INFLUENCE OF SUBSTANCE πQ1983 ON ENERGY METABOLISM AND OXYGEN CONSUMPTION DURING ACUTE EXOGENOUS HYPOXIA

Full Text

Существует мнение, что перспективным способом повышения резистентности организма к острой экзогенной гипоксии может служить своевременное применение фармакологических средств, снижающих общую физическую активность [2, 6, 12]. Последнее гарантирует для индивидуума более экономный режим расходования доступных для дыхания кислородных ресурсов [2, 4]. Известно, что лимитирование тканевых и органных метаболических запросов может быть обеспечено веществами, относящимися к классу антигипоксантов-металлокомплексов [5, 14]. Ранее нами было показано, что одно из таких соединений, а именно селенсодержащее вещество kQ1983, эффективно защищает лабораторных животных (мышь, крыса) от последствий, обусловленных развитием острой экзогенной гипоксии. На фоне действия вещества kQ1983, введенного парентерально или внутрь, повышение резистентности животных к гипок-сическому воздействию сопровождалось признаками, косвенно свидетельствующими об ослаблении энергетического обмена. В частности, наблюдали снижение общей моторики подопытных животных, уменьшение ректальной температуры, развитие брадикардии и брадипноэ [5, 14]. Химически вещество kQ1983 представляет собой гексакис (3-гидрокси-2-этил-6-метилпиридинато) [трис (дибензилдиселенидо)] дицинк (II) пентадекасе-мигидрат - комплексное соединение двухвалентного цинка (Zn2+), замещённого 3-гидроксипиридина и диорганодихалькогенида [15]. Формула вещества представлена на рис. 1. А Б [Zn(II)]2 А6В315,5Н20 Рис. 1. Химическая формула вещества яр1983 Целью работы явилась оценка влияния вещества kQ1983 после введения внутрь на величину стандартного энергетического обмена крыс и интенсив- 21 Экологическая физиология ность потребления животными кислорода в условиях остро формирующегося гипоксического состояния экзогенной природы. Методы Материалом для экспериментальных исследований послужили 54 половозрелые крысы-самцы линии Wistar массой 170-180 г. Отбор по другим параметрам не требовался. Все опыты выполнены в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) и «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации» (2003). Предварительно крыс делили на 6 групп по 9 особей. В первой части исследования оценивали уровень энергетических затрат крыс после введения изученных веществ per os. В связи с тем, что в опытах на животных определение основного обмена - показателя, наиболее объективно характеризующего скорость течения энергоёмких процессов в организме, не представляется возможным, у крыс регистрировали параметр, известный в литературе как «стандартный энергетический обмен» (СтЭО) [19]. В качестве стандартизирующих соблюдали следующие условия: - масса тела 170-180 г; - нахождение в условиях вивария по 4 - 5 особей в клетке; - постоянная температура окружающего воздуха 20-22 °С; - ректальная температура перед опытом не менее 36,5 °С и не более 37,5 °С; - последний приём пищи - за 12 ч до начала опыта; - выполнение опыта в затемнённой камере; - соблюдение во время опыта режима тишины; - проведение всех опытов в течение одной недели в одно и то же время суток - 09.00; - приведение полученных результатов к стандартным условиям. Собственно определение величины СтЭО у крыс осуществляли с помощью модифицированного метода М. Н. Шатерникова [1], позволяющего непосредственно и в динамике оценивать объём потребляемого животным О2 (рис. 2). Перевод кислородных объёмов в калорические единицы производили по классической методике А. Крога. Первой опытной группе вещество πQ1983 вводили per os в желудок через эластичный зонд в дозе 100 мг/кг, предварительно растворив в 3 мл изотонического раствора NaCl. Веществом сравнения служил антигипоксант амтизол. Антигипоксант вводили 2-й опытной группе аналогичным способом в той же дозе. Животные 3-й (контрольной) группы получали через зонд 3 мл изотонического раствора NaCl. Период инкубации для всех крыс составлял 90 мин. Перед каждым опытом камеру Шатерникова вентилировали в течение 20-30 мин, пропуская Экология человека 2015.01 Рис. 2. Схема аппарата для исследования газообмена у крысы по модифицированному методу М. Н. Шатерникова [1] Примечание. АИВЛ - аппарат искусственной вентиляции лёгких; О2 - кислородная ёмкость; СО2 - поглотитель углекислоты (натронная известь); К и К - компенсаторы давления