CONCENTRATIONS OF PERIPHERAL BLOOD LYMPHOCYTES INTRACELLULAR METABOLIC REGULATORS IN RESIDENTS OF THE EUROPEAN NORTH OF RUSSIA

Full Text

Введение Клеточный метаболизм координирует Т-клеточную активацию, дифференциацию, функции и в конечном итоге Т-клеточно-опосредованный иммунный ответ [1, 2]. Данная концепция получила название «иммунометаболизм», связывая две различные физиологические системы: иммунитет и метаболизм [15, 22]. Находящиеся в покое наивные Т-клетки имеют метаболизм преимущественно катаболической направленности, используя главным образом глюкозу, жирные кислоты и аминокислоты в качестве «топливных» молекул для генерации АТФ в митохондриях по пути окислительного фосфорилирования (OXPHOS) [8]. После активации Т-клеток инициируется их дифференциация и пролиферация, повышается относительно покоя интенсивность анаболических процессов, для обеспечения которых активно привлекается гликолиз (эффект Варбурга), способствуя не только быстрой продукции АТФ, но и поставляя метаболиты для биосинтезов жирных кислот, нуклеотидов, аминокислот [2, 18]. Интересно, что для удовлетворения многократно возросших энергетических и пластических потребностей в активированных Т-клетках происходит кооперация гликолиза и путей митохондриального метаболизма [27], чему способствует хорошо отлаженная работа механизмов их регуляции. Одним из ключевых регуляторов функционирования митохондрий служит сиртуин 3 (SIRT3), который влияет на проницаемость митохондриальной мембраны, защиту от повреждающего действия активных форм кислорода, работу цикла трикарбоновых кислот (ТСА) и цепи переноса электронов (ЕТС) [9]. Другой участник метаболического сигналинга гипоксией индуцируемый фактор 1 (HIF-1) увеличивает экспрессию генов вовлеченных в гликолиз белков: ключевых ферментов и мембранных транспортеров глюкозы [23]; повышает интенсивность гликолитического потока через регуляцию активности лактатдегидрогеназы А (LDHA), киназы пируват дегидрогеназы 1 (PDK1) [10] и монокарбок-силатного транспортера 4 (МСТ4) [28], стимулируя как превращение пирувата в лактат, так и удаление лактата из клеток. И гликолиз, и митохондриальные процессы оказывают влияние на дифференциацию, фенотипическую стабильность и дальнейшую судьбу Т-клеточных субпопуляций [1, 5, 18]. Роль метаболических сенсорных молекул, сигнальных путей и механизмов их взаимодействия в настоящее время активно изучается как в физиологическом, так и патофизиологическом аспектах. Целью исследования было определить изменение содержания регуляторов метаболизма (HIF-1a, SIRT3) и уровня антигенов дифференциации лимфоцитов периферической крови у практически здоровых северян. Методы Все исследования проводились с согласия волонтеров и в соответствии с требованиями Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации об этических принципах проведения медицинских исследований (2000). В обследовании приняли участие 28 человек, жителей Архангельской области (16 женщин и 12 мужчин в возрасте от 23 до 60 лет). У волонтеров забиралась венозная кровь утром натощак. Комплекс проводимого исследования включал выделение лимфоцитарной фракции крови, в которой определялись содержание дифференцировочных антигенов (CD) и концентрации HIF-1a и SIRT3 в лимфоцитах. CD-типирование лимфоцитов (CD4 + , CD8 + , CD10+, CD71+) проводили методом непрямой иммунопероксидазной реакции (реактивы ООО «Сорбент», Россия). Концентрации HIF-1a и SIRT3 определяли в клеточном лизате лимфоцитов с помощью иммуноферментного анализа на автоматическом анализаторе «Evolis» фирмы «Bio-RAD» (Германия). Статистическая обработка результатов исследования проводилась в программе «Statistica 10.0» («StatSoft», США). В модуле многомерный разведочный анализ использовали метод «К средних» для кластеризации данных. В модуле описательные статистики вычисляли средние значения (M), стандартное отклонение (SD), для проверки данных на нормальность распределения использовали критерий нормальности Колмогорова - Смирнова и Лиллие-форса. При распределении, близком к нормальному, для сравнения результатов вычисляли Т-критерий Стьюдента, различия считали значимыми при p < 0,05. Результаты По результатам кластерного анализа методом «К средних» были выделены две группы из числа обследуемых, статистически значимо различающиеся по всем определяемым показателям (таблица). Значения определяемых показателей в выделенных кластерным анализом группах Показатель Кластер 1 (n = 19) M (SD) Кластер 2 (n = 9) M (SD) Уровень значимости Р Лимфоциты, ХІ06 кл/мл 1,81 (0,373) 2,63 (0,312) <0,0001 CD4, х106 кл/мл 0,69 (0,234) 0,93 (0,232) 0,0217 CD8, х106 кл/мл 0,68 (0,206) 0,99 (0,203) 0,0010 CD10, х106 кл/мл 0,68 (0,188) 1,07 (0,278) 0,0002 CD71, х106 кл/мл 0,72 (0,263) 0,95 (0,269) 0,0435 HIF-1a, нг/106 кл 1,34 (0,426) 1,01 (0,347) 0,0407 SIRT3, нг/106 кл 0,36 (0,321) 0,06 (0,034) 0,0118 Как видно из данных таблицы, в группе кластера 2 содержание фенотипов клеток, имеющих высокий уровень метаболической активности (хелперные CD4+ клетки, цитотоксические CD8+ клетки, активированные CD71 + клетки с рецептором к транс-феррину, готовые к пролиферации CD 10+ клетки), было статистически значимо выше по сравнению с группой первого кластера. Уровень внутриклеточных регуляторов HIF-1 а и SIRT3 в лимфоцитах у группы кластера 2 в абсолютных значениях был ниже, в 44 Ekologiya cheloveka (Human Ecology) 2021, 9, pp. 43-47 Original Articles Содержание фенотипов (CD) лимфоцитов и изменение соотношения уровней сигнальных молекул (HIF-1a/SIRT3) в группах кластеров то же время отношение HIF-1a к SIRT3 в 4,5 раза было выше, чем в группе кластера 1 (равнялось 16,8 и 3,7 соответственно), что свидетельствует о повышенной гликолитической активности клеток. Различие в соотношении уровней регуляторов HIF-1a/SIRT3 и изменение количества субпопуляций Т-клеток в группах кластеров отображено на комбинированной диаграмме (рисунок). Обсуждение результатов Функциональная активность, фенотипическая стабильность и выживаемость лимфоцитов во многом определяются изменениями в их метаболизме и регулируются клеточным сигналингом, транскрипцией генов, синтезом белков [2]. При дифференциации из наивных CD4+ предшественников формируются субпопуляции эффекторных и регуляторных клеток (Th1, Th2, Th17 и iTreg), которые характеризуются своими особенностями в реализации определенных транскрипционных программ, направленных на выполнение специализированных функций. Так, Th 1 клетки продуцируют интерферон-у и под контролем транскрипционного фактора T-bet запускают клеточно-опосредованный иммунный ответ [25, 30]. Th2 клетки продуцируют интерлейкин-4 (IL-4), фактор транскрипции GATA3 является регулятором ^2-ассоциированной генной экспрессии [30]. Для Th17 клеток характерна активация транскрипционного фактора RORyt и подавление фактора Foxp3 [21], что происходит за счет активации STAT3 под действием IL-6, IL-21 или IL-23, способствуя экспрессии ^17-специфичных цитокинов IL-17 и IL-22 [30]. Кроме того, STAT3-зависимая индукция приводит к активации транскрипционного фактора HIF-1, критичного для Th17 дифференциации CD4+ клеток [26]. При снижении или отсутствии HIF-1 повышается экспрессия транскрипционного фактора Foxp3 (анта гониста фактора RORyt) и происходит дифференциация в сторону регуляторных iTreg клеток с высокой активностью митохондриального метаболизма [16]. Это определяет важную роль HIF-1 в установлении баланса между Th17 и iTreg клетками [4]. Фактор HIF-1 участвует также и в метаболической перестройке активированных CD8+ клеток, способствует экспрессии генов, кодирующих цитолитические белки (гранзимы, перфорин), и развитию CD8+ клеток с высокой цитотоксической активностью [7]. Клетки иммунной системы находятся в условиях различного микроокружения, и любые сигналы, приводящие к активации киназ MAPK/ERK, PI3K/ Akt/mTOR и транскрипционных факторов NF-kB, АР-1, с-Myc, в разной мере способны активировать HIF-1 неканоническим, кислороднезависимым путем [20, 22]. Ингибиторы пролилгидроксилаз и активные формы кислорода (ROS) тоже могут активировать и стабилизировать HIF-1 [6]. Активация HIF-1 (независимо от способа) сопряжена с переходом клетки на гликолитический тип метаболизма, что характерно для эффекторных Th1, Th2, Th17, СD8+ T-лимфоцитов [26]. HIF-1 увеличивает гликолитическую активность через повышение экспрессии генов транспортеров глюкозы (GLUT1 и GLUT3), многих участвующих в гликолизе ферментов (гексокиназа 2, фосфофрукто-2-киназа, альдолаза А, енолаза 1) [23]; повышает скорость гликолитического потока через стимулирование перехода пирувата в лактат (LDHA) и выхода лактата из клеток (МСТ4) [28]. HIF-1 обуславливает изменения и в митохондриальном метаболизме [27], который играет свою немаловажную роль в Т-клеточной пролиферации. В частности, HIF-сигналинг препятствует митохондриальному окислению пирувата и жирных кислот, подавляя образование ацетил-СоА, необхо 45 Оригинальные статьи Экология человека 