APPLICATION OF GENETIC CRITERIA IN THE OCCUPATIONAL SELECTION OF LABOUR RESOURCES FOR THE OIL FIELDS OF SIBERIA

Full Text

В ранее проведенных нами исследованиях было показано [6], что у некоторых рабочих-нефтяников, занятых в сфере нефтедобычи вахтовым режимом труда, повышен уровень цитогенетических нарушений (микроядерный тест), при этом было высказано предположение о том, что нефть обладает генотоксическим действием. В то же время имеется мнение о том, что возникновение такого рода изменений в организме рабочих-нефтяников обусловлено в первую очередь экстремальными условиями труда на севере Сибири [7]. Исследования, проведенные рядом ученых [15, 18], позволили доказать, что нефть и ее дериваты обладают выраженными мутагенным и канцерогенным эффектами. Нефть влияет на структуру нуклеиновых кислот, состав и содержание свободных нуклеотидов. У лиц, контактирующих с нефтепродуктами, происходят изменения в первичной структуре ДНК эпителия полости рта, бронхов и легких. Наряду с этим установлен генетический полиморфизм чувствительности людей к канцерогенному и мутагенному действию некоторых компонентов нефти [15, 17, 18]. Особое внимание в этой связи привлекает ген фермента биотрансформации ксенобиотиков GSTM1. Локус GSTM1 имеет нефункциональный (делетированный) нулевой аллель [15]. Установлено значительное превышение частоты гомозигот по делеции гена GSTM1 при хронических респираторных заболеваниях, обнаружена связь между нулевым генотипом гена GSTM1 и предрасположенностью к раку полости рта и легкого [13, 15]. Среди работ, посвященных изучению гена GSTM1, довольно большое место отводится исследованиям групп рабочих, подвергающихся воздействию различных мутагенов антропогенного происхождения. В ряде работ выявлена четкая ассоциация между нулевыми вариантами гена GSTM1 и уровнем потенциальных мутагенов, экскретирующихся с мочой, и установлено, что дефицит фермента GSTM1 может быть фактором риска по причине повышенной чувствительности к химическим веществам у рабочих производств некоторых нефтепродуктов [ 17]. Из миграционных форм нефти наибольшую опасность представляют водорастворимые компоненты [10, 11]. Представителем этой группы служит бенз(а)пирен. Очевидно, что повышенная мутагенная чувствительность к генотоксическому действию нефти для рабочих-нефтяников является неблагоприятным прогностическим признаком состояния их здоровья и это необходимо учитывать в процессе профессионального отбора персонала для работы на нефтепромыслах. В связи с вышеизложенным целью настоящей работы является исследование уровня цитогенетических нарушений (микроядерный тест) в эпителиоцитах буккального эпителия полости рта с одновременным определением уровня полиароматического углеводорода бенз(а)пирена в моче у рабочих-нефтяников севера Сибири, в зависимости от нали- Обследованы 225 мужчин, работающих на нефтепромыслах севера Томской и Тюменской областей. Установлено повышение числа буккальных эпителиоцитов с микроядрами и уровня бенз(а)-пирена в моче рабочих, занятых в процессах нефтедобычи. Особенно существенные изменения по регистрируемым показателям были у лиц, имеющих мутантные аллели гена GSTM1, при этом наиболее часто наблюдались клетки с микроядрами больших (более 3 мкм2) размеров. Установлена корреляционная зависимость между уровнем клеток с микроядрами и выделением с мочой бенз(а)пирена. Повышенный уровень мутационного процесса, выявленный при обследовании рабочих-нефтяников, является, по-видимому, результатом суммарного действия различных факторов на геном человека. При этом речь идет не только о воздействии заведомых мутагенов, но и факторов комутагенной природы. Результаты исследования позволяют сделать также вывод о настоятельной необходимости введения новых научно обоснованных критериев отбора персонала на нефтепромыслах