в ёмкости с кислородом; М - датчик атмосферного давления. через неё атмосферный воздух. Для объективной параметризации полученных результатов проводили дополнительное тестирование модели с помощью кислородного газового анализатора АНКАТ-7631М (Россия, ФГУП «Смоленское ПО «Аналитприбор»), для чего на разных этапах опыта осуществляли забор проб воздуха из камеры Шатерникова с целью определения процентного содержания в ней О2. По завершении периода адаптации животного к новым условиям (10 - 20 мин) приступали к эксперименту. Объём использованного для дыхания О2 отмечали через 15 мин после помещения крысы в камеру Шатерникова. Все полученные результаты приводили к стандартным условиям, после чего энергетические затраты животного рассчитывали по Крогу (ккал/сут/кг). Во второй части исследования для воспроизведения на крысах О2-дефицитного состояния применяли авторский способ моделирования острой гипоксии без гиперкапнии (ОГ-Гк) [5]. Формирование у животных состояния ОГ-Гк обеспечивали путём помещения их в стеклянные гипоксические камеры со свободным объёмом 1,0 л. Для предупреждения развития у крыс состояния гиперкапнии использовали гранулы натронной извести (поглотитель СО2) в количестве 50 г. Наличие в гипоксической камере эластичного компенсатора внутриёмкостного давления препятствовало возникновению в ходе опыта эффекта гипобарии, связанного с поглощением СО2 (рис. 3). Перед началом экспериментов в гипоксических камерах тестировали качество воздуха с помощью электронных газоанализаторов АНКАТ-7631М (О2) и ГИАМ-301 (СО2) (Россия, ФГУП «Смоленское ПО «Аналитприбор»). Крыс в гипоксические камеры помещали при концентрациях О2 и СО2 не ниже 20,5 % и не выше 0,04 % соответственно. Для изучения воздействия вещества πQ1983 и амтизола на скорость потребления крысами О2 субстанции вводили так же, как и в первой части исследования, в тех же дозах: 1-я группа - вещество πQ1983, 2-я группа - амтизол, 3-я (контрольная) 22 Экология человека 2015.01 Экологическая физиология Рис. 3. Устройство для моделирования у крысы состояния острой гипоксии без гиперкапнии Примечание. 1 - стеклянная гипоксическая камера; 2 - гранулы натронной извести (поглотитель СО2); 3 - резиновая пробка; 4 - трубка манометра; 5 - манометр; 6 - трубка компенсатора внутриёмкостного давления; 7 - компенсатор внутриёмкостного давления; 8 - крыса. группа - изотонический раствор NaCl. После помещения животных в условия эксперимента (ОГ-Гк) их гибель констатировали в момент полной остановки дыхания. Статистическую и графическую обработку данных проводили с использованием пакетов прикладных программ Microsoft Excel 2000 и Statistica 7. Для сопоставления значимости различий полученных результатов применяли непараметрический критерий Wilcoxon. Различия между сравниваемыми параметрами считали статистически значимыми при p < 0,05. Результаты На первом этапе исследования для определения величины СтЭО животных последовательно помещали в камеру Шатерникова. Было установлено, что скорость потребления О2 крысами контрольной и обеих опытных групп составила соответственно: (0,64 ± 0,37) мл/ч/г (вещество πQ1983); (1,59 ± 0,42) мл/ч/г (амтизол); (1,67 ± 0,53) мл/ч/г (контроль). С помощью усредненного калорического эквивалента кислорода Крога объёмные величины были переведены в калорические единицы (рис. 4). Рис. 4. Влияние вещества πΡ1983 и амтизола на стандартный энергетический обмен крыс после введения внутрь в дозе 100 мг/кг Примечание. * р < 0,01 при сравнении с контролем. Как видно из диаграмм, средняя величина СтЭО для крыс контрольной группы составляла (194,4 ± 0,7) ккал/сут/кг, что соответствует уровню средних энергетических потребностей для белой крысы. Применение вещества πQ1983 в дозе 100 мг/кг внутрь приводило к снижению СтЭО - спустя 15 мин от начала измерения показатель составлял (74,5 ± 0,5) ккал/сут/кг (p < 0,01). Влияние амтизола на СтЭО было гораздо слабее в сравнении с эффектом вещества πQ1983 - спустя 15 мин опыта отмечали лишь тенденцию к снижению показателя (р > 0,05). Тем не менее последнее не исключало возможность отрицательного влияния ам-тизола на энергетический обмен крыс, находящихся в условиях формирования острой экзогенной гипоксии. Во второй части исследования изучали влияние тех же веществ на скорость потребления крысами О2 в условиях остро формирующейся экзогенной гипоксии. Как видно из