POLYMORPHISM OF AGT, AGT2R1 AND NOS3 GENES AS A RISK FACTOR FOR IMBALANCE IN VASOACTIVE FACTORS

Cover Page

Abstract


The aim of the study was to identify associations between allelic variants of AGT, AGT2R1 and NOS3 genes with production of endo-thelin-1 (ET-1) and nitric oxide (NO) in young residents of the Russian North without a history of cardiovascular diseases. Methods. The sample consisted of 286 young adults (116 females and 170 males) born in the Arkhangelsk region. Single nucleotide polymorphisms in the AGT, AGT2R1 and NOS3 genes were determined by polymerase chain reaction (PCR). Plasma NO oxide and ET-1 levels were measured. Results. T704C polymorphism in AGT gene was not associated with the studied vasoactive endothelial factors. However, vasoactive factors production in homozygotes with mutant T/T alleles of C521T polymorphism in the same gene is shifted towards vasoconstrictive factors. The level of ET-1 in the group with T/T genotype was higher than in the groups with C/T and C/C genotypes (p = 0.006 and p = 0.04, respectively). Homozygotes with mutant C alleles of AGT2R1 gene had higher concentration of ET-1 as compared to homozygotes with wild-type A alleles (p = 0.012). Young men with 786 C/C of NOS3 gene had higher plasma concentration of ET-1 than individuals with C/T (p = 0.01) and T/T (p = 0.07). ET-1 was higher in the group of girls homozygotes with mutant C alleles, however no statistically significant differences were found. Conclusions. Our results suggest that the risk of imbalance in vasoactive factors in young healthy residents of the Russian North is associated with the increase in ET-1 production level, but not with NO level. The presence of 521 T/T genotype in AGT gene, 1666C/C in AGT2R1 gene and -786C/C in NOS3 gene increases the risk of vasoactive factors imbalance development towards vasoconstriction.

