MOLECULES OF THE RECEPTOR COMPLEX CD95 AND CD8 HUMAN BLOOD LYMPHOCYTES UNDER CARBON MONOXIDE AND ULVTRAVIOLET LIGHT INFLUENCE

Full Text

Обширная распространенность зон с высокой концентрацией угарного газа (оксид углерода (II), монооксид углерода, СО) в среде обитания человека определяет высокую частоту и неблагоприятные исходы отравлений данным веществом. Однако в исследованиях последних лет показано, что молекула СО может играть полезную роль в организме человека. В норме оксид углерода (II) образуется в организме человека при деградации гемсодержащих соединений [11]. Показано [9], что СО в низких концентрациях, наравне с NO, необходим для функционирования практически всех органов и тканей. Монооксид углерода вовлечен в регуляцию иммунных процессов, тонуса сосудов, передачу импульсов в мозге, он ингибирует провоспалительные сигнальные пути и способствует индукции антипролиферативных, анти-коагуляционных и антиапоптотических механизмов [11]. Воздействие монооксида углерода на иммуно-компетентные клетки может привести к нарушению функционирования систем иммунитета, а возможно, и гибели иммунокомпетентных клеток. Лимфоциты -один из видов клеток защитной системы организма, 37 Эндоэкология Экология человека 2016.07 которые обеспечивают клеточные и гуморальные формы иммунного ответа. Гибель лимфоцитов при действии экстремальных факторов может происходить в форме программируемой клеточной смерти (апоптоза). Апоптоз способен индуцироваться извне, и клетка самостоятельно начнет запускать программу собственной смерти при определенных условиях и быстро элиминировать клетки, ставшие ненужными [1]. На мембранах лимфоцитов экспрессируются Fas-рецепторы (CD95), которые являются молекулами, запускающими апоптоз по рецепторзависимому пути [15]. По сведениям А.Ю. Барышникова и соавт. [6], а также М. Massaia et al. [17], антиген присутствует на поверхности 23-25 % лимфоцитов периферической крови здоровых людей. Реализация цитотоксиче-ской (апоптогенной) активности лимфоцитов может осуществляться путем экзоцитоза цитолитических ферментов - перфоринов и гранзимов. Посредством перфорина в мембране клетки-мишени образуются поры, через которые поступают гранзимы, напрямую активирующие каспазы-8, -3 и запускающие таким образом каскад внутриклеточных разрушений [14]. Необходимость коррекции поражений лимфоцитов крови как в случае хронических интоксикаций, так и при острых отравлениях является актуальной проблемой в лечении подобного рода нарушений иммунной системы. Для коррекции нарушений в работе иммунной системы больных с различной патологией в современной практике применяют метод аутотрансфузии ультрафиолетом (УФ) облученной крови (АУФОК-терапии). АУФОК приводит к активации иммунных процессов, улучшает иммунологический статус организма, что может быть следствием структурно-функциональных изменений иммунокомпетентных клеток крови после их фотомодификации. Однако механизмы воздействия монооксида углерода и УФ-облучения, связанные с состояниям CD95- и CD8-маркеров, остаются до конца не изученными и требуют дополнительного анализа. Целью нашей работы являлось исследование влияния монооксида углерода в течение 5 + 90 мин и УФ-облучения (240-390 нм) в дозах 151, 453 и 755 Дж/м2 на уровень экспрессии молекул их рецепторного комплекса (CD95, CD8) на поверхности мембран лимфоцитов крови человека. Методы Объектом исследования служили лимфоциты, полученные из гепаринизированной крови доноров методом седиментации (300 g, 15 мин) в градиенте плотности фиколл-урографина (р = 1,077 г/см3) по методу A. Boyum [2]. Суспензию лимфоцитарных клеток помещали в атмосферу оксида углерода (II), который получали лабораторным способом по химической реакции между концентрированными серной и муравьиной кислотами в колбе с закрытой крышкой и газоотводной трубкой (соотношение 1:1) [7]. Модификация монооксидом углерода исследуемых клеток крови длилась 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 75 и 90 мин. Количество образовавшегося оксида углерода (II) определяли спектрофотометрическим методом [12] по содержанию карбоксигемоглобина в гепарини-зированной крови доноров. Оптическая плотность растворов карбоксигемоглобина человека измерялась при л = 538 нм с помощью спектрофотометра «Shimadzu RF-5301 РС» (Япония). Концентрация HbCO в нативной крови составила 0,30 %, а после 60 мин пропускания СО через ее растворы она достигла значения 0,58 %, через 75 мин - 0,75 %, через 90 мин - 0,86 %, что соответствует 0,002; 0,004; 0,005 