представленных на рис. 5 графиков, после помещении животных контрольной группы в гипоксические камеры на протяжении первых 10 мин опыта исходная скорость потребления О2 в среднем составляла (4,48 ± 0,23) мл/мин и оставалась относительно постоянной, из чего можно было заключить, что при снижении концентрации О2 с обычного уровня (20,5-21,0 %) до 16,1 % интактные животные не испытывали дискомфорта, вызываемого дефицитом О2. О 25 50 75 100 Рис. 5. Динамика потребления крысами О2 из доступного для дыхания воздуха в контроле и на фоне действия вещества πΡ1983 (100 мг/кг) и амтизола (100 мг/кг) после введения внутрь На протяжении последующих 15 мин концентрация О2 в доступном для дыхания воздухе снижалась до 12,5 % при стабильной скорости его потребления (2,27 ± 0,15) мл/мин. Таким образом, несмотря на усугубление гипоксического статуса, скорость потребления О2 в сравнении с первыми 10 мин присутствия крыс в гипоксических камерах была статистически значимо (р < 0,01) ниже исходной (в 2 раза). Далее и вплоть до конца эксперимента скорость потребления О2 в среднем составляла 1,25 мл/мин, т. е. не превышала 28,1 % от исходного значения. Как правило, гибель крыс контрольной группы наблюдали на 47-й мин опыта при конечной концентрации О2 10,3 %. Введение крысам металлокомплексного соединения πQ1983 (1 -я опытная группа) приводило к существен 23 Экологическая физиология Экология человека 2015.01 ному снижению скорости потребления О2 (см. рис. 5). Так, по завершении периода инкубации стартовая скорость О2-потребления замедлялась в 3 раза, по сравнению с результатом, полученным в опытах на крысах контрольной группы, и составляла (1,46 ± 0,12) мл/мин (р < 0,01). Дальнейшие наблюдения показали, что на протяжении 80 мин эксперимента уровень потребления О2 оставался стабильно низким, а в последние 15 мин падал до (0,56 ± 0,07) мл/мин, т. е. снижался в 3 раза (p < 0,05). Следует подчеркнуть, что животные, защищённые веществом πQ1983, погибали в среднем через 98 мин. после их помещения в условия ОГ-Гк при концентрации О2 порядка 6,0 %. Последствия введения крысам вещества сравнения амтизола (2-я опытная группа) во многом напоминали эффект, наблюдавшийся на фоне действия вещества πQ1983, но были менее выразительными. Так, в течение первых 5 мин скорость потребления животными О2 составляла (4,18 ± 0,18) мл/мин и практически не отличалась от исходного показателя контрольной группы. Последующие 30 мин наблюдали статистически значимое в сравнении с группой контроля замедление скорости О2-потребления до (2,11 ± 0,16) мл/мин (р < 0,05), а с момента достижения концентрации О2 12,2 % и вплоть до завершения опыта - (1,10 ± 0,08) мл/мин (р < 0,01). Критическая концентрация О2, при которой наступала гибель крыс 2-й опытной группы, составила 9,3 %. Следует отметить, что влияние вещества πQ1983 на интенсивность потребления животными кислорода в течение всего эксперимента было более отчётливым, чем действие амтизола. Таким образом, в описанной серии опытов была продемонстрирована способность изученных веществ существенно снижать скорость потребления крысами О2. Эффект обнаруживал себя как в обычных условиях (сразу по завершении периода инкубации), так и в ходе гипоксического эпизода (ОГ-Гк), что не исключает, а скорее предполагает возможность его участия в реализации противогипоксического действия изученных веществ. Обсуждение результатов Таким образом, полученные данные в целом подтвердили способность селенсодержащего металлокомплексного соединения πQ1983 оказывать отчётливое тормозное влияние на интенсивность протекания энергетических процессов в организме млекопитающих, что также проявилось в статистически значимом снижении скорости потребления крысами кислорода - показателя, во многом предопределяющего уровень напряжения метаболических процессов в животных тканях. Как показали опыты первой части исследования, после введения внутрь вещества πQ1983 и средства сравнения амтизола в дозах 100 мг/кг СтЭО статистически значимо уменьшался только у животных 1-й опытной группы (вещество πQ1983) на 61,7 %. В свою очередь, введение животным амтизола (2-я опытная группа) сопровождалось лишь тенденцией снижения показателя. В. М. Виноградов с соавт. [3] в экспериментах на мышах с использованием предшественника амтизола антигипоксанта гутимина впервые обнаружили способность вещества снижать ректальную температуру