севера Западной Сибири, существенную роль в котором могут сыграть данные генотипирования. Ключевые слова: эпителиоциты, микроядра, нефтяники, ген GSTM1, бенз(а)пирен в моче 3 Экология труда Экология человека 2013.10 чия или отсутствия в их генотипе мутантных аллелей гена GSTM1. Методы Обследованы 118 мужчин, непосредственно участвующих в процессах добычи нефти на нефтепромыслах севера Томской и Тюменской областей. Настоящая работа проведена в марте — июне 2010 года, при этом были обследованы только те лица, которые подписали добровольное информированное согласие относительно определения у них в клетках эпителия цитогенетически аномальных клеток (микроядерный тест), уровня бенз(а)пирена в моче и мутантных форм гена GSTM1. Во всех случаях обследованы рабочие, занятые выполнением современных видов вахтового механизированного физического труда на нефтепромыслах севера Западной Сибири. Контрольной группой (контроль) послужили 107 сотрудников административно-хозяйственного аппарата нефтепромыслов, непосредственно не контактирующих с процессами нефтедобычи. Возраст рабочих-нефтяников составил (38,6 ± 5,4) года, а административно-хозяйственного персонала — (39,0 ± 4,2). Согласно данным анкетного опроса и медицинских карт все обследованные лица в течение года не подвергались рентгенографическим процедурам и не болели вирусными инфекциями. У всех образцы мочи были получены в конце рабочей смены. В моче был определен уровень бенз(а)пирена методом люминесцентной фотометрии на анализаторе ФЛЮОРАТ-92-2М [14]. Кроме того, из буккально-го эпителия полости рта были изготовлены мазки эпителиоцитов. После фиксации по методу Карнуа мазки окрашивали красителем Романовского — Гимза и анализировали на предмет присутствия клеток с микроядрами согласно методике и критериям, описанным ранее [4]. Одновременно из осадка клеток была получена ДНК, в которой нами было проведено исследование наличия мутации в гене GSTM1. В амплификационную пробу вносили праймеры. Разделение продуктов амплификации гена GSTM1 проводили в горизонтальном 3 % агарозном геле, приготовленном на однократном трис-боратном буфере с добавлением бромистого этидия и визуализацией в проходящем ультрафиолетовом свете. Напряженность электрического поля при разделении фрагментов ДНК составляла 1—8 В/см. Нормальные аллели генов характеризуются присутствием ПЦР-продуктов GSTM1: гомозиготы GSTM1 +/+ и гетерозиготы GSTM1 +/0. Делеционные (нулевые) гомозиготные варианты (GSTM1 0/0) выявлялись по отсутствию фрагментов GSTM1. Генотип 0/0 означает отсутствие на электрофореграмме фрагмента, соответственно и данный индивидуум гомозиготен по делеции. Значок « + » свидетельствует о присутствии фрагмента, и данный донор либо гетерозиготен, либо гомозиготен по отсутствию делеции в указанных генах. Препараты мазков буккального эпителия анализировали при помощи светового микроскопа («Reichert GIM-358», Австрия), оснащенного бинокуляром и цифровой фотокамерой «Casio QV-100» (Япония). Полученные изображения переносили в программу «QV-Link», поставляемую вместе с фотокамерой. Анализ размеров микроядер в клетах буккального эпителия проводили с использованием программы «ImageJ» («Wayne Rasband», США). У каждого обследованного просматривали не менее 10 000 интерфазных клеток согласно критериям, представленным ранее [4]. Статистическую обработку осуществляли с использованием пакета статистических программ STATISTICA v.6.0, BIOSYS-2, Microsoft Access, BIOSTAT (Primer of Biostatistic version 4.03). Частоты гаплотипов сцепленных локусов для гена GSTM1 рассчитывали в программе «The EH software program, Rockefeller University, NY». Все количественные показатели исследования обрабатывали с применением t-критерия Стьюдента для независимых выборок, поскольку тестирование закона распределения при помощи критерия