и 0,006 мг/л HbCO. Таким образом, используемые для модификации исследуемых клеток концентрации СО не превышали физиологического уровня содержания лиганда в крови здоровых лиц [10]. Суспензии нативных и СО-модифицированных иммуноцитов в объеме 1 мл облучали сверху светом ртутно-кварцевой лампы типа «ДРТ-400» (Россия) через светофильтр УФС-1 с полосой пропускания 240-390 нм (со спектральными линиями 253,7, 265,2, 280,0, 296,7, 302,2, 312,6, и 365,0 нм) в стеклянной термостатируемой кювете (20 °С ± 1 °С) при их непрерывном перемешивании магнитной мешалкой. Расстояние от оси лампы до кюветы с суспензией клеток составляло 0,23 м. Интенсивность излучения лампы - 151 Дж/м2 в 1 мин. Время воздействия УФ-излучения на суспензию лимфоцитов составляло 1, 3 и 5 мин (соответственно дозы облучения равнялись 151, 453 и 755 Дж/м2). Для определения уровня экспрессии изучаемых маркеров на поверхности мембран нативных, СОи УФ-модифицированных лимфоцитов применяли методы твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) и проточной цитофлуориметрии. При проведении ИФА в работе использовали суспензию лимфоцитов, моноклональные антитела серии LT95 и LT8 против CD95 и CD8-маркеров человека соответственно и конъюгат козьих антител против IgG мыши с пероксидазой хрена («Сорбент», Москва). В качестве субстрата для пероксидазы использовали раствор ортофенилендиаминдиги-дрохлорида в цитратно-ацетатном буфере (pH 5,0) с добавлением 0,2 % раствора пероксида водорода. Результаты учитывали спектрофотометрически (X = 492 нм) на вертикальном фотометре «Униплан» (Пикон, Москва) и выражали в единицах оптической плотности. При использовании метода проточной цитофлу-ориметрии суспензию лимфоцитов анализировали на проточном цитофлуориметре « EPICS XL-MCL» («Beckman coulter», США). В работе использовали моноклональные антитела CD95, меченные FITC (Fluorescein Isothiocyanate), и соответствующие изо-типические контроли («Beckman coulter», США). Количество клеток коррелирует с плотностью антигенов на клеточной поверхности. По величине средней интенсивности флуоресценции (СИФ) клеток после 38 Экология человека 2016.07 Эндоэкология взаимодействия со специфическими антителами, меченными флуорохромом, судили об уровне экспрессии изучаемых молекул после СО- и УФ-воздействия и результаты выражали в процентах. Для статистической обработки результатов экспериментов использовали прикладную программу Microsoft Exel: определяли среднее значение, стандартное отклонение и доверительный интервал. Достоверность различий контрольных и опытных значений сравниваемых показателей рассчитывали по t-критерию Стьюдента при 5 % уровне значимости [4]. Результаты Методом ИФА было установлено, что уровень экспрессии Fas-рецепторов на поверхности мембран интактных лимфоцитов крови доноров в среднем составлял (0,350 ± 0,073) опт. ед. Суточная инкубация нативных лимфоцитов в термостате при 37 0С не отразилась на уровне Ж95-рецепторов. Инкубирование суспензии клеток в атмосфере СО при экспозиции 5^45 мин не приводило к статистически значимым изменениям уровня экспрессии CD95-антигена по сравнению с контрольным образцом, а инкубация в течение 60, 75 и 90 мин сопровождалась снижением ИФА-сигнала до величин (0,235 ± 0,040), (0,236 ± 0,032) и (0,236 ± 0,033) опт. ед. соответ ственно (рис. 1), то есть количество CD95-молекул на мембранах СО-модифицированных клеток уменьшилось на 32,2 % относительно контрольных образцов. После 24-часового нахождения исследуемых объектов в термостате эти показатели снизились и достигли значений (0,196 ± 0,029), (0,190 ± 0,030), (0,189 ± 0,040) опт. ед., что составило в среднем 44-46 % от величины интактного контроля. Для подтверждения факта снижения уровня экспрессии CD95-рецепторов на поверхности мембран СО-модифицированных (60, 75 и 90 мин) иммуно-цитов, полученного с помощью ИФА, были проведены эксперименты по изучению выраженности CD95-маркеров на поверхности нативных, СО- и УФ-модифицированных клеток методом проточной цитофлуориметрии. Цитометрические исследования суспензий интактных лимфоцитов показали, что содержание CD95+-клеток составляло (36,0 ± 3,1) %, а их СИФ - (3,0 ± 0,2) усл. ед. После воздействия на смесь лимфоцитов монооксида углерода в течение 60, 75 и 90 мин СИФ клеток понижалась соответственно на 13,6, 25,2 и 27,5 % (рис. 2). Полученные результаты подтверждают тестируемые нами с помощью метода ИФА изменения в исследуемой системе. D, опт ед. 0.500 0.450 0,400 0,350 0,300 0.250 0,200 0,150 0.100 0,050 0,000 