Full Text

Стратегия национальной безопасности Российской Федерации в качестве одной из составляющих устойчивого развития страны рассматривает экологическую безопасность.¹ Важность данного стратегического направления обусловлена влиянием химических загрязнителей выбросов объектов промышленности, энергетики, транспорта и капитального строительства на среду обитания, являющихся причиной возникновения рисков причинения вреда жизни и здоровью людей.

Химическая и биологическая безопасность определяется состоянием защищенности населения и окружающей среды от негативного воздействия опасных химических и биологических факторов, при котором химический и биологический риск остается на допустимом уровне. Влияние техногенной сферы на течение адаптационных процессов городского населения – одна из актуальных  проблем  современного  урбанизированного общества  [1, 2, 3]. Решение  таких  проблем  требует проведения комплексных исследований объектов среды обитания на основе использования современных  физико-химических  методов  анализа [4]. Наряду с традиционно  используемыми  в  рамках  социально-гигиенического мониторинга методами контроля химических факторов в объектах среды обитания в  настоящее  время для  формирования доказательной  базы  негативного  техногенного  воздействия  используется  определение потенциально опасных химических соединений в биологических средах населения  [5-6].

Определение  вредных  веществ  и  их  метаболитов  в биологических средах организма человека с целью оценки экспозиции получило широкое распространение в мировой практике при характеристике индивидуального и популяционного риска, связанного с химическим загрязнением окружающей среды. Биомониторинг, как одно из направлений среди современных гигиенических технологий, повышает эффективность и глубину аналитических исследований, дает системное представление о сложившейся санитарно-гигиенической ситуации [7-8]. Биомониторинг может рассматриваться как один из инструментов для оценки тяжести и характера воздействия химических факторов на организм человека и также широко используется в диагностических и клинических исследованиях, профилактической медицине [9]. Во всём мире биомониторинг признан как стандарт для оценки экспозиции токсических веществ на человека и основа для реагирования на серьёзные экологические угрозы [10].  В России, с учётом зарубежного опыта, создается научно-методическая платформа биомониторинга для повышения объективности оценки риска и  вреда здоровью в условиях химического загрязнения окружающей среды.

К опасным загрязнителям окружающей среды следует отнести фуран и его производные, которые представляют угрозу здоровью человека. Так, международное агентство по исследованию рака классифицирует фуран как «возможный канцероген для человека (группа 2B)» [11]. Известно, что фуран и его производные могут вызывать ряд серьезных заболеваний, включая: онкологические; нарушения работы печени и почек; поражение центральной нервной системы; репродуктивные нарушения. Так, при вдыхании фуран может вызвать отек легких и некроз бронхов. После однократного перорального приема фурана 8 или 25 мг/кг от массы тела самцов крыс Fischer 344 микросомальные уровни P450 в печени снижаются до 90 и 71% от контрольной группы, соответственно, с одновременным снижением активности анилингидроксилазы, 7-этоксикумарин-O-деэтилазы и 7-этоксирезоруфин-O-деэтилаза. При дозе 250 мкг/кг массы тела самцов крыс Fischer 344 индуцированы хромосомные аберрации. Фуран считается негенотоксичным гепатоканцерогеном,  метаболизируется в печени до активного метаболита цис-2-бутен-1,4-диал (BDA), который  остро токсичен для клеток печени, и в результате гибель клеток сопровождается восстановлением тканей и пролиферацией клеток, что, в свою очередь, увеличивает вероятность канцерогенеза [12].

 Для оценки уровня неблагоприятных экологических воздействий и решения современных гигиенических проблем необходимо располагать высокочувствительными и селективными методиками определения содержания токсичных химических соединений в биологических средах человека. Обобщение мирового опыта научно-методического обеспечения биомониторинга человека является залогом успешного развития этой подсистемы в России.

Цель исследования - оценка научно-методических подходов отечественных и зарубежных исследователей к проблеме биомониторинга фурана и его производных в организме человека (обзор литературы).

Материалы и методы. Методами исследования были контент-анализ научной мировой литературы, анализ отечественной и зарубежной нормативно-методической научной литературы, методик определения фурана и его производных в биологических средах. Выполнен анализ статей Российских и зарубежных журналов по токсикологии и медицине, касающиеся физико-химических методов контроля  содержания фурана и его производных в био- средах человека. Временные границы анализируемого периода составили 37 лет (1986-2023г.).