Колмогорова — Смирнова не выявило отличий от нормального. Анализ статистических различий качественных признаков производили с использованием теста х2 с поправкой Йейтса на непрерывность [ 1]. Различия сравниваемых результатов (X ± m, где X — выборочное среднее арифметическое, m — ошибка среднего арифметического) считались статистически значимыми при достигнутом уровне значимости p < 0,05. Результаты Как свидетельствуют полученные нами данные (табл. 1), число эпителиоцитов буккального эпителия полости рта, содержащих микроядра, в контроле (административно-хозяйственный персонал нефтепромыслов) практически не отличалось у лиц с мутантным и «нормальным» генотипами по гену GSTM1 : (1,6 ± 0,2) и (2,3 ± 0,6) % соответственно (p = 0,160). В то же время у рабочих-нефтяников различия были более существенны (p < 0,001). Кроме этого у рабочих с генотипом GSTM1 0/0 число эпителиоцитов Таблица 1 Частота эпителиоцитов буккального эпителия (%) полости рта с микроядрами у лиц с различными аллельными вариантами гена GSTM1, работающих на нефтепромыслах севера Сибири Обследованная когорта Количество эпителиоцитов с микроядрами (в %) в зависимости от генотипа обследуемого по гену GSTM1 0/0 +/ + и 0/+ p Административнохозяйственный персонал (контроль) 2,3±0,6 1,6±0,2 0,160 сь 6 II « 7 4 II « Рабочие-нефтяники 6,8±0,8* п=28 3,6±0,3* п=90 <0,001 p <0,001 <0,001 Примечание. Статистически значимые отличия опыта от контроля отмечены звездочкой, а отличия результатов у лиц с гомозиготным нулевым генотипом от результатов лиц с генотипами (+/+) и (0/+) - чертой. 4 Экология труда 8° % 70 -60 • 50 -40 -30 ■ □ Административнохозяйственный персонал (контроль) ШРабочие-нефтяники Экология человека 2013.10 Более| I От 1 до Менее Более От 1 до Менее 3 мкм2 3 мкм2 1 мкм2 3 мкм2 3 мкм2 1 мкм2 “ [ Генотип GSTM1 (0/0) Генотип GSTM1 (+/+) и (0/+) с микроядрами превышало контрольный уровень практически в 3 раза (p < 0,001). Статистически значимые отличия отмечены и в отношении «нормального» генотипа (p < 0,001). Анализ размеров регистрируемых микроядер показал (рисунок), что у рабочих-нефтяников с мутантным генотипом преимущественно наблюдаются крупные микроядра, при этом число мелких микроядер было резко снижено. В остальных случаях встречаемость микроядер с площадью более 3 мкм2, от 3 до 1 мкм2 и менее 1 мкм2 практически не различались (p = 0,180). Определение уровня бенз(а)пирена в моче (табл. 2) показало превышение этого показателя у рабочих-нефтяников по сравнению с контролем в 6-8 раз. Особенно повышен был данный показатель у рабочих-нефтяников с мутантным генотипом. Таблица 2 Уровень бенз(а)пирена в моче (нг/л) у лиц с различными аллельными вариантами гена GSTM1, работающих на нефтепромыслах севера Сибири Обследованная Уровень бенз(а)пирена в моче (нг/л) в зависимости от генотипа обследуемого по гену GSTM1 0/0 +/+ и 0/+ p Административнохозяйственный персонал (контроль) 1,8±0,3 п=60 1,1±0,2 п=47 0,028 Рабочие-нефтяники 11,3±0,7* п=28 8,6±0,5* п=90 0,003 p <0,001 <0,001 Примечание. Статистически значимые отличия опыта от контроля отмечены звездочкой, а отличия результатов у лиц с гомозиготным нулевым генотипом от результатов лиц с генотипами (+/+) и (0/+) - чертой. Корреляционный анализ позволил установить статистически значимую прямую связь между уровнем выделяемого с мочой бенз(а)пирена и числом клеток с микроядрами (p < 0,001) только в группе рабочих- Количество эпителиоцитов (%) с различными размерами микроядер в буккальном эпителии полости рта у лиц с различными аллельными вариантами гена GSTM1, работающих на нефтепромыслах севера Сибири нефтяников. В других случаях такой закономерности не наблюдалось (табл. 3) Таблица 3 Корреляционный анализ при сравнении уровня бенз(а)пирена в моче и числа эпителиоцитов с микроядрами у лиц с различными аллельными