Full Text

Одним из ведущих механизмов развития сердечно-сосудистых заболеваний в настоящее время рассматривают эндотелиальную дисфункцию, ранним предиктором которой является дисбаланс продукции вазоактивных факторов [8, 9, 17]. Основные вазоактивные вещества, вырабатываемые эндотелием, - это оксид азота (NO), который является вазодилатато-ром и приводит к расширению сосудов и снижению тонуса сосудов, и эндотелин-1 (ЭТ-1), который в концентрациях, превышающих физиологические, активирует рецепторы на гладкомышечных клетках сосудов, вызывая стойкую вазоконстрикцию [3]. К дисбалансу вазоактивных факторов и вазокон-стрикции приводит и активация ренин-ангиотензино-вой системы [5, 15]. Ключевым геном ренин-ангио-тензиновой системы является ген ангиотензиногена 4 Экология человека 2020.10 Циркумполярная медицина (AGT), расположенный в 1-й хромосоме, кодирующий синтез ангиотензиногена (АТ), белка а-глобулиновой фракции, синтезируемого в основном клетками печени и адипоцитами жировой ткани. В гене выявлено более 40 однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), но наиболее исследованными являются С521Т (rs4762) и Т704С (rs699), которые повышают уровень экспрессии гена, что приводит к активации рении-анги-отензиновой системы. Выявлена взаимосвязь данных аллельных вариантов с риском развития артериальной гипертензии и другой кардиоваскулярной патологии [1, 13]. Большое внимание исследователей привлекает ген рецептора 1-го типа ангиотензина II (AGT2R1), расположенный в 3-й хромосоме. Через этот рецептор опосредуется сосудосуживающее действие ангиотензина 2 (АТ2), в том числе путем запуска синтеза ЭТ-1 в эндотелиальных клетках сосудов [15]. Наиболее изученным является полиморфизм А1666С (rs5186), повышающий уровень экспрессии гена и, соответственно, повышающий количество рецепторов на поверхности клеток и ассоциирующийся с сердечно-сосудистой патологией [18]. Синтез NO эндотелием контролирует эндотелиальная NO-синтаза, детерминирующаяся геном NOS3. Ген расположен в 7-й хромосоме [6]. Самым изученным к настоящему времени является полиморфизм -786T>C (rs2070774) в зоне промотора гена, который рассматривают в качестве возможного предиктора сердечно-сосудистой патологии [2, 14]. Исследования полиморфизма генов AGT, AGT2R1 и NOS3 преимущественно проводились у лиц среднего и пожилого возраста с выявленной патологией сердечно-сосудистой системы, без учета климатогеографических условий их проживания. В силу того, что экологические условия Севера оказывают значительное воздействие на функционирование сердечно-сосудистой системы [10], изучение влияния полиморфизмов данных генов на баланс вазоактивных факторов расширит представления о молекулярно-генетических детерминантах формирования эндотелиальной дисфункции в экстремальных условиях Севера и позволит осуществлять комплекс превентивных мер в отношении кардиоваскулярной патологии. Цель исследования - выявить взаимосвязь аллельных вариантов генов AGT, AGT2R1 и NOS3 с продукцией ЭТ-1 и NO у проживающих на Севере молодых людей без выявленных сердечно-сосудистых заболеваний. Методы Выборка составила 286 человек (116 девушек и 170 юношей), родившихся и проживающих в Архангельской области. Средний возраст обследуемых - 19,4 года (95 % ДИ 18,5-19,9). В эксперимент не включали людей с любыми острыми и хроническими заболевания, а также курящих. У девушек исследования проводили на 5-7-й день овариально-менструального цикла. Исключались девушки, принимающие контрацептивы. Концентрацию