Поиск литературных источников (публикаций результатов научных исследований) проводился на сайтах: Google scholar (Академия Google); https://search.crossref.org; https://www.sciencedirect.com;

https://link.springer.com; https://www.elsevier.com;

https://www.scopus.com;  https://search.scielo.org; https://search.acs.org;

https://www.semanticscholar.org.

Поиск методических документов Российской Федерации проведен на сайтах: http://www.normacs.ru;  https://files.stroyinf.ru.

Выполнен анализ источников: а) Журналы по аналитической химии: Analytica Chimica Acta; аналитическая и биоаналитическая химия; аналитическая химия; экологическая наука; международный журнал масс-спектрометрии; журнал экологических наук и технологий; Journal of Chromatography A; Spectrochimica Acta part A: молекулярная и бимолекулярная спектроскопия; Talanta; The International journal of pure applied analytical chemistry. б) Сборники методических указаний  по методам контроля содержания фурана и его производных в объектах окружающей среды за 10 лет (2009-2019 г.г.).   Всего изучено более 34 источников методической и научно-технической информации.

По данным International Agency for Research on Cancer (IARC), возникновение примерно 85% опухолей у человека можно связать с влиянием факторов среды [13].

Фуран является токсикантом печени и канцерогеном у грызунов. Он классифицируется как возможный канцероген человека, но последствия воздействия на здоровье человека остаются неизвестными. Исследованиями показано, что при однократном пероральном введении фурана в кукурузном масле 4 см³/кг массы тела крыс Fischer 344 в дозе 0,1-0,2 мг/кг массы тела он способен окислиться до токсичного метаболита цис-2-бутен-1,4-диал (BDA), который является важным триггером токсических эффектов [14].

Абсорбция, распределение, метаболизм и выведение фурана и его производных

Метаболизм фурана происходит главным образом в печени, где CYP 2E1 продуцирует высокореактивный бис-электрофил, цис-2-бутен-1,4-диал (БДА). BDA реагирует с нуклеофильными группами в аминокислотах и ДНК in vitro с образованием ковалентных аддуктов. Доказательства образования аддуктов БДА-нуклеозидов in vivo ограничены, но важны для оценки канцерогенной опасности пищевых фуранов. В этом исследовании использовалось контролируемое дозирование фурана у крыс Fischer 344 для измерения токсикокинетики сыворотки и печени и возможного образования аддуктов БДА-нуклеозидов in vivo. После введения фурана в дозе 2 мг/кг массы тела через желудочный зонд концентрации его в печени были постоянно выше, чем в цельной крови (примерно в 6 раз), что согласуется с доставкой липофильного соединения в печень через воротную вену.

Экспериментальные системы.  После ингаляции самцов крыс Fischer 344 при концентрации фурана 145, 297 или 578 мг/м³ в течение 4 часов, концентрации фурана были определены в крови и печени. Была разработана физиологически обоснованная кинетическая модель на основе коэффициентов тканевого распределения фурана, определенных in vitro. Модель моделировала концентрации фурана после ингаляции in vivo и выявила единый насыщаемый процесс с максимальной скоростью метаболизма (вена /27 мкмоль (1,8 мг/ч) на 250 г веса крысы и константа Михаэлиса-Ментен (KrJ 2 мкмоль (136 мкг)/л. Биотрансформация фурана гепатоцитами крысы in vitro составила 0,4 мкмоль (27 мкДж/л) и вена 0,02 мкмоль (1,4 мкг)/ч.. Метаболизм фурана in vivo ингибируется пиразолом [15-16]. Инкубация (2,5 -4 ºC) фурана (удельная активность 56 мКи/ммоль; чистота ≥99%) с микросомами печени самцов крыс Fischer 344 приводили к ковалентному связыванию радиоактивной метки с микросомальным белком. Через двадцать четыре часа после однократного перорального приема 8 или 25 мг/кг от массы тела фурана микросомальные уровни P450 в печени были снижены до 90 и 71% от контрольной группы, соответственно, с одновременным снижением активности анилингидроксилазы, 7-этоксикумарин-O-деэтилазы и 7-этоксирезоруфин-O- деэтилаза. Количество радиоактивной метки, связанной с микросомами, распределялось почти одинаково  между гемовой и белковой составляющими частиц, связывающих монооксид углерода. Харн-фуран аддукт не был идентифицирован [17].

