Complex study of the vaporous ammonia influence on the morphofunctional status of the female rats organism

Full Text

Библиографическая ссылка: Беляев Н. Г., Ржепаковский И. В., Писков С. И. Комплексное исследование влияния паров аммиака на морфофункциональное состояние организма самок крыс // Экология человека. 2019. № 8. С. 4-11. Belyaev N. G., Rzhepakovsky I. V., Piskov S. I. Complex Study of the Vaporous Ammonia Influence on the Morphofunctional Status of the Female Rats Organism. Ekologiya cheloveka [Human Ecology]. 2019, 8, pp. 4-11. Организм - это открытая система, находящаяся в постоянном контакте с окружающей средой, качество которой во многом определяет его гомеостатические параметры. В связи с этим из года в год не перестает быть актуальным всестороннее исследование морфофункционального состояния систем организма человека и животных в изменяющихся условиях техногенных факторов. В частности, воздействия соединений азотной группы, выступающих одними из самых распространенных органических загрязнителей [16]. 4 Экология человека 2019.08 Экологическая безопасность Основным контингентом, подверженным неблагоприятному воздействию таких веществ, являются работники химической промышленности и сельского хозяйства [7, 11]. При этом более половины производств - это предприятия, применяющие и производящие аммиак [9]. Аммиак - это агрессивный газ, который хорошо растворяется в воде, легко проникает в кровь и воздействует на различные органы [26]. Поэтому комплексная оценка влияния данного вещества на организм сегодня становится важным аспектом в прогнозировании и предупреждении различных патологий. В особенности это важно для женского организма, физиологические системы которого, в частности репродуктивная, считаются чувствительными к токсическому воздействию различных веществ. Изучению продолжительного воздействия на организм фоновых и предельно допустимых концентраций загрязняющих веществ не всегда уделялось должное внимание. Сегодня интерес к этой теме возрос в связи с появлением данных [3, 14] о негативном влиянии низких доз органических загрязнителей на организм и экспериментальных доказательств, указывающих на необходимость пересмотра утвержденных предельно допустимых концентраций токсических веществ в частности для воздуха рабочих зон [23]. Что касается аммиака, то сегодня имеются сведения в основном о воздействии его высоких (токсичных и субтоксичных) доз на морфофункциональное состояние организма. К примеру, изучена острая токсичность и повреждение легких и бронхов после ингаляции высоких доз аммиака у крыс [21, 22]. Дана сравнительная оценка сенсорного раздражения дыхательных путей у белых крыс газообразным аммиаком в высоких концентрациях от 92 до 1 243 мг/м3 при различной влажности атмосферного воздуха [27]. Установлено, что пары аммиака в концентрациях, в несколько раз превышающих предельно допустимые, вызывают некроз, апоптические реакции и дегенеративные изменения печени, сопровождающиеся изменением уровня ферментативных параметров крови у крыс [24]. При этом доступных сведений о хроническом влиянии паров аммиака в низких и предельно допустимых дозах, выступающих фоновыми концентрациями для химических производств, на системы органов человека и животных практически нет. Интерес изучения вызван также эколого-реги-ональными особенностями Северо-Кавказского федерального округа. Только на территории Ставропольского региона осуществляют свою деятельность более 400 больших и малых предприятий и организаций, имеющих стационарные источники загрязнения, основным лидером среди которых выступает «Невинномысский Азот» - химическое предприятие, входящее в группу «ЕвроХим» и занимающее первое место в России по выпуску азотных удобрений и четвертое по производству аммиака. К тому же в соответствии с долгосрочным прогнозом развития химической отрасли до 2030 г. перед предприятием поставлены задачи обеспечения запроса на новые высокотехнологичные материалы со стороны строительства, машиностроения, медицины и внедрения инновационных технологий производства новых видов удобрений [5]. Это, несомненно, повлечет за собой нагрузку на предприятие, его расширение и увеличение рабочего штата. В связи с вышесказанным целью исследования являлось изучение на экспериментальной модели хронического воздействия паров аммиака предельно допустимой концентрации для воздуха рабочей зоны на морфофункциональное состояние самок крыс. Задачи исследования: 1) оценка влияния паров аммиака на основные гематологические показатели лабораторных животных; 2) оценка по гормональному статусу и