2021, № 9, с. 43-47 димого для эффективной работы ТСА. Этому способствует HIF-стимулированная экспрессия негативного регулятора пируват дегидрогеназы PDK1 [10], супрессия транскрипционного ко-активатора рецептора гамма, активируемого пролифераторами пероксисом (PGC-1a) [11], карнитинового переносчика жирных кислот внутрь митохондрий СРТ1 [14]. Также HIF-1 повышенно регулирует продукцию микроРНК miR-210, которая подавляет экспрессию протеинового железо-серного кластера ISCU [3], являющегося компонентом белков, вовлеченных в энергетический метаболизм, включая фермент ТСА аконитазу и комплекс IV ЕТС [3], что негативно влияет на работу ЕТС и снижает эффективность OXPHOS. В то же время HIF-сигналинг стимулирует анаплеротическую наработку ацетил-СоА, повышая глутаминолиз через активацию ряда ферментов: глутаминазы 1 (конвертирует глутамин в глутамат), митохондриальной убиквитин лигазы SIAH2 (ведет к протеасомной деградации фермента ТСА 2-оксоглутаратдегидрогеназы, что препятствует переходу 2-оксоглутарата (2-OG) в сукцинил-СоА) [24], изоцитратдегидрогеназы 1 и 2 (катализирует восстановительное карбоксилирование 2-OG до цитрата) [29]. Вместе с этим возрастает использование наработанного ацетил-СоА для ли-погенеза, благодаря HIF-опосредованной экспрессии липина 1 [17], который регулирует предпоследний шаг синтеза триглицеридов. В целом HIF-сигналинг негативно влияет на митохондриальную продукцию АТФ и оказывает позитивный эффект в отношении пластической роли митохондриальных процессов в период пролиферативной активности Т-клеток. В отличие от эффекторных, для iTreg и СD8+ клеток памяти характерно повышение митохондриального метаболизма [13]. Этому способствует SIRT3 [19], который активирует ß-окисление жирных кислот до ацетил-СоА через регуляцию ацил-СоА дегидрогеназы длинноцепочечных жирных кислот, повышает работу ТСА и ЕТС (активирует ферменты изоцитратдегидро-геназу 2, суцинатдегидрогеназу и комплексы I-IV); увеличивает скорость продукции и нейтрализацию ROS с помощью супероксиддисмутазы 2; стимулирует глутаматдегидрогеназу, проявляя однонаправленность действия с HIF-1 в своем влиянии на глутаминолиз. Кроме того, SIRT3 позитивно влияет на PGC-1a, играющего главную роль в регуляции активности митохондриального биогенеза и окислительных процессов [12]. Результаты проведенного исследования показывают, что при изменении уровня регуляторов глико-литического (HIF-1a) и митохондриального (SIRT3) метаболизма и главным образом их соотношения меняется содержание фенотипов Т-клеток. В частности, нами установлено, что при сдвиге отношения HIF-1a к SIRT3 в сторону активатора гликолиза HIF-1a увеличилось число CD4+, CD8+, CD 10+, CD71 + клеток, что отражает зависимость их функций от гликолитической активности. Заключение Контролируемая через механизмы клеточного сиг-налинга активация тех или иных метаболических путей определяет Т-клеточную функциональную специфичность и пролиферативную активность. Имеющая место в условиях достаточной обеспеченности клеток кислородом STAT3 активация экспрессии HIF-1 приводит к доминированию гликолитического типа метаболизма, способствует дифференциации эффекторных Т-клеток, экспрессии генов костимулирующих молекул и факторов, обеспечивающих специфичность их действия. При этом в этих клетках снижается SIRT3 регулируемая активность митохондриальных процессов. Важным для оценки направленности внутриклеточного метаболизма является установление соотношения уровней HIF-1a и SIRT3 в Т-лимфоцитах. Изучение роли сигнальных молекул в регуляции интенсивности и направленности метаболизма Т-клеток может послужить предметом дальнейших исследований как в отношении более детального понимания механизмов их действия, так и в отношении поиска триггерных точек для коррекции иммунных нарушений.

About the authors

O. V. Zubatkina

N. Laverov Federal Center for Integrated Arctic Research of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: ozbiochem@gmail.com
Archangelsk, Russia

L. K. Dobrodeeva

N. Laverov Federal Center for Integrated Arctic Research of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Archangelsk, Russia

A. V. Samodova

N. Laverov Federal Center for Integrated Arctic Research of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Archangelsk, Russia

S. D. Kruglov

N. Laverov Federal Center for Integrated Arctic Research of the Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Archangelsk, Russia

References

Supplementary files