 

ТОКСИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ ФУРАНА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ

 

Многие ксенобиотики, содержащие фурановое кольцо, токсичны и/или канцерогенны. Вредное воздействие этих соединений требует окисления фуранового кольца. Эта реакция генерирует электрофильный промежуточный продукт. В зависимости от заместителей в фурановом кольце промежуточное соединение представляет собой либо эпоксид, либо цис-ендион с большим количеством замещений в кольце, способствующих образованию эпоксида. Любой промежуточный продукт реагирует с клеточными нуклеофилами, такими как белок или ДНК, вызывая токсичность. На токсичность конкретного фурана также влияет наличие конкурирующих метаболических путей или эффективных путей детоксикации. Глутатион (GSH) играет важную роль в модуляции вредного воздействия этого класса соединений путем реакции с реактивным метаболитом.

Экспериментальные системы. Изучены повреждение печени и пролиферация гепатоцитов на мышах B6C3Fl/CrIBR и крысах Fischer 344/CrIBR. При изучении одиночных групп из пяти мышей-самцов и пяти крыс-самцов вводили фуран в кукурузном масле  через желудочный зонд в дозах 30 или 50 мг/кг массы тела. Затем экспериментальные мыши и крысы были убиты в течение восьми дней. За 2 часа до смерти им внутрибрюшинно вводили 2000 мкл/кг массы тела CH-метилтимидина, чтобы можно было определить индексы маркировки. Эффекты, наблюдаемые после введения однократных доз, были гепатоцеллюлярный некроз, заметным повышением активности фермента аспартатааминотрансферазы, аланинаминотрансферазы (АЛТ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и резкое увеличение индекса маркировки (23,9 у мышей и 17,8 у крыс по сравнению с - (0,5 в контроле). Через шесть недель лечения самцы и самки крыс, но не мыши, имели гиперплазию желчных протоков и метаплазию. Показатели маркировки гепатоцитов у самцов мышей были 25,1 на 1 неделе, 12,0 на 3 неделе и 3,2 на 6 неделе по сравнению с контролем. Значения 0,41 на 1 неделе и 0,89 на 6 неделе (5–39-кратное увеличение по сравнению с комбинированными контрольными значениями). Индексы мечения гепатоцитов у самцов крыс составили 3,2 на 1-й неделе, 9,2 на 3-й неделе и 6,5 на 6 неделе по сравнению с контрольными значениями 0,08 на 1 неделе и 0,29 на 6 неделе (18-51-кратное увеличение относительно комбинированных контрольных значений). Показатели мечения гепатоцитов у самок крыс составляли 11,7 на 1 неделе, l, 9,2 на 3 неделе и 14,4 на 6 неделе по сравнению с контрольными значениями 0,77 на 1 неделе и 14,4 на 6 неделе, 0,75 на 6 неделе (12-19-кратное увеличение по сравнению с комбинированными контрольными значениями) [18]. Поражения печени оценивали с помощью гистологии, гисто- и иммунохимии. Результаты исследований показали быстрое развитие тяжелого холангиофиброза в хвостатой доле печени. Гистологически поражение характеризовалось хорошо дифференцированными гиперпластическими желчными протоками и образованием многочисленных метапластических кишечных желез, поддерживаемых фиброзной тканью. В высокой дозе фурана наблюдалось образование гиоляроподобных структур [19].

 

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ФУРАНА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ

 

Экспериментальные системы. Введение фурана экспериментальным животным вызвало генную мутацию тимидина, киназа анапластической лимфомы мыши L5 178Y в отсутствие метаболической активации. При высоких дозах фурана наблюдались обмен сестринскими хроматидами и хромосомные аберрации в клетках яичников китайского хомячка генетическая информация при этом оставалась неизменной. При введении швейцарским крысам внутрибрюшинно фурана в дозах до 350 мг/кг массы тела в vivo в костном мозге не индуцировались обмены сестринских хроматид или хромосомные аберрации; однако хромосомные аберрации были индуцированы при дозе 250 мкг/кг массы тела. Активация протоонкогенов изучалась на аденомах и карциномах печени, индуцированных мышам B6C3Fl по фурану. Частота активированных онкогенов H-ras и K-ras была сходной в гепатоцеллюлярных опухолях от 12/29 мышей и у 15/27 контрольных мышей, но спектры активирующих мутаций в гене H-ras значительно различались. Кодон 61 в опухолях как обработанных, так и необработанных животных, мутации (G-7T и G-7C трансверсии) наблюдались на кодоне 11-17  только у животных, получавших фуран. Авторы предположили, что новые мутации в генах ras могли быть из-за генотоксического действия фурана  [20].