NO в плазме выявляли методом Грисса. Методом иммуноферментного анализа определяли в плазме уровень ЭТ-1 и АТ2. Рассчитывали индекс соотношения вазодилататор NO/ вазоконстриктор ЭТ-1 по концентрации этих факторов в крови. Данный индекс позволяет оценить баланс продукции вазоактивных эндотелиальных факторов [7]. Генотипирование SNP -786T>C в гене NOS3, Т704С и С521Т в гене AGT, А1666С в гене AGT2R1 проводили методом полимеразной цепной реакции. Все материалы были собраны анонимно, с соблюдением правил биоэтики и подписанием добровольного информированного согласия. В соответствии с законом о персональных данных сведения были деперсонизированы. Статистическую обработку результатов производили с помощью пакета программы SPSS 17. Нормальность распределения оценивали с помощью критериев Колгоморова - Смирнова и Шапиро - Уилка. Результаты представляли в виде медианы (Ме) и первого и третьего квартилей (Q1 и Q3). Для попарного сравнения использовали критерий Манна - Уитни. Критическим уровень значимости (р) при проверке статистических гипотез принимали при 0,05. Результаты Анализ уровня вазоактивных факторов (NO, ЭТ-1, АТ2, индекс NO/ЭТ-!) не выявил статистически значимых различий между этими показателями у молодых людей с разными генотипами по полиморфизму Т704С гена AGT (табл. 1). Таблица 1 Вазоактивные факторы у молодых людей с различными генотипами по полиморфизму Т704С гена AGT, Ме (Q1; Q3) Показа тель ТТ (1) ТС (2) СС (3) Значимость различий (р) NO, мкмоль/л 20,24 (16,19; 24,19) 17,66 (15,94; 24,40) 20,72 (16,31; 25,47) (1-2) 0,208 (1-3) 0,593 (2-3) 0,752 ЭТ-1, фмоль/мл 0,41 (0,25; 0,63) 0,42 (0,25; 0,72) 0,54 (0,32; 0,98) (1-2) 0,955 (1-3) 0,523 (2-3) 0,493 АТ2, пг/мл 68,10 (65,40; 75,80) 65,85 (57,60; 74,73) 69,50 (56,20; 77,90) (1-2) 0,187 (1-3) 0,083 (2-3) 0,208 NO/ЭТ-! 39,50 (21,83; 55,49) 56,31 (16,99; 79,81) 50,27 (33,21; 79,93) (1-2) 0,402 (1-3) 0,194 (2-3) 0,754 Анализ уровня вазоактивных факторов у лиц с разными генотипами по полиморфизму С521Т гена AGT обнаружил определенные различия (табл. 2). Уровень АТ2 был статистически значимо ниже в группе с генотипом С/С (дикая гомозигота) по сравнению с показателями в группе с генотипом Т/Т (р = 0,046). Уровень NO в сыворотке крови у лиц с разными аллельными вариантами по полиморфизму С521Т статистически значимо не различался. 5 Циркумполярная медицина Экология человека 2020.10 Таблица 2 Вазоактивные факторы у молодых людей с различными генотипами по полиморфизму С521Т гена AGT, Ме (Q1; Q3) Показа тель СС (1) СТ (2) ТТ (3) Значимость различий (р) NO, мкмоль/л 18,75 (16,23; 22,62) 15,75 (10,83; 24,95) 14,26 (13,46; 14,26) (1-2) 0,896 (1-3) 0,059 (2-3) 0,190 ЭТ-1, фмоль/мл 0,41 (0,25; 0,70) 0,48 (0,33; 0,99) 1,59 (1,17; 2,95) (1-2) 0,096 (1-3) 0,006 (2-3) 0,004 АТ2, пг/мл 68,35 (59,43; 76,18) 62,20 (52,60; 70,10) 77,60 (76,80; 81,80) (1-2) 0,055 (1-3) 0,046 (2-3) 0,086 NO/ЭТ^ 50,37 (24,19; 78,12) 46,62 (11,14; 75,10) 12,00 (10,36; 13,50) (1-2) 0,558 (1-3) 0,042 (2-3) 0,054 Уровень ЭТ-1 в группе с генотипом Т/Т был значительно выше, чем в группах с генотипами С/Т и С/С (р = 0,006 и р = 0,04 соответственно). Привлекает внимание то, что у гомозигот Т/Т уровень ЭТ-1 превышал верхнюю границу референсных значений (верхняя граница 1,0 фмоль/мл) [4] и был выше, чем у гомозигот С/С, в 3,9 раза, а чем у гетерозигот С/Т, - в 3,3 раза. Индекс NO/ЭТ^ в группе с генотипом Т/Т был почти в 4 раза ниже, чем у гомозигот по дикому аллелю С/С и гетерозигот С/Т. Полученные