Élllh 20 30 45 son контроль 5 10 15 □ Co-моді [фііцх грованные лнмфоці ггы □ моді[фіпдіі)>ованныелнмфоціггьї после суточного термостстірованїія 24 ч. Рис. 1. Уровень экспрессии CD95 рецепторов нативными и СО-модифицированными (60 90 мин) лимфоцитами до и после их суточного термостатирования Рис. 2. Величины средней интенсивности флуоресценции CD95-маркеров на поверхности лимфоцитов крови человека, модифицированных монооксидом углерода (60, 75 и 90 мин) 39 Эндоэкология Экология человека 2016.07 УФ-облучение лимфоцитов в дозе 151 Дж/м2 не приводило к статистически значимым изменениям уровня экспрессии CD95-маркеров. УФ-излучение в дозах 453 и 755 Дж/м2 вызывало повышение тестируемого показателя, что выражалось в возрастании его значений соответственно на 13,3 и 12,6 % по сравнению с контрольными образцами. Влияние УФ-излучения в дозе 151 Дж/м2 на лимфоциты, инкубированные с СО в течение 60 мин, проявлялось в возрастании уровня экспрессии CD95-маркеров иммунокомпетентных клеток на 10,1%. В случае инкубации лимфоцитов в атмосфере монооксида углерода в течение 75 и 90 мин обнаружить статистически значимые изменения анализируемого показателя у фотомодифицированных клеток (по сравнению с аналогичным образцом без облучения) не удалось (рис. 3). В условиях сочетанного воздействия монооксида углерода в течение 60 и 75 мин и УФ-излучения в дозе 453 Дж/м2 уровень экспрессии CD95-антигенов лимфоцитов по сравнению с контролем в первом случае увеличивался на 10,4 %, во втором уменьшался на 23,5 %. В образцах, модифицированных воздействием СО в течение 90 мин, УФ-излучение в дозе 755 Дж/м2 индуцировало увеличение СИФ CD95+-клеток относительно необлученного образца на 5,9 %. По уровню экспрессии и характеру ответа CD8-антигенов на модификацию лимфоцитов оксидом углерода (II) доноры были разделены на две группы. Уровень экспрессии CD8-молекул на поверхности мембран интактных клеток первой группы доноров составил в среднем (0,313 ± 0,041) опт. ед. Инкубирование суспензии клеток в атмосфере СО 5^90 мин не привело к статистически значимым изменениям ИФА-показателя по сравнению с контрольным образцом, то есть количество CD8-молекул на мембранах Рис. 3. Величины средней интенсивности флуоресценции CD95-маркеров на поверхности лимфоцитов крови человека, модифицированных монооксидом углерода и УФ-излучением: 1 - без облучения; 2 - 151 Дж/м2; 3 - 453 Дж/м2; 4 - 755 Дж/м2 Рис. 4. Уровень экспрессии CD8-рецепторов СО-модифицированных лимфоцитов крови человека до и после 24 ч инкубации (1-я группа доноров) 40 Экология человека 2016.07 Эндоэкология Рис. 5. Уровень экспрессии CD8-рецепторов СО-модифицированных лимфоцитов крови человека до и после 24 ч инкубации (2-я группа доноров) клеток, модифицированных СО в течение исследуемого диапазона времени, не изменилось. После суточного нахождения нативных объектов в термостате (37 °С) мы зарегистрировали статистически значимое снижение уровня экспрессии CD8-молекул до значения (0,183 ± 0,029) опт. ед. (на 41,5 % по сравнению с интактными клетками). У лимфоцитов, СО-модифицированных в течение 5+90 мин и подвергшихся суточному инкубированию в термостате, также наблюдалось уменьшение количества CD8-маркеров на поверхности мембран лимфоцитов на 16-42 % (рис. 4). Во вторую группу вошли доноры, у которых уровень экспрессии CD8-молекул нативных лимфоцитов был изначально меньше, чем у лиц первой группы, и в среднем составлял (0,239 ± 0,010) опт. ед. После инкубирования лимфоцитов в атмосфере оксида углерода (II) в течение 5+90 мин, как и у первой группы доноров, не происходило статистически значимых изменений количества CD8-антигенов на поверхности мембран лимфоцитов относительно контрольных образцов. Суточная инкубация интактных клеток этой группы доноров в термостате при 37 0С приводила к статистически значимому увеличению уровня экспрессии CD8-маркеров лимфоцитарных клеток - (0,292 ± 0,040) опт. ед. Суточное нахождение исследуемых СО-модифицированных клеток в термостате индуцировало рост экспрессии исследуемых молекул на 28-64 % (рис. 5). Разнонаправленная ответная реакция лимфоцитов крови человека на воздействие оксида углерода (II), вероятно, обусловлена различной СО-чувствительностью CD8-рецепторов разных групп лиц. Обсуждение результатов Наблюдаемое падение экспрессии CD95-маркеров на поверхности лимфоцитов после инкубации в атмосфере СО (60, 75 и 90 мин) может свидетельствовать о нарушении рецепторопосредованного пути развития апоптоза и служить предпосылкой развития