 

МЕТОДИКИ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ В  СТРАНАХ ЕВРОПЕЙСКОГО СОЮЗА, США И КОРЕИ

 

С целью анализа существующих методических проблем проведен обзор научных отечественных и зарубежных работ потенциально опасных токсических фурана и его производных (фуран и 2-метилфуран), которые относят к «стойким органическим загрязнителям» группы СОЗ, как химические канцерогены и факторы риска развития генотоксического, иммунотоксического эффектов.

Для обнаружения фуранов в крови авторы V. Ravindranath, M. G. Mcmenamin, J.H. Dees, использовали  два вида методов [21-22]:  радиохимический и метод изотопного разбавления, с последующим анализом с помощью методов газовой хроматографии и масс-спектрометрии.

Радиохимический метод. Крысам вводили 50-200 мг/кг массы тела [¹⁴C]2-MF и умертвляли через 12 часов после введения дозы, брали кровь из сердца и удаляли печень, легкие и почки. Все ткани были немедленно заморожены в жидком азоте. Ткани хранились при -70 ºC до анализа, ковалентное связывание метки с [¹⁴C]2-MF определяли с помощью модификации метода Бойда и Берка.

Подготовка образца крови к химическому анализу. Ткани, кровь, печень и почки гомогенизировали в 2 объемах воды (в/в), а легкие - в 3 объемах воды, общую радиоактивность в тканях определяли путем растворения 0,1 мл гомогената в 0,5 мл протосола в течение 12 часов при комнатной температуре, затем добавляли раствор ультрафторида, содержащего 0,02% ледяной уксусной кислоты. Гомогенат (1 мл) добавляли к 3 мл метанола, перемешивали и центрифугировали. Осадок тщательно промывали метанолом. Экстракты объединяли, доводили до постоянного объема и аликвоту подсчитывали на радиоактивность. К промытому осадку добавляли 3 мл 0,6 Н хлорной кислоты и перемешивали. Суспензию нагревали при 70 ºC в течение 20 мин и центрифугировали. Аликвоту супернатанта подсчитывали на радиоактивность, ковалентно связанную с дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК), и другую аликвоту использовали для оценки концентрации ДНК [23].

Метод изотопного разбавления. Предложена методика определения семи полихлорированных дибензо-п-диоксинов (ПХДД), 10 дибензофуранов (ПХДФ), 4 неортозамещенных или копланарных полихлорированных дифенила (КПБД) в крови [23].

Содержание ПХДД/ПХДФС/КПКБ измеряли в сыворотке крови с помощью газовой хроматографии высокого разрешения/масс-спектрометрии высокого разрешения с разбавлением изотопов (HRGC/ID-HRMS).

Подготовка образца крови к химическому анализу. Образцы сыворотки (5-10 см³), подлежащие анализу на ПХДД/ПХДФС/КПКБ, обрабатывали внутренними стандартами, помеченными ¹³С (¹³С₁₂), и представляющие интерес анализируемые вещества экстрагировали гексаном с использованием процедуры твердофазной экстракции C18 (SPE) с последующей автоматической очисткой Power-Prep/6 (Fluid Management Systems) и процедура концентрирования с использованием многослойного силикагеля (кислотный, основной и нейтральный диоксид кремния) и колонн оксида алюминия, соединенных с углеродной колонной AX-21. ПХДД/ПХДФ/ХПХБ выделяли углеродной колонной AX-21 в обратном направлении с помощью толуола. Для ПХДД/ПХДД/ХПХБ каждый аналитический цикл состоял из восьми неизвестных образцов, двух методических заготовок и двух контрольных образцов. После очистки образца избыток растворителя выпаривали до 350 мкл с помощью системы упаривания TurboVap II (Caliper Life Sciences), а оставшийся растворитель переносили во флаконы, содержащие 1 мкл додекана «keeper», и оставляли испаряться до «сухости». Перед количественным определением в каждый флакон добавляли 5 мкл внешнего изотоп-меченного стандарта с маркировкой ¹³С₁₂. Затем экстракты образцов анализировали на содержание ПХДД/ПХДФС/cPCBs с помощью метода газовой хроматографии/масс-спектрометрии высокого разрешения  (HRGC/ID-HRMS). 2 мкл полученного элюата вводили в испаритель газового хроматографа Agilent Technologies 6890, используя автоматический пробоотборник GC Pal (технология Leap). Прибор работал в режиме без деления потока при скорости потока гелия 1 мл/мин через капиллярную колонку серии DB-5ms (параметры колонки 30 м×0,25 мм × толщина межфазной пленки 0,25 мкм). В колонке анализируемые вещества разделялись перед подачей в магнитный секторный масс-спектрометр Thermo Finnigan MAT95 XP (5 кВ), работающий в режиме электронной ионизации (EI) при 40 эВ, с использованием селективного ионного мониторинга (SIM) при разрешающей способности 10 000. Концентрация каждого анализируемого вещества определялась с помощью линейных калибровочных графиков. Достоверность полученных результатов оценивалась с использованием множества критериев, таких как: отношение сигнал/шум ≥3 для наименьшей массы нативного иона, разрешающая способность прибора ≥10000, индекс специфичности хроматографического изомера с пределом 95%, относительное отношение времени удерживания нативного и изотоп меченого аналита. Коэффициенты реакции двух ионов ¹²C₁₂ и ¹³C₁₂ были в пределах ошибки ±20% от их теоретических значений, а извлечение анализируемого вещества ≥10% и ≤120%. Предел обнаружения методом (MDL) для каждого анализируемого вещества рассчитывался с поправкой на вес образца и извлечение . В данном исследовании [24] авторами Yun-Kyung Lee, Seung-Won Jung, Kwang-Geun Lee, Sung Joon Lee использована твердофазная микроэкстракционная газовая хроматография/масс-спектрометрия (ТФМЭ-ГХ/МС) для анализа уровней фурана в плазме крови у 100 здоровых людей, которые придерживались обычной диеты. Возраст обследуемых составил от 30 до 70 лет, 51% из них были женщинами. Для этих исследований авторы разработали аналитический метод анализа фурана в крови человека.