морфометрическим параметрам внутренних половых органов состояния репродуктивной системы самок крыс, подверженных затравке аммиаком; 3) определение влияния газообразного аммиака на структуру костной ткани животных. Методы Опыты выполнены на 30 самках крыс линии Wistar, которые были введены в эксперимент в возрасте 2,5 месяца с начальной массой 70-85 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария в контролируемых условиях окружающей среды (температура 18-22 °C, относительная влажность воздуха 50-65 %), где поддерживался 12-часовой цикл освещения. Крысы находились на стандартном пищевом рационе при свободном доступе к корму и воде. В соответствии с целью исследования животные случайным образом были разделены на две группы по 15 крыс в каждой. Опытную группу составили животные, подвергавшиеся ингаляционному воздействию паров аммиака на протяжении 45 суток по 2 часа в день. Животные контрольной группы находились в обычной воздушной среде. Затравку животных парами аммиака осуществляли модифицированным камерным методом в динамическом режиме, т. е. с обеспечением принудительного притока и оттока воздуха. Внутри камеры находился тигель с перфорируемой крышкой, обеспечивающей постепенное испарение 25 % водного раствора аммиака и поддержание его в дозе 20 мг/ м3, соответствующей предельно допустимой концентрации в воздухе рабочей зоны [5, 15]. После окончания эксперимента животных взвешивали и выводили из опыта путем декапитации под эфирным наркозом. Оценка параметров форменных элементов крови проводилась с использованием автоматического гематологического анализатора «Medonic-M20C» (Boule Medical AB, Швеция). Определение концентраций фоликулостимулирующего гормона (ФСГ) и лютеинизирующего гормона (ЛГ), тестостерона, эстрадиола осуществлялось в плазме крови методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием анализатора «Униплан АИФР-01» (Россия) и соответствующих наборов для лабораторной диагностики крыс «Rat Elisa Assay Kit». 5 Экологическая безопасность Экология человека 2019.08 Забор крови для исследований производился в фазу проэструса эстрального цикла крыс, определяемую общепринятым кольпоцитологическим методом [1]. Плазму крови получали с помощью центрифуги с опцией охлаждения MicroCL 17R (Thermo, США) при 3 000 оборотах в течение 10 минут. Патоморфологическому исследованию, а именно морфометрии, подлежали внутренние половые органы и надпочечники. Яичники и матку извлекали единым комплексом с окружающей жировой тканью и тщательно препарировали. Массу органов измеряли с помощью прецизионных весов ML203E (Mettler Toledo, Китай) с точностью до 1 мг. Размеры органов определяли с использованием электронного штангенциркуля ШЦЦ-П-250-0,01 -60 (КРИН, Россия) с точностью измерения до 0,01 мм. Оценка минеральной плотности и структуры костной ткани животных проводилась ex vivo на отобранных при вскрытии бедренных костях. Исследование проводилось с использованием компьютерного рентгеновского микротомографа SkyScan 1176 (Bruker-microCT, Бельгия). Процедура сканирования осуществлялась в соответствии с официальными рекомендациями производителя [https://www.bruker. com/products/microtomography/academy/academy. html]. Полимерные диски (плотностью 0,25 и 0,75 г/см3 гидроксиапатита) использовались в качестве эталонных стандартов для определения относительной плотности и сканировались при тех же параметрах, что и бедренные кости крыс [17]. Сканированные бедренные кости крыс реконструировали с помощью компьютерной программы Nrecon (1.7.1.0, Bruker-microCT, Бельгия). Анализ данных, визуализация, определение структуры, минеральной плотности кортикальной и трабекулярной областей бедренных костей проводили с использованием программы CTAn (1.13.11.0, Bruker-microCT, Бельгия) [18, 19]. Все манипуляции с животными выполнялись согласно основным этическим принципам в сфере биоэтики, которые изложены в «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей», а также в соответствии с рекомендациями «О правовых, законодательных и этических нормах и требованиях при выполнении научных морфологических исследований» [8, 20]. Полученные количественные данные обрабатывали с помощью методов вариационной статистики с использованием статистических пакетов Statistics for Windows v.6.0 и Biostat (version 4.03). Для оценки статистической значимости различий между выборками применялся t-критерий Стьюдента при нормальном распределении переменных и критерий Манна - Уитни в случае отсутствия согласия данных с нормальным распределением. Полученные результаты фиксировали в виде среднего арифметического ± стандартная ошибка среднего арифметического (M ± m). О достоверности различий величин исследуемых показателей судили при Р < 0,05. Результаты Согласно полученным результатам в контрольной группе средняя масса тела животных с (78,4 ± 1,9) г на момент начала эксперимента увеличилась до (250,3 ± 4,2). В опытной группе исходная масса тела (79,2 ± 1,3) г за аналогичный период возросла до (175,4 ± 2,6) г, что указывает на выраженное статистически значимое (Р < 0,001) отставание в темпах увеличения массы тела крыс опытной группы. Средние значения параметров красной крови у животных экспериментальных групп также имели значительные отличия. Опытная группа проявилась увеличением количества эритроцитов, ростом гематокрита, снижением объема эритроцитов и всех количественных показателей гемоглобина (табл. 1). Таблица 1 Уровень эритроцитарных параметров и показателей гемоглобина у животных контрольной и опытной групп на время окончания эксперимента, М ± m Параметр Контрольная группа Опытная группа Р Общая концентрация эритроцитов, 1012/л 5,7±0,3 7,4±0,2 <0,001 Средний объем эритроцита, мкм3 55,5±0,7 52,7±0,1 <0,001 Ширина распределения эритроцитов в % 12,9±0,8 14,2±0,2 0,141 Ширина распределения эритроцитов в абсолютном значении, мкм3 30,4±0,8 31,5±0,15 0,233 Гематокрит, % 40,5±1,5 48,7±2,8 0,015 Концентрация гемоглобина, г/л 149,3±5,2 114,0±7,1 <0,001 Среднее содержание гемоглобина в эритроците, пг 20,2±0,2 18,1±0,2 <0,001 Средняя концентрация гемоглобина в эритроците, г/л 360,1±4,1 350,5±1,5 0,036 Примечание. Здесь и в табл. 2: P - значимость отличий по сравнению с данными контрольной группы. При анализе тромбоцитарных параметров крови животных в опытной группе по сравнению с контрольной было зарегистрировано значительное увеличение общей концентрации тромбоцитов при снижении их среднего объема (табл. 2). Таблица 2 Уровень тромбоцитарных параметров крови животных контрольной и опытной групп на время окончания эксперимента, М ± m Параметр Контрольная группа Опытная группа Р Общая концентрация тромбоцитов, 109/л 410,0 ± 15,0 746,0 ± 28,6 < 0,001 Средний объем тромбоцита, мкм3 6,4 ± 0,1 6,0 ± 0,1 0,021 Ширина распределения тромбоцитов, мкм3 8,5 ± 0,2 8,2 ± 0,1 0,209 Тромбокрит, % 0,54 ± 0,1 0,43 ± 0,1 0,502 Макротромбоциты, % 5,1 ± 0,8 4,9 ± 0,5 0,833 6 Экология человека 2019.08 Экологическая безопасность Рис. 1. Морфометрические показатели матки крыс на момент окончания эксперимента Статистически значимым оказалось и различие в средних величинах общего количества лейкоцитов в крови крыс исследуемых групп. В контрольной группе этот показатель насчитывал (7,3 ± 0,2) х 109/л, в опытной составил (8,6 ± 0,3) х 109/л (P = 0,002). Масса сердца к моменту окончания эксперимента в контрольной группе составила (0,63 ± 0,02) г на 100 г живой массы тела, а у животных, подвергавшихся ингаляционной затравке парами аммиака, - (0,78 ± 0,01) г на 100 г живой массы тела (Р < 0,001). В процессе морфометрии органов репродуктивной системы самок крыс выявлено статистически значимое отставание средних линейных размеров тела матки и правого и левого рогов матки в опытной группе по сравнению с контрольной на 36,5 % (P < 0,001) и на 36,7 % (P < 0,001) соответственно. Аналогичная динамика показателей регистрировалась и при оценке массы - уменьшение на 47,0 % (P < 0,001) (рис. 1). Статистически значимые отличия зарегистрированы и для массы надпочечников. У самок крыс контрольной группы средняя масса левых надпочечников составляла (8,9 ± 0,5), правых - (7,6 ± 0,4) мг на 100 г живой массы тела, в опытной группе (12,6 ± 0,8) (P < 0,001) и (10,8 ± 0,2) мг на 100 г (P < 0,001) соответственно. Гормональный статус крови самок крыс контрольной группы в динамике 0-45 дней не проявился статистически значимыми изменениями его показателей и характеризовался лишь некоторой тенденцией к увеличению уровня ФСГ и эстрадиола, что является закономерным изменением, характерным для возраста задействованных в эксперименте животных (рис. 2). Гормональный статус самок крыс опытной группы после 45-дневной затравки парами аммиака характеризовался статистически значимым увеличением на 52,8 % концентрации в крови тестостерона (P < 0,001) и снижением на 27,5 и 11,2 % уровня эстрадиола (P < 0,001) и ФСГ (P = 0,028) соответственно. Согласно микротомографическим данным бедренных костей животные опытной группы характеризовались более низкими величинами как трабекулярной, так и кортикальной минеральной плотности кости. К концу эксперимента минеральная плотность трабекулярного отдела костей крыс контрольной группы составила (0,27 ± 0,03) г/см3 и более чем в 2 раза превышала таковую в опытной группе животных (0,13 ± 0,01) г/см3 (P < 0,001). Минеральная плотность кортикальной части составила (1,24 ± 0,01) и (1,17 ± 0,01) г/см3 (P < 0,001) соответственно. В бедренных костях самок крыс опытной группы наблюдались изменения рентгеноструктуры по Рис. 2. Динамика гормонального статуса самок крыс в условиях затравки парами аммиака 7 Экологическая безопасность Экология человека 2019.08 сравнению с контрольной группой. Уменьшилось количество трабекул, увеличилось расстояние между ними (рис. 3). Рис. 3. Уменьшение доли трабекул в эпифизарной зоне бедренной кости крыс в условиях затравки парами аммиака. (А) Контрольная группа. (Б) Опытная группа (рентгеновская микротомография бедренных костей крыс. 30-модель) Доля трабекул к объему взятой для исследования зоны эпифизарной части бедренной кости в опытной группе составила (18,71 ± 0,8) %, у животных контрольной группы - (25,76 ± 1,7) % (P < 0,001). Средняя толщина трабекул составила (83,5 ± 0,5) и (108,0 ± 2,8) мкм (P < 0,001) соответственно. Обсуждение результатов Проведены исследования хронического воздействия предельно допустимой концентрации аммиака в воздухе рабочей зоны на морфофункциональное состояние организма самок крыс. Согласно полученным данным хроническая ингаляционная затравка самок крыс аммиаком в исследуемой дозе оказала угнетающее действие на темпы увеличения массы тела животных. Данный факт, вероятно, обусловлен способностью аммиака легко проникать через мембраны клеток и сдвигать в митохондриях реакцию, катализируемую глутамат-дегидрогеназой, в сторону образования глутамата. Уменьшение концентрации а-кетоглутарата вызывает угнетение обмена аминокислот и, как следствие, нарушение цикла Кребса, то есть гипоэнергетическое состояние организма. Ингаляционная затравка животных аммиаком сопровождалась увеличением концентрации эритроцитов и гематокрита крови. Подобный эффект, возможно, связан с повышением сродства гемоглобина с кислородом в присутствии ионов аммония NH4+ (эффект Бора). В результате отдача кислорода тка ням снижается, и клетки организма функционируют в условиях легкой гипоксии, что является стимулом к эритроцитозу. Низкие величины концентрации гемоглобина в крови, среднего содержания гемоглобина и средней концентрации гемоглобина в эритроците также выступают фактором, стимулирующим эритроцитоз в организме животных опытной группы. Высокое содержание общей концентрации эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов и, как результат, высокий гематокрит и ухудшение реологических свойств крови, возможно, также связаны и с потерей жидкости организмом, что регистрируется при попадании аммиака в организм. Известно, что в названных условиях возрастает нагрузка на кардиомиоциты. На первых этапах это способствует увеличению силы сокращения кардио-миоцитов и приводит к гипертрофии сердца. В связи с этим дополнительно проводилась оценка массы сердца экспериментальных животных, и было выявлено, что у животных, подвергавшихся затравке аммиаком, масса сердца увеличилась на 25 %. Длительное функционирование органа в таком режиме может привести к перенапряжению органа и развитию патологии. Следующим этапом работы являлось исследование морфофункционального состояния репродуктивной системы самок крыс, подвергавшихся затравке парами аммиака. Интерес к данной системе определяется тем, что в неблагоприятных условиях среды эта система одной из первых реагирует на действие повреждающих факторов изменением характера функционирования и структурными перестройками в клетках, тканях и органах полового аппарата. Эти свойства позволяют рассматривать репродуктивную систему как индикатор благополучия среды обитания. Зарегистрированное уменьшение линейных размеров и массы внутренних половых органов животных на фоне ингаляций аммиаком мы связываем с гипер-андрогенией. Это состояние может обеспечиваться как усилением функциональной активности надпочечников, так и изменением характера гормональной секреции яичников. Надпочечникам принадлежит ведущая роль в становлении адаптивных реакций, но при этом через гипоталамо-гипофизарно-адре-нокортикальную систему (ГГАКС) реализуются опосредованные влияния неблагоприятных факторов на репродуктивную систему [10, 13]. В настоящем исследовании подтверждением активности ГГАКС является выявленная гипертрофия надпочечников, позволяющая судить о степени их участия в формировании защитных механизмов к действию конкретного повреждающего фактора среды. Необходимо отметить, что влияние кортикостероидов на репродуктивную