COPPER (II) OXIDE NANOPARTICLES TOXICITY AND POTENTIAL HUMAN HEALTH HAZARDS

Full Text

Введение В настоящее время наноматериалы получили активное распространение в различных сферах хозяйственной деятельности человека [5]. Согласно анализу нанотехнологических рынков, проведённому компанией LUX Research, мировая выручка от реализации продуктов наноиндустрии в мире в 2018 году составила порядка 5 трлн долларов США и прогнозируется, что в 2020 году превысит 6 трлн долларов США [1]. Наноматериалы получили широкое распространение благодаря своим уникальным физико-химическим свойствам, обусловленным малым размером, высокой удельной площадью поверхности, формой, поверхностным зарядом и др. При этом данные свойства придают наноматериалам способность более эффективно относительно крупноразмерных материалов проникать через защитные барьеры организма, взаимодействовать с клетками и тканями органов, результатом чего может являться нарушение их функций и развитие патологий [27]. Одним из таких материалов являются наночастицы оксида меди (II) - НЧ CuO. Данный наноматериал используют в медицине (в биоцидных препаратах), электронике (в суперконденсаторах, полупроводниках, датчиках, солнечных батареях, сенсорах), сельском хозяйстве (в составе удобрений и пестицидов), аэрокосмической отрасли (в качестве катализатора горения топлива) [3, 7]. Широкий спектр применения НЧ CuO приводит к увеличению объёма их производства. Так, в 2010 году объём мировой продукции нанодисперсного CuO оценивается в 200 тонн, в 2014-м - 570 тонн, а к 2025-му ожидается увеличение производства до 1 600 тонн/год [13]. В связи с крупнотоннажным характером производства, а также широким и интенсивным использованием НЧ CuO возрастает вероятность экспозиции работников предприятий наноиндустрии и населения, потребляющего продукцию, содержащую в своём составе НЧ CuO. Исходя из вышесказанного, возникает необходимость в изучении физических и токсикологических свойств НЧ CuO при различных путях поступления в организм для задач разработки эффективных мер профилактики их негативного воздействия. Целью данной работы является научное прогнозирование токсичности и оценка потенциальной опасности биологического действия наноразмерного CuO для здоровья человека. Методы Собственные экспериментальные исследования по изучению физических свойств НЧ CuO проведены в сравнении с микродисперсным аналогом с использованием коммерческих образцов, произведенных компанией Sigma-Aldrich с помощью термической плазменной технологии. Химический состав тестируемых материалов устанавливали методом рентгеноспектрального микрозондового анализа. Исследование проводили на дифрактометре D8 ADVANCE ECO с детектором SSD-160 («Bruker») с использованием базы данных «ICDD PDF-4+ 2015». Оценка размера частиц тестируемого материала выполнена методом растровой электронной сканирующей микроскопии (РЭМ) на сканирующем микроскопе высокого разрешения S-3400N (HITACHI, Япония). Форму и характер поверхности частиц определяли методом анализа изображений с использованием универсального программного обеспечения ImageJ-FiJi, по результатам которого рассчитан коэффициент сферичности и созданы трёхмерные реконструкции поверхности. Удельную площадь поверхности частиц рассчитывали методом, предложенным Брунауэром, Эмметом и Теллером, на приборе ASAP 2020 (Micromeritics, США) после дегазации в вакууме при температуре 350 °С в течение трех часов. Оценка потенциальной опасности НЧ CuO выполнена в соответствии с МР 1.2.2522-09 «Методические рекомендации по выявлению наноматериалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека». Аналитическое обобщение информации по свойствам вещества выполнено по данным, представленным в аннотируемых источниках научной литературы и результатам собственных исследований физических свойств. Выполнено классифицирование полученной информации о свойствах частиц по следующим функциональным блокам: физический, 51 Оригинальные статьи Экология человека 2021, № 11, с. 50-57 физико-химический, молекулярно-биологический, цитологический, физиологический и экологический. На основании выполненного ранжирования в соответствии с методическими рекомендациями анализируемых критериальных признаков опасности и последующего прогнозно-аналитического моделирования выполнили расчёт «частной» опасности (Dk) для каждого функционального блока. Расчёт Dk осуществляли по формуле: mar <Pi ,d) где k - порядковый номер функционального блока, i - порядковый номер признака, N - общее число признаков в функциональном блоке, R. - оценка выраженности признака в баллах, Rmax - максимально возможная балльная оценка данного признака, Ф. - значение «взвешивающей функции» для i-го признака в соответствии с его рангом, приведённым в МР 1.2.2522-09. По результатам расчета Dk рассчитывали коэффициент потенциальной опасности (D) наноразмерного CuO по формуле: d = v£J=1d£.