Подготовка волокна твердофазной экстракции (SPME) для извлечения фурана из плазмы крови. Эксперимент по извлечению фурана из плазмы крови человека проводился с использованием волокна  карбоксен/полидиметилсилоксан (CAR/PDMS) толщиной 75 мкм. Волокно выдерживали при 60 ºC в течение 20 мин при постоянном перемешивании (200 об/мин) во флаконе для образца объемом 20 мл. Перед использованием волокно выдерживали при температуре 250 ºC в течение 1 часа в инжекционном отделении газового хроматографа.

Подготовка образца крови к химическому анализу. Образцы крови объемом 10 см³ собирали в пробирки с этилендиаминтетраминовой кислотой (ЭДТА) и немедленно помещали на лед, чтобы предотвратить потерю фурана при испарении. Плазму выделяли центрифугированием (630 об/в течение 10 мин, при температуре t=4 ºC). Клинические образцы хранились при температуре −80 ºC до тех пор, пока не было проведено измерение содержания фурана.

Анализ GC/MS. Для газохроматографического анализа с масс-селективным детектированием (GC/MS) использовали газовую систему GC Agilent 6890N, с масс-селективным детектором Agilent 5975. Хроматографическое разделение химических соединений проводили на колонке HP-PLOT Q (15 м×0,32 мм, пленка 20 мкм. В качестве газа-носителя использовали гелий (скорость потока 44 см/сек); газовый хроматограф работал в режиме без разделения газовых потоков с инжектором, поддерживаемым при температуре 250 ºC. Колонка работала в режиме программирования температуры: 50 ºC поддерживалась в течение 5 мин, нагрев колонки со скоростью 25 ºC/мин до 230 ºC и выдерживали при 230 ºC в течение 2 мин. Масс-спектрометр работал в режиме селективного ионного мониторинга (SIM), регистрация  ионов: m/z 68 и 39 для фурана и m/z 72 и 42 для d4-фурана. Предел количественного определения (LOQ) и полнота извлечения фурана из  крови составили 1,0 ppb и 104% соответственно.

Авторами M.I. Churchwell, R.C. Scheri, L.S., Von Tungeln, G Gamboa da Costa, F A Beland , D R Doerge [25] предложена методика определения фурана в крови.

Подготовка образца крови к химическому анализу. Цельную кровь собирали в вакуумные пробирки с ЭДТА объемом 3 см³. Пробирки были заполнены полностью, хорошо перемешаны и немедленно охлаждены. Образцы крови были проанализированы в тот же день, что и забор. Аликвоту цельной крови объемом 1 см³ добавляли во флакон объемом 10 см³ и добавляли 100 п/моль внутреннего стандарта d4 фурана. Внутренний стандарт хранился на льду во время подготовки образца. Затем флакон закрывали обжимной крышкой с тефлоновой прокладкой и анализировали образец методом анализа равновесной паровой фазы (headspace GC/MS).