систему осуществляется как через центральные, так и через периферические звенья гипофизарно-яичниковой оси. Так, наряду с увеличением концентрации тестостерона в организме самок крыс, подвергавшихся затравке аммиаком, отмечалось и снижение концентрации ФСГ 8 Экология человека 2019.08 Экологическая безопасность Одним из факторов повышения концентрации тестостерона являются морфофункциональные изменения в яичниках, связанные с увеличением процента атрезирующих вторичных и третичных фолликулов [2]. В атрезирующих фолликулах снижается продукция эстрадиола, но сохраняется способность к секреции тестостерона. Высокий процент атрезирующих фолликулов в яичниках следует расценивать как одну из форм адаптивных реакций женского организма на длительно действующий неблагоприятный фактор. Следовательно, можно предположить, что регистрируемое увеличение концентрации тестостерона в организме самок крыс, подвергавшихся затравке аммиаком, является результатом изменения характера секреторной активности яичников, результатом гипертрофии надпочечников и соответственно увеличением их функциональной активности. Нельзя исключить и такой немаловажный фактор в отставании линейных размеров внутренних половых органов самок крыс опытной группы, как отрицательный перекрестный эффект адаптации [6]. Органы репродуктивной системы непосредственно не задействованы в адаптации к возмущающим факторам окружающей среды, соответственно в этих ситуациях будет отмечаться снижение их кровоснабжения и, как следствие, недостаточное поступление энергетического и пластического материала. При изучении морфофункционального состояния животных, подвергавшихся ингаляционной затравке аммиаком, оценивались изменения структуры костной ткани. Использование уникального метода компьютерной рентгеновской микротомографии позволило выявить снижение минеральной плотности как кортикального, так и трабекулярного отделов бедренной кости. В большей степени снижение минеральной плотности происходило в трабекулярном отделе кости. Полученные результаты сочетаются с данными [25], свидетельствующими об увеличении сывороточного кальция в крови у крыс в результате усиленной деминерализации кости в ответ на хронический ацидоз, вызванный пероральным применением высоких доз водного раствора аммиака. Полученные результаты, возможно, обусловлены изменениями гормонального статуса, который выступает мощным эндогенным фактором, определяющим морфофункциональное состояние скелета. Прежде всего это изменение соотношения эстрадиола и тестостерона. Снижение концентрации эстрадиола в женском организме, как правило, может иметь серьезные последствия для скелета, запуская патогенетические механизмы снижения минеральной плотности костной ткани. Нельзя исключить и непосредственное ингибирующее воздействие аммиака на белковый обмен. Учитывая, что трабекулярный отдел кости метаболически более активен, негативное воздействие экзогенного фактора в первую очередь будет проявляться именно в этом отделе. Таким образом, полученные данные демонстрируют, что ингаляционная затравка самок крыс парами аммиака в дозе, соответствующей предельно допустимой концентрации в воздухе рабочей зоны, сопровождается негативными изменениями в состоянии периферической крови, в содержании гонадотропинов и соотношении половых гормонов, гипоплазией органов репродуктивной системы, снижением минеральной плотности костей и разрежением трабекулярной костной структуры. Авторство Беляев Н. Г. внес существенный вклад в концепцию и дизайн исследования, обеспечил получение, анализ и интерпретацию данных результатов гематологических и гормональных исследований, подготовил первый вариант статьи и окончательно утвердил присланную в редакцию рукопись; Ржепаковский И. В. внес существенный вклад в концепцию и дизайн проведенного исследования, обеспечил получение, анализ и интерпретацию данных микротомографического исследования костей животных, участвовал в подготовке первого варианта статьи, окончательно утвердил присланную в редакцию рукопись; Писков С. И. внес существенный вклад в концепцию и дизайн исследования, обеспечил получение, анализ и интерпретацию данных патоморфологического исследования животных, участвовал в подготовке первого варианта статьи, окончательно утвердил присланную в редакцию рукопись.

About the authors

N. G. Belyaev

North-Caucasus Federal University

Stavropol, Russia

I. V. Rzhepakovsky

North-Caucasus Federal University

Stavropol, Russia

S. I. Piskov

North-Caucasus Federal University

Email: piskovsi77@mail.ru
Stavropol, Russia

References

Supplementary files