(2) где D^ - величина «частной» опасности. На основании полученной величины D определяли степень потенциальной опасности по рекомендованным критериям: при значениях D, входящих в диапазон 0,441 - 1,110, присуждается низкая степень потенциальной опасности; 1,111 - 1,779 - средняя степень; 1,780-2,449 - высокая степень. Для полученной величины D рассчитывали степень его неопределённости, выражаемую в виде коэффициента неполноты оценки (U). Данный коэффициент тем больше, чем в большем числе случаев в анализируемом массиве источников отсутствуют сведения об оценке для наночастицы того или иного признака по каждому из функциональных блоков. Коэффициент U рассчитывали по формуле: ■'З Б где U - коэффициент непоноты оценки, и- коэффициент, принимающий значение «1», если i-й признак признаётся неопределённым (отсутствует информация в научной литературе) и «0» - при любой другой его оценке, ф. - величина «взвешивающей функции» данного признака. При значениях коэффициента U, входящих в диапазон 0,000-0,250, выполненная оценка потенциальной опасности считается достоверной; 0,251-0,750 - сомнительной, 0,751 - 1,000 - недостоверной. Результаты При исследовании образцов нано- и микро-дисперсного CuO методом рентгеноспектрального микрозондового анализа установлено, что химическая формула веществ соответствует заявленной в паспорте производителя, о чем свидетельствуют идентифицированные пики (рис. 1). По результатам собственных исследований средний размер частиц нанопорошка CuO, установленный ме- Рис. 1. Рентгенограмма образцов нано- и микрочастиц CuO 52 Ekologiya cheloveka (Human Ecology) 2021, 11, pp. 50-57 Original Articles а (a) б (b) Рис. 2. Изображение нано- (а) и микрочастиц (б) CuO с помощью РЭМ (на стрелках указаны размеры частиц) 64,33 6,0-50,0 50,0-100,0 размер частиц, нм а (a) 27,10 100,0-1000,0 0,08 2,0-5,0 5,0-10,0 10,0-15,0 15,0-20,0 20,0-25,0 25,0-30,0 30,0-35,0 35,0-40,0 размер частиц, мкм 6(b) Рис. 3. Фракционный состав нано- (а) и микрочастиц (б) CuO тодом РЭМ, составил 45,86 нм, что в 303 раза меньше значения данного показателя у частиц микропорошка (13,90 мкм) (рис. 2). Большая доля частиц (64,33 %) нанопорошка имеет размер 6-50 нм, доля наночастиц размером до 100 нм составила 93,28 % от общего количества частиц (см. рис. 2). В составе микропорошка большую долю (27,10 %) составляют частицы размером 15-20 мкм, общий диапазон фракционного состава при этом составляет 2,9-38,6 мкм (рис. 3). Анализ полученных изображений позволил установить, что коэффициенты сферичности как нано-, так и микрочастиц соответствуют угловатой форме и равны 0,59 и 0,66 соответственно. Удельная площадь поверхности наночастиц составила 17,70 м2/г, что в 9,6 раза выше данного показателя у микрочастиц (1,84 м2/г). При трёхмерной реконструкции наночастиц установлено, что их поверхность не содержит значимых перепадов рельефа, однако является выраженно шероховатой, в то время как микрочастицы обладают развитой рельефной поверхностью с пластинчатыми выступами (рис. 4). 53 Оригинальные статьи Экология человека 2021, № 11, с. 50-57 а б Рис. 4. Трёхмерная реконструкция поверхности нано- (а) и микрочастиц (б) CuO Наночастицы CuO нерастворимы в воде, однако растворяются в среде желудочно-кишечного тракта. В исследовании [16] установлена растворимость изучаемого наноматериала в течение 24 часов в смоделированной рН желудка (рН 1,5) в количестве 84,5 % от общего числа частиц, в рН кишечника (рН 7,8) - 0,09 %. При этом частицы микродисперсного аналога показали значительно более низкую растворимость: в желудочной среде - 17,2 %, в кишечной - 0,03 %. Известно, что от значения рН среды также зависят поверхностный заряд НЧ CuO, их адсорбционная ёмкость и устойчивость к агрегации. Так, дзета-потенциал