гипотезы об антиапоптотическом потенциале монооксида углерода. Представленные нами данные согласуются с исследованиями, проведенными ранее на других типах животных клеток. Так, добавление в клеточные культуры экзогенного СО препятствовало TNF (Fas/CD95)-индуцированному апоптозу мышиных фибробластов, эндотелиальных клеток, ß-клеток поджелудочной железы. Выявлено, что ингибирующее воздействие монооксида углерода на TNF-индуцированный апоптоз эндотелиальных клеток может быть отменено при действии на клетки селективного ингибитора MAP-киназы р38 [16]. Показано [13], что р38 обладает про-апоптотическими свойствами, которые реализуются за счет фосфорилирования транскрипционного фактора р53. Song R. et al. [18] продемонстрировали, что для ингибирования митохондриального пути реализации апоптоза СО способен активировать MAP-киназу р38 и приводить к фосфорилированию ERK MAP-киназ, увеличивающих рецепторный апоптотический путь. В проведенных экспериментах с использованием монооксида углерода было показано, что СО может обладать антиапоптотическими свойствами за счет индукции Nf-kB-зависимых генов, препятствующих деполяризации митохондрий [19]. УФ-излучение в дозах 453-755 Дж/м2, по всей вероятности, проявляет проапоптотическое действие, что подтверждается повышением СИФ CD95-рецепторов на поверхности лимфоцитов крови человека (известно, что возрастание количества этого антигена на поверхности мембран клеток является предпосылкой развития апоптоза). Увеличение экспрессии CD95-маркеров после воздействия УФ-света может быть связано с конформационными перестройками, вызывающими их переориентировку в 41 Эндоэкология Экология человека 2016.07 мембране, что в последующем может привести к изменению локализации исследуемых антигенов на поверхности клетки. Помимо конформационных изменений мембрансвязанных белков к фотоиндуциру-емым перестройкам рецепторного материала может приводить интенсификация процессов ПОЛ и ПФОЛ, накопление активных форм кислорода и токсичных продуктов [3, 7]. Сочетанное действие монооксида углерода и УФ-света на иммунокомпетентные клетки способствует разновекторным изменениям параметров экспрессии Ж95-рецепторов. В ходе проведенных нами исследований было показано иммуномодулирующее действие оксида углерода (II) после 24 часов нахождения СО-модифицированных лимфоцитов в термостате на экспрессию CD8-молекул на поверхности мембран лимфоцитов. Это выражалось в зависимости между исходным уровнем CD8-маркеров и ответной реакцией его молекул на воздействие монооксида углерода: тестируемый показатель снижался после суточного термостатирования модифицированных лимфоцитов у доноров с исходно высокими (1-я группа) и возрастал у лиц с исходно низкими (2-я группа) его значениями. Таким образом, нами установлено, что оксид углерода (II) существенно модулирует состояние CD8-антигенов мембран лимфоцитов, вызывая неодинаковые изменения экспрессии изучаемой молекулы. Выявленные закономерности изменения маркерной молекулы цитотоксичсеких лимфоцитов в присутствии CO необходимо учитывать при лечении острых отравлений оксидом углерода (II), а также при анализе хронических СО-интоксикаций [5]. Воздействие УФ-излучения может привести к развитию апоптоза лимфоцитов крови человека и развитию процессов ПОЛ и ПФОЛ, поэтому безопаснее использовать для лечения различных заболеваний человека малые («физиологические») дозы облучения. Результаты изучения индуцированных УФ-излучением и монооксидом углерода структурнофункциональных признаков апоптоза лимфоцитов крови человека необходимы для понимания тонких механизмов работы компонентов иммунной системы в норме и при патологии. Выявленные нами изменения рецепторного профиля иммунокомпетентных клеток в присутствии низкомолекулярного лиганда (СО) могут отразиться на их активности, что необходимо принимать во внимание при проведении УФОК-терапии больных различной этиологии. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках реализации ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» (ФЦП ИР14-20) мероприятие 3.1.2. ««Поддержка и развитие центров коллективного пользования научным оборудованием». Соглашение № 14.593.21.0001, идентификатор проекта RFMEFI59314X0001.

About the authors

V G Artyukhov

Voronezh State University

Voronezh, Russia

O I Tyunina

Voronezh State Medical Academy named N.N. Burdenko

Voronezh, Russia

E V Dorohov

Voronezh State Medical Academy named N.N. Burdenko

Email: dorofov@mail.ru
Voronezh, Russia

References

Supplementary files