Авторы Idris J. Wazeerud-Din, Lalith K. Silva*, Mitchell M. Smith, Cody A. Newman,Benjamin C. Blount, Víctor R. De Jesús [26] предложили новый высокопроизводительный автоматизированный метод количественного определения семи ЛОС (3-метилфуран, 2-гексанон, 2-гептанон, 3-октанон, 1-октен-3-ол, 2-этил-1-гексанол и геосмин) в сыворотке крови человека. Метод позволяет количественно определять целевые аналиты с использованием твердофазной микроэкстракционной газовой хроматографии и тандемной масс-спектрометрии при низких уровнях содержания. Пределы обнаружения варьировали от 0,076 до 2,77 мкг/дм³. Этот метод обеспечивал линейность в диапазоне концентраций аналитов с коэффициентами определения >0,992. Полнота извлечения из сыворотки крови изменялась от 84,5% до 113%,  точность анализа варьировалась от 0,38% до 8,78%. Воспроизводимость анализа показала коэффициенты вариации ≤11% и ≤8% соответственно.

Авторами [27] выполнен биомониторинг, направленный на оценку уровней загрязнителей окружающей среды, включая, диоксины (ПХДД) и фураны (ПХДФ). Перед пуском мусоросжигательного завода обследована группа из 85 человек (Т1) (41 «экспонированный» и 44 «неэкспонированный») в возрасте 36–50 лет, проживающих в районе мусоросжигательного завода в течение пяти лет до исследования. Согласно дизайну исследования, та же когорта была повторно оценена после трех лет работы мусоросжигательного завода (T2). Параллельное исследование было проведено на группе из 12 фермеров (контрольная группа), проживающих и/или работающих на фермах, расположенных в радиусе 5 км от мусоросжигательного завода. Результаты этого исследования показали отсутствие изучаемых соединений ПХДД и ПХДФ в крови обследуемой группы. Фактически, не было обнаружено существенных различий в концентрациях ПХДД + ПХДФ, измеренных в группе населения, проживающего вблизи завода, после трех лет деятельности (Т2) по сравнению с контрольной группой. Сывороточные концентрации ПХДД, ПХДФ в группе фермеров были выше, чем у исследуемого взрослого населения.

Подготовка образцов крови к химическому анализу. Кровь в вакуумных контейнерах перемешивали методом ручного переворачивания 10 раз, а затем оставляли на 30 мин при комнатной температуре перед центрифугированием. Центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин эритроциты отделяли от сыворотки. Полученные образцы сыворотки хранили при температуре -70 ºC до анализа. Затем, перед анализом образцы сыворотки размораживали и смешивали на гематологическом миксере. Аликвоту объемом 0,5 см³ извлекали из криовиалы и переливали во флакон SPME объемом 10 см³. Затем в образец сыворотки добавляли 40 см³ аликвоты меченого внутреннего стандарта  (ISTD), герметично закрывали и перемешивали с помощью вортексера  в течение 5 мин. После подготовки образца флаконы помещали в лоток для образцов с охладителем Пельтье (15 ºC) на автосамплере PAL.

Инструментальный анализ. Образцы крови на содержание ПХДД, ПХДФ были проанализированы с помощью газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией высокого разрешения (HRGC-HRMS) в режиме селективного ионного мониторинга. Аналитическая процедура представляла собой внутреннюю адаптацию методов EPA США 1613B и 1668C [28-29].

Подготовка образцов крови к химическому анализу по методам EPA США 1613B и 1668C. К образцам крови объемом  20 см³ добавляли стандартные растворы ПХДД, ПХДФФ с маркировкой 13С, используемые в качестве внутренних стандартов. Для денатурации белков сыворотки центрифугировали двумя аликвотами смеси изопропанол/муравьиная кислота 1:1, а липидную фракцию дважды экстрагировали н-гексаном. После фильтрации через безводный сульфат натрия проводили очистку образца с помощью автоматической системы DEX-Tech ™ (LCTech GmbH, Германия), оснащенной четырьмя различными колонками (кислотный диоксид кремния, флорисил и две колонки с активированным углем). Были собраны четыре фракции полихлорированных диоксинов и фуранов, содержащие NDL-ПХД (фракция 1), моноорто DL-ПХД (фракция 2), неорто DL-ПХД (фракция 3) и ПХДД и ПХДФ (фракция 4). На первом этапе образец пропускали через колонку с кислотным диоксидом кремния и элюировали 70 см³ н-гексана, полученный элюат пропускали через колонку с флорисилом и первую колонку с активированным углем и собирали фракцию 1; колонку с активированным углем промывали 56 см³ раствора 1:1 (в/в) смесью н-гексан-дихлорметан (фракция 2) и затем выполняли промывку колонки 8 см³ толуола (фракция 3); колонку с флорисилом промывали смесью н-гексан-дихлорметан в соотношении 1:1 (в/в) и пропускали через углеродную колонку, которую затем промывали 56 см³ толуола (фракция 4). Объединяли фракции 1 и 2, и отдельно фракции 3 и 4. Каждую объединенную фракцию уменьшали до объема 50 или 100 см³ и аликвоту переносили во флакон объемом 1 см³ для инструментального определения. В каждом образце измеряли уровень холестерина, фосфолипидов и триглицеридов ферментативными методами [30], по которым оценивали общее содержание липидов («жира»).