наночастиц исследуемого материала имеет положительные значения в кислой среде и отрицательные в щелочной. При рН 6,21 наночастицы имеют нулевой заряд [20]. При увеличении рН среды увеличивается адсорбционная ёмкость НЧ CuO, что установлено на ионах Pb2+, адсорбция которых при рН 6,5 составила 100 % [11]. При снижении рН в щелочной среде снижается сила электростатического отталкивания, что приводит к образованию агломератов. При уменьшении значения рН в кислой среде сила отталкивания возрастает, что препятствует образованию агломератов. Таким образом, суспензия НЧ CuO обладает наименьшей стабильностью при значениях рН, близких к 6 [20]. В научной литературе не найдено данных о гидро-фобности/гидрофильности НЧ CuO, однако данная характеристика описана для наноразмерных плёнок исследуемого химического соединения методом измерения угла контакта с водой. По результатам исследования [17], у плёнок толщиной 55 нм угол контакта составляет 106°, что указывает на гидрофобность материала. При толщине плёнки более 100 нм угол контакта составляет 90°, что указывает на гидрофиль-ность материала. Таким образом, при увеличении толщины смачиваемость плёнок CuO трансформируется из гидрофобности в гидрофильность. Известно, что НЧ CuO оказывают биологическое действие на организм при пероральном и ингаляционном путях поступления, в то время как проникновение изучаемого наноматериала перкутанным путём незначительно [6, 12, 14, 30]. Как говорилось выше, НЧ CuO активно растворяются в желудочной среде, после чего диссоциированные ионы Cu2+ могут всасываться в кровеносное русло, распространяться по организму и накапливаться в органах и тканях [16]. По результатам исследования [14] отмечено бионакопление меди в печени, лёгких, почках, селезёнке, тимусе и брыжеечных лимфатических узлах при пятикратном пероральном введении крысам суспензии НЧ CuO. При внутрибрюшинном введении кумуляция меди установлена в печени и почках [22]. Стоит отметить, что растворение в желудочной среде неполное, а в кишечной среде незначительное, в связи с этим как продуцированные ионы Cu2+, так и сами НЧ CuO следует рассматривать в качестве инициаторов токсических процессов [14]. Результаты исследований in vitro на клеточно-молекулярном уровне показали, что частицы наноди-сперсного CuO проникают внутрь клеток, нарушая целостность и функции клеточной мембраны [25], после чего накапливаются в цитоплазме и ядре [2]. Отмечено накопление НЧ CuO в лизосомах, которые, как известно, имеют кислую среду (рН 5,5), что способствует диссоциации исследуемого наноматериала и генерации ионов Cu2+ [31]. Накопление НЧ CuO выявлено в митохондриях, что, вероятнее всего, способствует изменению структур данной органеллы, нарушению цепи переноса электронов и увеличению продукции активных форм кислорода (АФК), приводя к митохондриальной деполяризации, а в дальнейшем к развитию окислительного стресса [24]. Способность НЧ CuO генерировать свободные радикалы, в частности АФК, отмечена в исследованиях in vitro на клетках линии эпидермоидной карциномы гортани [10], аденокарциномы альвеолярного базального эпителия (А549) [15], почечного эпителия Xenopus laevis [28], эпидермиса кожи человека (HaCaT) [2], нейробластомы мыши [21]. Генерация свободных радикалов отмечена в исследованиях in vivo в почечном гомогенате мышей и в печёночном гомогенате крыс, экспонированных НЧ CuO [4, 24]. Избыточные уровни свободных радикалов, индуцируемых НЧ CuO, способны запустить процесс апоптоза, что приводит к гибели клеток [23]. В исследованиях in vitro установлено снижение жизнеспособности клеток линий Ha CaT [2], А549 [15], 54 Ekologiya cheloveka (Human Ecology) 2021, 11, pp. 50-57 Original Articles бронхиального эпителия человека [26] и эндотелия пупочной вены человека [31] после экспозиции исследуемым наноматериалом. Цитотоксичность НЧ CuO проявляется не только во взаимодействии с мембранами и органеллами, но и с ДНК и белками. Установлено, что изучаемый наноматериал способен вызывать фрагментацию и окислительное повреждение ДНК в клетках различных линий [2, 15, 21, 22, 26, 29]. Наночастицы CuO не только опосредованно вызывают повреждение клеточных белков через продуцирование АФК [10], но и способны влиять на уровни их экспрессии, что выражается в изменении протеомного профиля. Так, экспозиция