животных и замедлять энергетический обмен. Оба феномена в дальнейшем рассматривались исследователями как явления, предопределяющие возможность экономии наличных кислородных ресурсов организмом и степень её выраженности. Во второй части исследования было установлено, что введение крысам изученных веществ ^Q1983, амтизол) внутрь в изучаемой дозе приводило к изменению динамики потребления О2 животными из воздуха, ограниченного объёмом гипоксической камеры. После применения обоих веществ крысы, переживавшие состояние остро нарастающей гипоксии, потребляли О2 с меньшей интенсивностью в сравнении с животными контрольной группы. Так, через 90 мин (период инкубации) после введения вещества πQ1983 скорость потребления животными О2 была в 3 раза ниже, чем в контроле. Следует отметить, что на заключительных этапах опытов, т. е. в течение последних 10-15 мин, признаки жизни у крыс (дыхание, моторика) сохранялись на фоне резкого замедления скорости потребления О2, которая составляла всего (0,56 ± 0,07) мл/мин, в то время как гибель животных наступала при критической концентрации О2 около 6,0 % (в контрольной группе - 10,3 %, р < 0,005). На протяжении всех опытов с применением вещества πQ 1983 в условиях ОГ-Гк скорость потребления О2 крысами была существенно ниже, чем тот же показатель в контрольной группе. Предположительно, это могло способствовать более экономному расходованию кислородных ресурсов и, в свою очередь, повышало вероятность успешного переживания животными гипоксического эпизода, несмотря на непрерывное ухудшение качества вдыхаемого воздуха. Амтизол при тех же условиях не оказывал значительного влияния на стартовый уровень О2-потребления. Однако в условиях гипоксического эксперимента его отрицательное влияние на данный показатель было статистически значимым, причём крысы погибали по достижении более низких концентраций О2 (9,3 %) в сравнении с контролем (10,3 %, р < 0,05). Следует подчеркнуть, что, несмотря на сравнительно слабое влияние амтизола на скорость потребления О2 крысами, в условиях ОГ-Гк антигипок-сант заметно увеличивал продолжительность жизни животных и повышал их способность выдерживать более жёсткие условия гипоксии. Результаты экспериментов позволили предположить, что вещество πQ1983 в условиях формирования у крыс состояния острой экзогенной гипоксии лучше оптимизирует процессы потребления О2 тканями в сравнении с антигипоксантом амтизолом. При этом 24 Экология человека 2015.01 Экологическая физиология нельзя не отметить, что оба изученных соединения существенно повышали резистентность животных к предельно низким концентрациям О2. Согласно имеющимся литературным данным, фармакологические вещества, антигипоксический эффект которых имеет обыкновение возрастать по мере углубления гипоксического состояния, относят к категории так называемых «истинных» антиги-поксантов [11, 12]. В зависимости от выраженности гипоксического статуса подобного типа антигипокси-ческие средства, к которым причисляют и амтизол, способны существенно повышать как пассивную, так и активную резистентность организма к острой гипоксии, обеспечивая в то же время достаточный уровень деятельности его наиболее динамичных функциональных систем и жизненно важных органов [8]. В соответствии с полученными результатами вещество πQ1983 и, в меньшей степени, антигипоксант амтизол особенно заметно ограничивали скорость потребления О2 животными в период, когда их состояние становилось особенно тяжёлым. В связи с этим не исключается вероятность того, что вещество πQ1983 реализует свой гипоксопротекторный эффект посредством тех же механизмов, что и «истинные» антигипоксанты, обеспечивая выживание организма в экстремальных условиях в первую очередь за счёт замедления скорости потребления доступного для дыхания О2. Следует отметить, что защитные эффекты антигипоксантов любого типа, включая и «истинные», не могут заменить собой кислород, т. к. наблюдаются лишь в относительно узких пределах, обычно на фоне значительного кислородного дефицита [16]. Так как кислородные запросы организма находятся в прямо пропорциональной зависимости от интенсивности течения энергоёмких химических реакций [10, 12, 13, 16], представлялось необходимым сопоставить реальные энергетические затраты крыс до и после введения выбранных для изучения химических соединений. Комбинация методов Ша-терникова и Крога обеспечила достаточную