вариантами гена GSTM1, работающих на нефтепромыслах севера Сибири Обследованная когорта Генотип по гену GSTM1 Коэффициент корреляции (г) при сравнении показателей микроядер-ного теста и уровня бенз(а)пирена в моче p Административнохозяйственный персонал (контроль) 0/0 0,08 0,630 +/+ и 0/+ 0,06 0,810 Рабочие-нефтяники 0/0 0,56* <0,001 +/+ и 0/+ 0,12 0,600 Примечание. Статистически значимые коэффициенты корреляции отмечены звездочкой. Обсуждение результатов Таким образом, полученные результаты исследования свидетельствуют, что у рабочих нефтепромыслов, основную массу которых составили бурильщики, непосредственно контактирующие с нефтью, статистически значимо повышен уровень клеток с микроядрами в буккальном эпителии полости рта, что не отмечено в контроле у лиц административно-хозяйственного персонала. Наличие у рабочего-нефтяника мутантной формы гена биотрансформации ксенобиотиков GSTM1 существенно увеличивает число эпителиоцитов с микроядрами, одновременно с этим у них повышенным является и уровень выделяемого с мочой бенз(а)пирена. Корреляционный анализ позволяет сделать заключение, что имеется статистически значимая прямая зависимость между этими показателями. По-видимому, возрастание числа эпителиоцитов с микроядрами является следствием повышеного содержания в организме поступающего бенз(а)пирена в условиях нефтепромыслов 5 Экология труда Экология человека 2013.10 севера Сибири. В научной литературе имеются данные, свидетельствующие о том, что нулевые генотипы по глутатион^-трансферазе (ген GSTM1) ассоциированы с более высоким уровнем хромосомных аберраций [2, 20]. Полученные нами данные подтверждают это заключение в отношении нулевого генотипа GSTM1. Рабочие с нулевым генотипом GSTM1 были особо чувствительны к генотоксическим факторам условий нефтедобычи. Анализ этнической принадлежности вахтовых рабочих-нефтяников свидетельствует о том, что среди них преобладают лица угро-финской группы народов или метисы угро-финской и славянкой (в основном русские) групп. Согласно литературным данным, если среди русских количество лиц с нулевым (мутантным) генотипом по этому гену составляет 42,6-46,2 %, то среди удмуртов, мордвы, чувашей (угро-финская группа), составляющих более 38 % всех вахтовых рабочих-нефтяников этого региона, частота таких индивидуумов достигает 61,3 % [19, 20]. Число рабочих-нефтяников на нефтепромыслах Западной Сибири с нулевым генотипом GSTM1, по нашим данным, составило 23,7 %, в то же время в контрольной группе их было существенно больше -56,0 %. Поскольку нулевой генотип по этому гену существенно увеличивает вероятность возникновения ряда серьезных заболеваний [2, 19], то не исключено наличие на нефтепромыслах отрицательной «селекции» лиц с таким генотипом. Так, анализ рабочего стажа на нефтепромыслах Сибири показал, что число рабочих-нефтяников с нулевым генотипом GSTM1 в случаях наличия стажа от 1 до 3 лет особенно велико (46,2 %) и этот показатель снижается практически в 3 раза (15,3 %) в группе лиц, проработавших на нефтедобыче более 10 лет. Анализ величины микроядер, проведенный с помощью компьютерной программы IMAGE-6, позволил выявить определенную закономерность. У рабочих большая часть микроядер имеет площадь более 3 мкм2, а в контрольной когорте клетки с такими микроядрами наблюдались статистически значимо реже (p < 0,001). Известно, что крупные микроядра образуются в основном из отставших хромосом, а мелкие из их фрагментов хромосом и они формируются в процессе деления клеток [3, 4]. Зачастую образование крупных микроядер - это результат разрушения нитей ахроматинового аппарата деления клеток. Возрастание числа анеуплоидных клеток отмечается при действии некоторых токсических углеводородов, входящих в состав нефти и нефтепродуктов [15], что связывают с их деполимеризацией нитей ахроматинового