мышиных макрофагов клеточной линии J774A1 НЧ CuO приводит к увеличению синтеза гемоксигеназы и глутатиона, снижению уровня тетрагидробиоптерина [29]; в клетках линии бронхиального эпителия человека вызывает увеличение уровней белков, отвечающих за различные функции клетки, в том числе: синтез белка, процессы гибели и выживаемости, регуляцию клеточного цикла [9]. Способность к бионакоплению и цитотоксиче-ские свойства НЧ CuO могут приводить к развитию патоморфологических нарушений в тканях органов-мишеней. По результатам исследований in vivo, у крыс, перорально экспонированных нанодисперсным CuO, установлены патоморфологические изменения тканей печени в виде внутрицитоплазматической вакуолярной дегенерации (гидропической или вакуольной дистрофии) при остром однократном действии исследуемого наноматериала [18], воспаление, некроз и гиперплазия при субхроническом действии [14]. Нарушение функций печени проявляется в изменении биохимических параметров, а именно в увеличении уровней аланинаминотрансфразы, аспартатаминотрансферазы, лактатдегидрогеназы, щелочной фосфатазы и гамма-глутамилтрансфе-разы [6, 14]. Также при пероральной экспозиции НЧ CuO зафиксировано воспаление подслизистого железистого эпителия желудка [14]. При введении исследуемого наноматериала внутрибрюшинно в печени отмечено увеличение числа клеток Купфера, в почках - дегенерация и некроз эпителия канальцев [22]. При ингаляционной экспозиции крыс отмечены альвеолит, бронхиолит, вакуолизация бронхиального эпителия и эмфизема в тканях лёгких и дегенерация обонятельного эпителия [12]. Вероятно, развитие патологий тканей органов, вызванное действием НЧ CuO, обусловлено окислительным стрессом, на что указывает снижение активности супероксиддисмутазы и глутатиона, увеличение уровней каталазы и малонового диальдегида в тканях экспонированных животных [6]. Наночастицы CuO проявляют специфические и отдалённые эффекты токсичности. Действие исследуемого наноматериала вызывает фрагментацию ДНК, аналогичную действию циклофосфамида, что говорит о генотоксичности нанодисперсного CuO [21]. Спо собность НЧ CuO повреждать ДНК может указывать на канцерогенный потенциал данного наноматериала [22]. Известно, что наноразмерный CuO индуцирует секрецию провоспалительных цитокинов (TNFa, MIP-1Р), циклооксигеназы COX-2 и простагландина Е2, что свидетельствует о подавлении иммунного ответа, основанного на действии макрофагов [19]. Рассматривая экологические характеристики НЧ CuO, необходимо учесть его массовость производства, данные о накоплении в организмах и объектах окружающей среды и возможность экспонирования населения. Основными источниками загрязнения окружающей среды наночастицами исследуемого наноматериала являются сточные воды систем городского водоснабжения, поскольку в них оказываются продукты личной гигиены с содержанием НЧ CuO, и сточные воды сельскохозяйственных систем, так как наноразмерная медь используется в составе удобрений и пестицидов [3]. Высока вероятность того, что в процессе очистки сточных вод НЧ CuO не подвергаются элиминации и попадают обратно в систему водоснабжения вместе с обработанной водой, а использование исследуемого наноматериала в аграрном секторе приводит к загрязнению почв и сельскохозяйственных продуктов питания [3]. Обширное применение, крупнотоннажный характер производства и загрязнение объектов окружающей среды НЧ CuO может привести к экспонированию населения в масштабах страны. Оценка комплекса физических, физико-химических, молекулярно-биологических, цитологических, токсикологических и экологических характеристик и ранжирование критериальных признаков опасности позволили вычислить коэффициент потенциальной опасности НЧ CuO для здоровья человека (D = 2,163), соответствующий диапазону 1,780-2,449. При этом потенциальная опасность НЧ CuO оценена как «высокая». Установленный показатель потенциальной опасности имеет достоверную степень оценки имеющейся информации, так как коэффициент неполноты оценки (U) составил 0,03, что укладывается в критериальный диапазон 0-0,250, оцениваемый как «оценка достоверна». Обсуждение результатов В работе представлены материалы по изучению физических, физико-химических, молекулярно-биологических, цитологических, физиологических и экологических свойств НЧ CuO. В ходе собственных экспериментальных