точность полученных результатов, характеризующих степень напряжения энергетических процессов у животных. В ходе исследования для крыс контрольной группы была установлена средняя величина СтЭО - 185,1 ккал/сут/кг, соответствующая данным литературных источников [19]. Известно, что при развитии острой экзогенной гипоксии любые мероприятия, направленные на некритическое ограничение потребления тканями О2 способствует сохранению базового уровня активности энергетических процессов, особенно в жизненно важных органах [12, 16]. При этом возможности организма по экономии кислородных ресурсов могут быть реализованы различными способами. Так, есть мнение, что О2-сбережение может осуществляться на клеточном уровне посредством ограничения процессов нефосфорилирующего окисления, вплоть до полного их прекращения за счёт подавления кис-лородзависимого микросомального окисления [9]. В частности, представлены доказательства способности аминотиоловых антигипоксантов (гутимин, амтизол) при развитии гипоксии ингибировать активность кислородзависимой монооксигеназной системы микросом печени. Эффект был продемонстрирован в опытах на мышах, выполненных по методике «гексеналовый сон» [9, 20]. С учетом этого не исключено, что вещество πQ1983, обладая в сравнении с амтизолом более выраженным антигипоксическим действием, также способно тормозить активность ферментной системы микросом, что в конечном счёте может приводить к снижению расходов О2 в кислородзависимых биохимических реакциях. В итоге подавление антигипоксантами монооксигеназной системы предоставляет возможность митохондриальному компартменту клетки с ещё большим успехом доминировать в борьбе за О2 [17]. В связи с этим представляет определённый интерес гипотеза А. В. Евсеева (2007) [5]. Автор в опытах по изучению влияния металлокомплексного соединения аминотиоловой структуры πQ1104 (комплексо-образователь - Zn2+) на процессы окислительного фосфорилирования в митохондриях головного мозга крыс обнаружил факты, подтверждающие прямое угнетающее действие вещества на дыхание митохондрий. По предположению А. В. Евсеева, наиболее вероятной точкой реализации антигипоксического действия вещества πQ1104 в дыхательной цепи митохондрий мог служить её цитохромный фрагмент. Последнее подтверждается данными других авторов, в соответствии с которыми Zn2+ существенно ограничивает объёмы электронных потоков в области цитохромов дыхательной цепи на участке b-c [7, 18, 21]. Указанный феномен способен заметно повысить экономичность процессов окислительного фосфори-лирования, что может затруднить процесс оперативного использования внутриклеточных резервов О2, в первую очередь за счёт предупреждения чрезмерно быстрого окисления митохондриями НАД-зависимых субстратов [18, 21]. В частности, присутствие Zn2+ в составе молекулы металлокомплекса способно при развитии острой гипоксии ограничить фазную активацию НАД-зависимого окисления в митохондриях энергоёмких органов и тканей, что позволяет существенно отдалить наступление её терминальной стадии. Так как вещество πQ1983 в составе молекулы тоже содержит Zn2+ и, подобно соединению πQ1104, является металлокомплексным соединением, представленный гипотетический механизм действия может иметь место в ходе реализации антигипоксического эффекта данного вещества при развитии острой экзогенной гипоксии. Таким образом, полученные результаты, в соответствии с которыми вещество πQ1983 продемонстрировало способность существенно замедлять скорость потребления животными кислорода на фоне снижения стандартного энергетического обмена, позволяют с большой вероятностью предположить, что в условиях остро формирующегося гипоксического 25 Экологическая физиология Экология человека 2015.01 состояния экзогенной природы защитный эффект указанного соединения осуществляется благодаря его способности ограничивать потребление организмом энергии из базовых источников. В первую очередь это должно касаться кислородных ресурсов, используемых тканями для реализации реакций быстрой адаптации к острой гипоксии.

About the authors

D V Sosin

Smolensk State Medical Academy

Email: sosina-67@yandex.ru
Smolensk

A V Yevseyev

Smolensk State Medical Academy

Smolensk

V A Pravdivtsev

Smolensk State Medical Academy

Smolensk

E A Parfenov

Russian Oncological Scientific Center named after N. N. Blokhin

Moscow, Russia

References

Supplementary files