веретена деления клеток [3, 14]. Об этом же, по-видимому, свидетельствуют полученные нами данные относительно уровня выделяемого с мочой бенз(а)пирена, обладающего выраженным кластогенным действием [13, 15]. Имеются исследования [19, 20], показывающие генотоксическую роль курения. При этом установлено, что особенно существенные цитогенетические изменения наблюдаются у курильщиков именно с нулевым генотипом GSTM1 [16]. В наших исследованиях анализ числа курящих и некурящих свидетельствует, что их частота практически одинакова в обследованных группах доноров и колеблется в пределах 38,2-40,4 %. В то же время действительно уровень цитогенетических нарушений у лиц с нулевым генотипом GSTM1 у курильщиков был статистически значимо выше (р = 0,034), чем у некурящих. Повышение числа цитогенетических нарушений у рабочих-нефтяников может быть связано также с повышенным радиоактивным фоном в местах нефтедобычи. В своей работе Н. И. Березин и Д. О. Горбачев [9] подчеркивают, что при добыче нефти с пластовыми водами извлекаются нефтешламы с высоким содержанием радионуклидов уранового и ториевого ряда, кроме того, для контроля целостности трубопроводов на предприятиях нефтегазого комплекса широко применяются методы рентгеновской и радионуклидной дефектоскопии, что может приводить к облучению персонала дозами, превышающими предельно допустимые уровни. Наряду с этим следует отметить, что северные районы Тюменской и Томской областей неоднократно накрывали радиоактивные осадки в результате атомных испытаний на Новоземельском полигоне и имеются свидетельства радиоактивности ягеля и мяса оленей [5, 8, 12], что также может приводить в клетках человека к возникновению аберраций хромосомного типа и о чем свидетельствуют результаты цитогенетического обследования коренных народов севера Сибири [5]. Несомненно, что в экстремальных условиях нефтедобычи на севере Западной Сибири имеется множество факторов, которые могут оказывать как мутагенное, так и ко-мутагенное действие на генетический аппарат человека. Помимо антропогенных это и природные факторы: низкие температуры, мощные геомагнитные поля авроральной зоны, геомагнитные аномалии, особенности светового режима (полярные ночь и день) и дефицит некоторых жизненно важных микроэлементов [10]. Выводы 1. Установлено, что при наличии в генотипе человека, работающего вахтовым режимом труда на севере Сибири, делетированной (нулевой) формы аллеля гена GSTM1 наблюдается увеличение в буккальном эпителии полости рта числа клеток с микроядрами, возникающими в результате аномалий в расхождении хромосом при делении клеток, при этом в моче у этих лиц наблюдается высокий уровень бенз(а)пирена, обладающего выраженным мутагенным действием. 2. Повышенный уровень цитогенетических нарушений, выявленный при обследовании рабочих-нефтяников, является, по-видимому, результатом суммарного действия различных факторов на генетический аппарат человека. При этом речь идет не только о воздействии компонентов нефти, обладающих мутагенным действием, но и о разнообразных факторах как природного, так и антропогенного происхождения, характерных для севера Сибири. 6 Экология человека 2013.10 Экология труда 3. Результаты исследования позволяют сделать также вывод о настоятельной необходимости введения новых научно обоснованных критериев отбора персонала на нефтепромыслах Западной Сибири, существенную роль в котором должны сыграть данные генотипирования по генам системы биотрансформации ксенобиотиков, в частности по GSTM1.

About the authors

E V Yamkovaya

Siberian State Medical University

N N Ilyinskikh

Siberian State Medical University; Tomsk State University

Email: ilyinskikh@yandex.ru

I N Ilyinskikh

Siberian State Medical University

E N Ilyinskikh

Siberian State Medical University

References

Supplementary files