исследований установлено, что изучаемый образец соответствует заявленной химической формуле. По показателям размера (45,86 нм), удельной площади поверхности (17,70 м2/г), коэффициенту сферичности (0,59) и характеру поверхности является наноматериалом, содержащим в своём составе шероховатые наночастицы угловатой формы. Результаты исследования физических свойств НЧ CuO позволяют предполагать способность данного образца проявлять токсические свойства, что подтверждается имеющи 55 Оригинальные статьи Экология человека 2021, № 11, с. 50-57 мися сведениями в научной литературе о токсических свойствах НЧ CuO [12, 14, 18, 22, 24]. В аннотируемых источниках указано, что ряд физико-химических свойств (растворимость, заряд, адсорбционная ёмкость, устойчивость к агрегации) НЧ CuO зависит от рН среды. Обладая малым размером и высокой удельной площадью поверхности, данный наноматериал способен эффективно проникать в организм, генерировать свободные радикалы и взаимодействовать с клеточными мембранами, ультраструктурами клеток, белками и ДНК, что в свою очередь обуславливает цитотоксические свойства и способность влиять на протеомный профиль. Действие НЧ CuO на клеточномолекулярном уровне отражается в виде патоморфологических изменений тканей органов, в генотоксическом, канцерогенном и иммунотоксическом эффектах. В связи с тем, что НЧ CuO являются крупнотоннажным промышленным продуктом с широким спектром приме -нения, загрязняющим окружающую среду и продукты питания, воздействию данного наноматериала может подвергнуться население в масштабах страны. В ходе выполнения процедуры прогнозно-аналитического моделирования и ранжирования критериальных признаков опасности установлено, что НЧ CuO обладают высокой степенью потенциальной опасности. Несмотря на отсутствие в научной литературе отдельных признаков, характеризующих свойства наночастиц (адгезия к поверхностям, усиление проницаемости барьеров организма для посторонних токсикантов), полученные результаты оценки потенциальной опаности являются достоверными, о чём свидетельствует рассчитанный коэффициент неполноты оценки данных. Стоит отметить, что согласно классификации «Систама идентификации опасных материалов» (Hazardous Materials Identification System, HMIS) НЧ CuO обладают малой опасностью для здоровья человека (первый ранг опасности) [8]. При этом классификация HMIS применяется к материалам любой размерности и при оценке опасности для здоровья человека учитывает только токсические характеристики, в то время как МР 1.2.2522-09 разработаны специально для оценки опасности наноматериалов и учитывают комплекс различных свойств. В связи с этим степень опасности НЧ CuO различна при оценке в соответствии с HMIS и МР 1.2.2522-09. Выводы На основании ранговой оценки и прогнозного моделирования критериальных признаков опасности наноразмерных частиц исследуемого материала установлено, что НЧ CuO обладают высокой степенью потенциальной опасности для здоровья человека. В связи с этим необходимым является проведение детальных токсикологических исследований, составление токсиколого-гигиенической характеристики НЧ CuO при различных путях поступления в организм и разработка профилактических мер для производителей и потребителей продукции, содержащей наночастицы данного материала. Авторство Зайцева Н. В. участвовала в постановке задачи исследования и аналитическом обобщении материала; Землянова М. А. участвовала в редактировании содержания статьи, утвердила присланную в редакцию рукопись; Степанков М. С. участвовал в поиске и анализе данных, подготовил первый вариант статьи; Игнатова А. М. участвовала в поиске и анализе данных, в подготовке первого варианта статьи.

About the authors

N. V. Zaitseva

Federal Scientific Center for Medical and Preventive Health Risk Management Technologies

M. A. Zemlyanova

Federal Scientific Center for Medical and Preventive Health Risk Management Technologies; Perm State National Research University; Perm National Research Polytechnic University

Email: zem@fcrisk.ru

M. S. Stepankov

Federal Scientific Center for Medical and Preventive Health Risk Management Technologies; Perm State National Research University

A. M. Ignatova

Perm State National Research University; Perm National Research Polytechnic University

References

Supplementary files