Инструментальный анализ. Количественное определение ПХДД, ПХДФ в образцах крови проводили с помощью Thermo-DFS (Thermo Fisher Scientific Inc., США) с помощью колонки Agilent J&W DB-5MS UI (60 м; 0,25 мм; 0,25 мм. Пределы количественного определения на основе жира находились в диапазоне 1-10 пг/г жира для ПХДД, ПХДФ. Средние кумулятивные концентрации ПХДД и ПХДФ были выражены в эквивалентах токсичности диоксинов (TEQ единиц) с использованием TEFS ВОЗ 2005 года.

Внутренний контроль качества. Для внутреннего контроля качества проанализированы: контрольный образец крови и стандартный образец. Стандартное отклонение повторяемости установлено более |±10%| для отдельных конгенеров и реальных образцов крови, в то время как расширенная неопределенность метода (коэффициент охвата, k ¼ 2) была меньше, чем | ±25% | для отдельных конгенеров и меньше, чем | ±20% | для реальных образцов крови. Показатели полноты извлечения были приемлемыми и находились в диапазоне 40-130%.

 

МЕТОДИКИ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

 

Коллективом авторов [31] разработана хромато-масс-спектрометрическая методика определения фурана и метилфурана в крови, которая основана на жидкостной экстракции полярным органическим растворителем в щелочной среде в течение 5 минут до установления межфазного равновесия с последующим анализом методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором. Методика позволяет выполнять определение фурана и метилфурана в пробах крови со степенью извлечения 98 и 98,5 %  селективно и достоверно с погрешностью не более 20%. Для идентификации фуранов в биосреде применяли масс-спектрометрическое детектирование с регистрацией спектра масс-ионов из библиотеки. Пределы обнаружения (LOD) и пределы количественного определения (LOQ) фурана и метилфурана установлены по величине стандартного отклонения сигнала и угловому коэффициенту калибровочного графика, которые составили: для фурана  (LOD)  0,00011 мг/дм³, (LOQ) 0,0011 мкг/см³. Для метилфурана (LOD)  0,000021 мг/дм³, (LOQ)  0,00021 мг/дм³. 

В РФ исследования на наличие фуранов в крови ограничены. Вместе с тем, проводились исследования на наличие в крови и изучалось влияние на организм конгенеров дибензофуранов совместно с дибензодиоксинами и бифенилами. Анализ биологических образцов на наличие в крови конгенеров выполняли в лаборатории Центра по контролю и профилактики заболеваний США.

Авторы А.В. Коноплев, Р.И. Первунина, А.А. Дударев. и др. [32] провели исследования содержания полихлорированных бифенилов (ПХБ), дибензо-п-диоксинов и дибензофуранов (ПХДД/ПХДФ) в крови коренного населения Российского Севера. Пробы крови на анализ конгенеров ПХДД/ПХДФ отбирали только у взрослого населения. Объем крови составлял 10 см³. Отделение плазмы производили центрифугированием при 3000 об/мин.