результаты показывают, что генотип Т/Т (гомозиготы по мутантному аллелю) в гене AGT проявляется сдвигом баланса продукции эндотелиальных факторов в сторону вазоконстрикторных. Анализ уровня вазоактивных факторов не выявил различий уровня NO и АТ2 у лиц с разными генотипами по полиморфизму A1666C гена AGT2R1 (табл. 3). При этом ЭТ-1 был выше у молодых людей гомозиготных по мутантному аллелю С/С по сравнению с лицами гомозиготами дикого типа (р = 0,012), а индекс NO/ЭТ-1 был значительно меньше, чем у лиц с вариантами А/А и А/С. Снижение индекса NO/ЭТ^ свидетельствует об изменении продукции вазоактивных факторов эндотелием в сторону вазо-констрикторных. Таблица 3 Вазоактивные факторы у молодых людей с различными генотипами по полиморфизму А1666С гена AGT2R1, Ме (Q1; Q3) Показа тель АА (1) АС (2) СС (3) Значимость различий (р) NO, мкмоль/л 18,75 (16,23; 22,62) 15,75 (10,83; 24,95) 14,26 (13,46; 14,26) (1-2) 0,265 (1-3) 0,211 (2-3) 0,202 ЭТ-1, фмоль/мл 0,42 (0,26; 0,76) 0,45 (0,27; 1,07) 0,87 (0,24; 0,97) (1-2) 0,663 (1-3) 0,012 (2-3) 0,076 АТ2, пг/мл (мкг/мл) 68,65 (58,78; 75,13) 68,10 (61,65; 78,40) 69,95 (51,30; 77,80) (1-2) 0,650 (1-3) 0,941 (2-3) 0,948 NO/ЭТ^ 49,13 (22,53; 68,81) 53,85 (15,65; 82,21) 15,46 (10,36; 16,15) (1-2) 0,820 (1-3) 0,045 (2-3) 0,094 По литературным данным [12], экспрессия гена NOS3 модифицируется эстрогенами. В связи с этим при изучении взаимосвязи аллельных вариантов гена NOS3 и продукции вазоактивных эндотелиальных факторов необходимо учитывать гендерные особенности. При анализе с учетом генотипа по полиморфизму -786T>C в гене NOS3 не установлено изменений в продукции NO у юношей, но обнаружена связь варианта С/С (гомозигота по мутантному аллелю) по изучаемому полиморфизму с уровнем ЭТ-1. Юноши с этим вариантом имели максимальные показатели ЭТ-1 (табл. 4). Таблица 4 Вазоактивные факторы у юношей с различными генотипами по полиморфизму -786T>C гена NOS3, Ме (Q1; Q3) Показа тель ТТ (1) СТ (2) СС (3) Значимость различий (р) NO, мкмоль/л 21,73 (17,61; 28,63) 21,13 (18,55; 28, 23) 19,57 (18,15; 22,62) (1-2) 0,75 (1-3) 0,06 (2-3) 0,13 ЭТ-1, фмоль/мл 0,39 (0,29; 0,57) 0,35 (0,25; 0,63) 0, 66 (0,35; 0,84) (1-2) 0,91 (1-3) 0,007 (2-3) 0,01 NO/ЭТ^ 58,9 (39,0; 100,4) 69,4 (38,4; 102,4) 29,3 (23,6; 63,6) (1-2) 0,99 (1-3) 0,08 (2-3) 0,03 У юношей с вариантом -786С/С гена NOS3 уровень ЭТ-1 был выше, чем у лиц с вариантами С/Т (р = 0,01) и Т/Т (р = 0,07), что свидетельствует об изменении продукции вазоактивных факторов эндотелием в сторону вазоконстрикторных и дает основания отнести данный генотип к факторам риска развития эндотелиальной дисфункции. Анализ изучаемых вазоактивных факторов не выявил статистически значимых различий у девушек с разными генотипами по полиморфизму -786Т>С в гене NOS3 (табл. 5). Однако уровень NO и ЭТ-1 был выше в группе девушек гомозигот по мутантному аллелю С/С. У этих девушек индекс NO/ЭТ^ был сдвинут в сторону вазоконстрикции и имел самые низкие значения по сравнению с девушками, имеющими в генотипе дикий аллель по изучаемому полиморфизму (Т/Т и С/Т). Таблица 5 Вазоактивные факторы у девушек с различными генотипами по полиморфизму -786T>C гена NOS3, Ме (Q1; Q3) Показа тель ТТ (1) СТ (2) СС (3) Значимость различий (р) NO, мкмоль/л 13,71 (11,71; 15,72) 15,53 (13,97; 17,09) 18,24 (13,21; 23,26) (1-2) 0,60 (1-3) 0,931 (2-3) 0,62 ЭТ-1, фмоль/мл 0,62 (0,36; 1,00 0,84 (0,39; 1,66) 1,24 (0,28; 2,67) (1-2) 0,410 (1-3) 0,191 (2-3) 0,481 NO/ЭТ^ 22,476 (13,11; 28,01) 19,063 (14,40; 25,22) 14,84 (8,49; 25,412) (1-2) 0,338 (1-3) 0,502 (2-3) 0,154 б Экология человека 2020.10 Циркумполярная медицина Обсуждение результатов При анализе полиморфизмов в генах AGT, AGT2R1 и NOS3 у молодых людей без выявленной кардиоваскулярной патологии установлены разная степень вовлеченности и разное функциональное значение изучаемых полиморфизмов в формировании баланса вазоактивных факторов. Так, полиморфизм Т704С в гене AGT не сопровождается изменением уровня вазоактивных эндотелиальных факторов, в то время как продукция вазоактивных факторов у молодых людей гомозигот по мутантному аллелю Т/Т полиморфизма С521Т в этом же гене сдвинута в сторону вазоконстрикторных, что связано с высоким уровнем ЭТ-1, превышающим верхнюю границу нормальных показателей, и низким значением индекса NO/ЭТ-1. Известно, что АТ2 через рецептор 1 типа запускает синтез ЭТ-1 [5]. Полиморфизм С521Т стимулирует экспрессию гена AGT [11], что приводит к повышению уровня АТ2, высокий уровень которого стимулирует выработку ЭТ-1, что и характеризуется как дисбаланс вазоактивных факторов. Полиморфизм А1666С в гене рецептора 1 типа АТ2 находится в 3'-нетранслируемой области гена и реализует свое влияние на экспрессию гена через микро РНК (miRNA155), которая участвует в посттранскрипционной регуляции, путем репрессии трансляции. В присутствии miRNA155 экспрессия аллеля 1666А значительно снижается, экспрессия аллеля 1666C, напротив, остается неизменной, что приводит к увеличению концентрации рецепторов 1 типа АТ2, следствием этого является увеличение ЭТ-1 и формирование дисбаланса вазоактивных факторов [18]. По данным литературы [16, 19, 20], у лиц, имеющих хотя бы один аллель С по полиморфизму 786T>C в гене NOS3, выявлено меньшее количество мРНК и уровня NO в крови по сравнению с дикими гомозиготами. Однако у девушек гомозигот по мутантному аллелю С/С концентрация NO в фолликулярную фазу цикла имела самое высокое значение (в виде тенденции) по сравнению с группами генотипов гомозигот по аллелю Т/Т и гетерозигот. Поэтому можно предположить, что данный факт связан с включением в компенсаторную реакцию эстрадиола, который увеличивает уровень NO путем активации фермента NOS3 посредством прямого фосфорилирования эстрогеновых рецепторов и дальнейшую передачу сигнала через протеинкиназные каскады, активирующие данный фермент [12]. Кроме того, возможен и геномный путь, связанный с увеличением экспрессии гена NOS3. При этом у девушек мутантных гомозигот наблюдается сдвиг баланса вазоактивных факторов в сторону вазоконстрикторных (высокий уровень ЭТ-1 и низкое значение индекса NO/ЭТ^). Различные у молодых здоровых юношей-северян варианты генотипа по полиморфизму -786T>C в гене NOS3 не влияют на уровень продукции NO, но мутантные гомозиготы (С/С) имеют статистически значимо более высокий уровень ЭТ-1 и низкое значение индекса NO/ЭТ-Ь Таким образом, результаты исследования показали, что риск развития дисбаланса вазоактивных факторов у молодых северян без выявленной кардиоваскулярной патологии обусловлен повышением синтеза ЭТ-1 и не связан с концентрацией NO в плазме крови. Присутствие в геноме вариантов 521Т/Т в гене AGT, 1666С/С в гене AGT2R1 и -786С/С в гене NOS3 повышает риск развития дисбаланса вазоактивных факторов в сторону вазоконстрикторных. Полученные результаты могут иметь значение для расчета риска формирования сердечно-сосудистой патологии уже в молодом возрасте в экстремальных условиях Севера и перехода к персонифицированной медицине.