После отбора пробы крови замораживали и до проведения анализа хранили при температуре -20±2 °С. Образцы плазмы взвешивали с точностью до 0,01 г, помещали в коническую колбу объемом 100 см³ и добавляли раствор внутреннего изотоп-меченного стандарта ¹³С (¹³С₁₂). К пробам добавляли  5 см³ метанола для коагуляции белков и экстрагировали смесью гексана и метил-трет-бутилового эфира в соотношении 1:1 по объему. Экстракцию проводили двумя порциями растворителя в течение 5 мин. Объединенный экстракт высушивали над безводным сульфатом натрия. Очистку экстракта для анализа конгенеров ПХДД/ПХДФ проводили на многослойной колонке с силикагелем: с активированной смесью алюминия (10 г); на колонке с 4,5 % углерод/цеолит; с активированным оксидом алюминия (3 г). Для инструментального анализа использовали 10-20 мм³ подготовленного образца крови. Для анализа конгенеров ПХДД/ПХДФ использовали смесь NK-IS-A, 1199, cодержащую изотоп-меченные растворы ¹³С₁₂-1234-TCDD и ¹³С₁₂-123789-HxCDD.

Изомерспецифический анализ плазмы крови на содержание конгенеров ПХДД/ПХДФ проводили методом ГХ/МС на приборе SATURN 1200 MS/MSс использованием химической ионизации и детектированием отрицательных ионов, характеризующих определяемые соединения в режиме селективного ионного мониторинга (SIM). Предел обнаружения для отдельных конгенеров ПХДД/ПХДФ варьирует от 0,08 до 3 нг/дм³. Максимальные средние концентрации конгенеров ПХДД/ПХДФ, обнаруженных в крови жителей северных территорий России изменялись от 5 до 9,4 пг. Следует отметить, что информация по уровням конгенеров ПХДД/ПХДФ в крови представителей северных народов ограничена.

Таким образом, на основании анализа зарубежных источников научно-технической и методической литературы для идентификации и количественного определения фурана и его производных в биологических матрицах зарубежными авторами используется два вида методов:  радиохимический и метод изотопного разбавления.  Анализ выполняется с помощью методов газовой хроматографии высокого разрешения/масс-спектрометрии высокого разрешения (HRGC/ID-HRMS) с добавлением внутреннего стандарта изотопов. Для извлечения и концентрирования фурана и его производных из биологических матриц широко применяются жидкостная экстракция с использованием органических растворителей в качестве экстрагентов. Эффективное извлечение фурана и его производных из биосред  достигается за счет использования современного оборудования: автоматическая твердофазная экстракция с последующей автоматической очисткой Power-Prep/6 (Fluid Management Systems) и процедура концентрирования с использованием многослойного силикагеля (кислотный, основной и нейтральный диоксид кремния) и колонн оксида алюминия, соединенных с углеродной колонной AX-21. Применяемые методики определения фурана и его производных в биологических средах характеризовались низкими пределами обнаружения,  которые варьировали от 0,076 до 2,77 мкг/дм³ и обеспечивают линейность в диапазоне концентраций фурана и его производных с коэффициентами определения >0,992. Полнота извлечения из сыворотки крови составляет от 84,5% до 113%, точность анализа варьировала от 0,38% до 8,78%, при воспроизводимости ≤11% и ≤8% соответственно.

Анализ литературных данных свидетельствует, что развитие и совершенствование методологии биомониторинга с расширением спектра определяемых специфических биомаркеров повышает объективность оценки риска развития болезней, обусловленных воздействием химического фактора.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

 

Анализ научно-методических материалов отечественных и зарубежных исследователей показал, что для успешного развития биомониторнига в РФ как подсистемы социально-гигиенического мониторинга необходима разработка концепции системы биомониторинга с последующим формированием технологической, институциональной и организационной основы системы биомониторинга, а также совершенствование российской нормативно-методической базы.

 

 

About the authors

Tatyana Nurislamova

Federal Budgetary Institution of Science "Federal Scientific Center for Medical and Preventive Technologies for Managing Population Health Risks"

Author for correspondence.
Email: nurtat@fcrisk.ru
ORCID iD: 0000-0002-2344-3037
SPIN-code: 1140-1216

Заведующий лабораторией методов газовой хроматографии

Russian Federation

Nina Vladimirovna Zaitseva

Federal Scientific Center for Medical and Preventive Health Risk Management Technologies

Email: znv@fcrisk.ru
ORCID iD: 0000-0003-2356-1145
SPIN-code: 7036-3511

Academician of the Russian Academy of Sciences, Doctor of Medical Sciences, Professor

Russian Federation

Nina Anatolyevna Popova

Email: popova@fcrisk.ru
ORCID iD: 0000-0002-9730-9092
SPIN-code: 3754-4800
Russian Federation

Olga Andreevna Maltseva

Email: malceva@fcrisk.ru
ORCID iD: 0000-0001-7664-3270
SPIN-code: 7310-6523
Russian Federation

References

Supplementary files