About the authors

N. A. Bebyakova

Northern State Medical University

Email: nbebyakova@mail.ru

O. A. Pervukhina

Northern State Medical University


N. A. Fadeeva

Northern State Medical University


A. V. Khromova

Northern State Medical University


References

  1. Атаманчук А. А., Кузьмина Л. П., Хотулева А. Г., Коляскина М. М. Полиморфизм генов ренин-ангиотензин-альдостероновой системы в развитии гипертонической болезни у работающих, подвергающихся воздействию физических факторов // Медицина труда и промышленная экология. 2019. № 59 (12). С. 972-977.
  2. Бебякова Н. А., Фадеева Н. А., Хромова А. В. Влияние полиморфизма -786Т>С гена eNOS на параметры гемодинамики у девушек // Журнал медико-биологических исследований. 2018. Т. 6, № 3. С. 205-214.
  3. Голивец Т. П., Дубоносова Д. Г., Осипова О. А., Петрова Г. Д. Эффекты эндотелина-1 в развитии и прогрессировании метаболического синдрома и других социально-значимых неифекционных заболеваний (обзор литературы) // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Медицина. Фармация. 2017. № 19 (268), выпуск 39. С. 5-20.
  4. Дремина Н. Н., Шурыгин М. Г., Шурыгина И. А. Эндотелины в норме и патологии // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2016. № 10. С. 210-214.
  5. Корякина Л. Б., Пивоваров Ю. И., Курильская Т. Е., Сергеева А. С. Бабушкина И. Б. Дисфункция сосудистого эндотелия при артериальной гипертонии и ишемической болезни сердца (обзор литературы) // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2013. № 2 (90). С. 165-170.
  6. Кравченко Н. А., Ярмыш Н. В. Регуляция экспрессии эндотелиальной NO-синтазы и дисфункция сосудистого эндотелия при сердечно-сосудистой патологи // Цитология и генетика. 2008. Т. 42, № 4. С. 69-81.
  7. Лямина С. В., Лямина Н. П. Сенчихин В. Н., Додина К. А. Эндотелиальные биомаркеры - потенциальные индикаторы клинического течения артериальной гипертонии у пациентов молодого возраста // Артериальная гипертензия. 2010. Т. 16, № 3. С. 261-265.
  8. Пизов Н. А., Пизов А. В., Скачкова О. А., Пизова Н. В. Эндотелиальная функция в норме и при патологии // Медицинский совет. 2019. № 6. С. 154-159.
  9. Радайкина О. Г., Власов А. П., Мышкина Н. А. Роль эндотелиальной дисфункции в патологии сердечнососудистой системы // Ульяновский медико-биологический журнал. 2018. № 4. С. 8-17.
  10. Хаснулин В. И., Артамонова О. Г., Хаснулина А. В., Павлов А. Н. Адаптивные типы мобилизации приспособительных резервов организма и устойчивость к артериальной гипертензии на Севере // Экология человека. 2014. № 7. С. 24-29.
  11. Barbalic M., Skaric-Juric T., Cambien F., Barbaux S., Poirier O., Turek S., Vrhovski-HebrangD., Cubrilo-Turek M., Rudan I., Rudan P. Gene polymorphisms of the renin-angiotensin system and early development of hypertension. // Am. J. Hypertens. 2006. Vol. 19. Р 837-842.
  12. Duckies S. P., Miller V. M. Hormonal modulation of endothelial NO production // Pflugers Arch. Eur. J. Physiol. 2010. Vol. 459 (6). P. 841-851.
  13. Khatami M., Heidari M., Hadadzaden M., Scheiber-MojdehkarB., Bitaraf Sani M., Houshmand M. Simultaneous Genotyping of the rs4762 and rs699 Polymorphisms in Angiotensinogen Gene and Correlation with Iranian Cad Patient’s with Novel Hexa-primer ARMS-PCR // Iran J. Public Health. 2017. Vol. 46 (6). P. 811-819.
  14. Li J., Wu X., Li X. Feng G., He L., Shi Y. The Endothelial Nitric Oxide Synthase Gene Is Associated with Coronary Artery Disease: A Meta-Analysis // Cardiology. 2010. Vol. 116. Р 271-278.
  15. Mendoza A., Lazartigues E. The compensatory rennin-angiotensin system in the central regulation of arterial pressure: new avenues and new challenges // Ther. Adv. Cardiovas. Dis. 2015. Vol. 9 (4). P 201-208.
  16. Miyamoto Y., Saito Y., Nakayama M. et al. Replication protein A1 reduces transcription of the endothelial nitric oxide synthase gene containing a -786T>C mutation associated with coronary spastic angina // Hum. Mol. Genet. 2000. Vol. 9 (18). P. 2629-2637.
  17. Mudau M., Genis A., Locher A., Strijdom H. Endothlial disfunction the early predictor of atherosclerosis // Cardiovasc. J. Afr. 2012. Vol. 23 (4). P 222-231.
  18. Praveen S., Christelle B., Maryline G., Gregory R. Grant, Samuel Deutsch, Terry S. Elton, Artemis G. Hatzigeorgiou, and Stylianos E. Antonarakis. Human microRNA-155 on Chromosome 21 Differentially Interacts with Its Polymorphic Target in the AGTR1 // The American Journal of Human Genetics. 2007. Vol. 81. P 405-415.
  19. Vecoli C. Endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms in cardiovascular disease // Vitam Horm. 2014. Vol. 96. P. 387-406.
  20. Yaghoubi A. R., Khaki-Khatibi F. I-786C singlenucleotide polymorphism (sNP) of endothelial nitric oxide synthase gene and serum level of vascular endothelial relaxant factor (VeRF) in nondiabetic patients with coronary artery disease // African Journal of Biotechnology. 2012. Vol. 11 (93). Р 15945-15949.

Statistics

Views

Abstract - 72

PDF (Russian) - 14

Cited-By


Article Metrics

Metrics Loading ...

PlumX

Dimensions

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2020 Bebyakova N.A., Pervukhina O.A., Fadeeva N.A., Khromova A.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies