ЗНАЧЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СИМПАТОЛИЗИСА В РЕГУЛЯЦИИ РЕГИОНАЛЬНОГО КРОВОТОКА НА ЭПИНЕФРИН НА ФОНЕ 5 ДНЕВНОЙ ХОЛОВОЙ АДАПТАЦИИ

Полный текст

Обоснование

Проблема кратковременной адаптации человека к условиям Европейского Севера, несмотря на значительное число проведенных исследований сохраняет свою актуальность. Особенно важными являются исследования тех групп населения, чья деятельность связана с физической нагрузкой в условиях холода (вахтовые работники, спортсмены).

Состояние физического здоровья человека определяется его способностью выполнять физическую работу в различных условиях внешней среды [1–4]. Главным механизмом, обеспечивающим эффективное выполнение мышечной деятельности, является увеличение сердечного выброса, артериального давления, увеличение перфузии жизненно важных органов при локальной вазодилатации активно работающих мышц (функциональный симпатолизис) [5, 6]. Локальную вазодилатацию вызывают вещества, высвобождаемые из скелетных мышц, эндотелия сосудов и эритроцитов, а остальные феномены – активацией симпатической нервной системой (СНС) и модуляцией активности α1-адренорецепторов, что подчеркивает роль катехоламинов (норадреналина и адреналина) как ключевых медиаторов симпатической регуляции [5–7].

На Севере человек адаптируется прежде всего к холоду и сужение периферических сосудов является адекватной реакцией на воздействие низких температур, известно, что даже кратковременное воздействие холода индуцирует значительное повышение уровня катехоламинов в плазме крови [8] Исследования адаптации к холоду демонстрируют вариабельность методологических подходов: от краткосрочных лабораторных экспозиций (1–5 воздействий в течение 1 дня) до многолетнего естественного воздействия в условиях арктического климата [9–11]. Например, при ежедневных погружениях в холодную воду (14°C, 120 мин) в течение 5 дней у испытуемых наблюдалось снижение кожной температурной реакции на холод по сравнению с контрольной группой [11]. Привыкание к холоду характеризуется быстрым снижением рефлекторных болевых ощущений и холодового дискомфорта, что отмечается уже после 1–2 экспозиций [12–14]. Тогда как физиологические адаптационные изменения (снижение вазоконстрикторных реакций, задержка возникновения дрожи) развиваются в течение 3–11 повторных воздействий [15–19]. Интересно, что метаболические сдвиги, включая переход от дрожи к недрожательному термогенезу, наблюдаются после 3-6-го погружения, что может свидетельствовать о пороговом характере адаптационных процессов [20–25].

Однако системные ограничения сердечного выброса обусловливают необходимость селективного перераспределения кровотока, преимущественно в критически задействованные мышечные группы [26]. Функциональный симпатолизис, или рабочая мышечная гиперемия, обеспечивает увеличение перфузии активных мышц с 2–8 мл/мин/100 г в покое до >100 мл/мин/100 г при нагрузке [6, 27]. Современные данные свидетельствуют о сохранении эффектов функционального симпатолизиса в течение 10 минут после прекращения физической нагрузки, что имеет потенциальное значение для регуляции артериального давления в постнагрузочный период [28].

В контексте холодовой адаптации особый интерес представляет роль СНС и её медиаторов. Установлена прямая корреляция между интенсивностью холодового воздействия и повышением концентрации норэпинефрина и эпинефрина в крови [8]. Однако остаются неисследованными вопросы динамики адренореактивности сосудов на фоне краткосрочной холодовой адаптации. Существующие работы преимущественно фокусируются на длительной адаптации (месяцы/годы), тогда как актуальность изучения кратковременных адаптационных периодов (5–7 дней) обусловлена их частотой в повседневной жизни (спортивные мероприятия, профессиональная деятельность, туризм).

Цель исследования: изучить влияние 5-суточной холодовой адаптации на адренореактивность артериальных сосудов мышц к эпинефрину при функциональном симпатолизисе.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Экспериментальные исследования выполнены на кроликах-самцах (n=65) массой 2,5–3,5 кг. Животные содержались в виварии при стандартных условиях (температура 22±1°C, 12-часовой световой цикл) с обеспечением свободного доступа к воде и корму. Для индукции наркоза использовали внутривенное введение гексенала (30 мг/кг). Антикоагулянтную терапию обеспечивали гепарином (1000 МЕ/кг, в/в). После наркоза выполнена канюлизация бедренной артерии с последующей перевязкой коллатеральных анастомозов для изоляции перфузионного бассейна. Перфузия артерий скелетных мышц конечности осуществлялась через бедренную артерию насосом постоянного расхода 6-8 мл/минуту (модель ПН-2) с установкой начального перфузионного давления на уровне 110-115 мм рт.ст. Эпинефрин вводился в бедренную артерию конечности перед насосом в следующих дозах: 0,5, 1,0, 2, 5, 10, 15, 20 и 30 мкг/1 кг веса животного.

Животные рандомизированы в 4 группы: контрольная группа (N1, n=20) - интактные животные без вмешательств; группа симпатолизиса (N2, n=15) - с электростимуляцией мышц (частота 5 Гц, напряжение 10 В, длительность импульса 5 мс) для индукции функционального симпатолизиса (функциональной рабочей гиперемии); группа холодовой адаптации (N3, n=15) - 5-дневная экспозиция в климатической камере (−10°C, 6 ч/сутки); комбинированная группа (N4, n=15) - сочетание холодовой адаптации и электростимуляции.

Адренореактивность оценивали методом дозозависимого введения эпинефрина (Sigma-Aldrich) в бедренную артерию перед насосом в 8 возрастающих дозах (0,5–30 мкг/кг). Изменение перфузионного давления регистрировали на выходе насоса датчиком MPX5100DP (Motorola) и записывали на компьютер с параллельной записью на самописец TZ4620 (Line Recorder).

Дозозависимые кривые анализировали в двойных обратных координатах (1/D, 1/Pm) Lineweaver–Burk [29-32]. Где Pm (максимальный прессорный ответ, пропорциональный количеству активных адренорецепторов) – обратная величина отрезка на оси ординат. Чувствительность адренорецепторов (1/Km) отрезок на оси абсцисс, откуда Km (константа Михаэлиса) – доза, вызывающая 50% эффект от Pm. Линейная регрессия выполнена методом наименьших квадратов. Величина фармакологического эффекта была прямо пропорциональна концентрации комплексов «лекарственное вещество-рецептор». Максимальный эффект происходит при оккупации 100% адренорецепторов [30].

Статистическая обработка распределения проверена критериями Шапиро-Уилка (p>0,1) и Колмогорова-Смирнова (p>0,15). Межгрупповые сравнения оценены парным t-критерием Стьюдента. Данные представлены как M±m. Данные считались достоверными при уровне значимости p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Сравнительный анализ адренореактивности артерий скелетных мышц в контрольной группе (N1, n=20) выявил статистически значимое различие (p<0,01) снижения  прессорного действия всех 8 доз эпинефрина на артерии конечности при симпатолизисе (N2, n=15) (табл. 1, рис. 1). При анализе результатов по Лайниуверу-Берку максимальный прессорный ответ (Pm) в обеих группах оставался одинаковым: 222.0±6.7 мм рт.ст. (N1) в контроле и 222.0±7.5 мм рт.ст. (N2) при симпатолизисе (p<0,05). Однако параметр чувствительности α-адренорецепторов (1/Km) при симпатолизе продемонстрировал 24.3-кратное снижение: с 1.2±0.04 (N1) в контроле до 0.049±0.0016 (N2) при симпатолизисе, что подтверждено анализом дозозависимых кривых в координатах Лайнуивера-Берка (рис. 2) и характеризовалось конкурентным типом ингибирования  реакции медиатор рецептор.

Пятисуточная холодовая адаптация (N3, n=15) усилила вазоконстрикторный ответ на эпинефрин во всем диапазоне доз (0.5-30 мкг/кг), за исключением минимальной дозировки (0.5 мкг/кг), где различия с контрольной группой (N1) не достигли статистической значимости (p>0.05). В комбинированной группе (N4, n=15) сочетание холодовой адаптации и симпатолизиса привело к достоверному (p<0.05) усилению адренергического ответа по сравнению с группой N2 (симпатолизис), что свидетельствует о нивелирующем влиянии холодовой экспозиции на механизмы функциональной гиперемии. Полученные данные позволяют заключить: физиологический симпатолизис реализуется через модуляцию чувствительности α-адренорецепторов без изменения их количества, краткосрочная холодовая адаптация (5 дней) потенцирует адренергическую вазоконстрикцию, ограничивая резервы рабочей гиперемии.

Введение эпинефрина в дозе 0.5 мкг/кг животным с 5-суточной холодовой адаптацией (5-СХА, группа N3) индуцировало повышение перфузионного давления на 84.0 ± 1.2 мм рт.ст. относительно исходного уровня. В комбинированной группе (N4: 5-СХА + симпатолизис) аналогичная доза вызвала увеличение давления лишь на 11.0 ± 0.1 мм рт.ст. (p < 0.05), что соответствует 7.64-кратному снижению вазоконстрикторного ответа после холода при индукции симпатолизиса (рис. 1).

Таблица 1. Активность a-адренорецепторов (М±m, мм рт. ст.) артерий конечности кролика на 8 доз эпинефрина в четырёх сериях опытов: в контроле (n1) 20 кроликов, при симпатолизисе (n2) 15 кроликов, после 5 дней холодовой адаптации (n3) 15 кроликов, при симпатолизисе на фоне 5 дней холодовой адаптации (n4) 15 кроликов

Table 1. Activity of a-adrenergic receptors (M±m, mmHg) of rabbit limb arteries to 8 doses of epinephrine in four series of experiments: control (n1) 20 rabbits, sympatholysis (n2) 15 rabbits, 5-day cold adaptation (n3) 15 rabbits, with sympatholysis against the background of 5 days of cold adaptation (n4) 15 rabbits

Серия Series	Группа Group	Доза, мкг/кг (Y) Dose (mcg/kg)
		0,5 (Y)	1,0 (Y)	2,0 (Y)	5,0 (Y)	10 (Y)	15 (Y)	20 (Y)	30 (Y)
N1	Контроль (N1) Control (N1) (М1±m1)	83± 2,1	121± 1,7	157± 3,5	191± 4,2	205±4,6	211± 5,1	213± 4,2	216± 4,5
N2	Симпатолиз Sympatholysis (М2±m2)	5,0± 0,2*	10,5± 0,24*	20± 0,31*	44± 1,12*	74± 2,39*	95± 2,9*	110± 1,69*	133± 2,95*
N3	Холод 5 дней Cold 30 days (М3±m3)	84± 1,2	131± 1,7*	181± 1,5*	235± 2*	261± 2,4*	271± 2*	277± 1,2*	282± 2,5*
N4	Холод 5 дней Cold 5 days При симпатолизе Sympatholysis (М4±m4)	11± 0,19* ▲■	22± 0,29* ▲■	42± 0,7* ▲■	88± 1,6* ▲■	138± 2,4* ▲■	169± 2,9 ▲■	191± 1,8* ▲■	220± 3 ▲■

Примечание. * p ≤0,01 — изменения достоверны к группе контроля (N1), ▲ p ≤0,01 — изменения достоверны к группе «холод 5 дней» (N3); ■ p ≤0,05 — изменения достоверны к группе «симпатолизис» (N2).

Note. * p ≤0.01 — changes are significant compared to Control (N1), ▲ p ≤0.01 — changes are significant for Cold 5 days (N3), ■ p ≤0.05 — changes are significant to Sympatholysis (N2).

 

При дозе 2 мкг/кг различие между группами сохранилось: Pm = 181.0 ± 1.5 мм рт.ст. (N3) и 42.0 ± 0.7 мм рт.ст. (N4; p < 0.05), демонстрируя 4.31-кратное подавление реакции. Аналогичная тенденция наблюдалась в диапазоне доз 5–30 мкг/кг. Например, при максимальной дозе (30 мкг/кг) перфузионное давление в группе N3 достигло 282.0 ± 2.5 мм рт.ст., тогда как в N4 — 220.0 ± 3.0 мм рт.ст. (p < 0.05), что свидетельствует о 1.28-кратном снижении эффективности симпатолизиса после холодовой адаптации (табл. 1, рис.1).

Анализ кривых «доза–эффект» в координатах Лайнуивера-Берка выявил 15-кратное снижение чувствительности α-адренорецепторов (1/Km=0.08 ± 0.003) в группе N4 при симпатолизисе после холода по сравнению с контролем (N1, 1/Km=1.2 ± 0.04; p < 0.001).

 

 

Рис. 1. Увеличение перфузионного давления в бедренной артерии в четырёх группах кроликов на 8 доз эпинефрина в контрольной группе животных (N1), кроликов при симпатолизисе (N2), животных после 5 дней холодовой адаптации (N3), животных после 5 дней холодовой адаптации при симпатолизисе (N4). Ось абсцисс: доза эпинефрина в мкг/кг (Y); ось ординат: увеличение перфузионного давления (мм рт ст.). Все различия величин опытов при симпатолизисе (N2) и контроле (N1) достоверны (p <0,01). Все различия величин опытов при симпатолизисе на фоне 5 дней холода (N4) и после 5 дней холода (N3) достоверны (p <0,01). Данные опытов при симпатолизисе на фоне 5 дней холода (N4) и симпатолизисе (N2) достоверны (p <0,05). Реакции эпинефрина на дозу 0,5 мкг/кг в группах (N3) и (N1) недостоверны. Реакции эпинефрина на дозу 30 мкг/кг в группах (N4) и (N1) недостоверны.

Fig. 1. Increase in perfusion pressure in the femoral artery in 4 groups of rabbits by 8 doses of epinephrine in the control group of animals (N1), rabbits during sympatholysis (N2), animals after 30 days of cold adaptation (N3), animals after 5 days of cold adaptation during sympatholysis (N4). X-axis: epinephrine dose in mcg/kg (Y), Y-axis: increase in perfusion pressure (mmHg). All differences in the experimental values during sympatholysis (N2) and control (N1) are significant (p <0.01). All differences in the magnitude of the experiments during sympatholysis against the background of 5 days of cold (N4) and after 5 days of cold (N3) are significant (p <0.01). Data from experiments with sympatholysis against the background of 5 days of cold (N4) and sympatholysis (N2) are reliable (p <0.05). The epinephrine responses to a dose of 0.5 mcg/kg in groups (N3) and (N1) are unreliable. The epinephrine responses to a dose of 30 mcg/kg in groups (N4) and (N1) are unreliable.

 

Действие 5-дневной адаптации (N4) к холоду не изменило количество адренорецепторов при симпатолизисе и без него. Это доказывают результаты опытов, где количество рецепторов (Pm) достоверно не изменилось, Pm=312.5 ± 11.0 мм рт.ст. (N4)  при симпатолизисе после холода и Pm=294.0 ± 9.0 мм рт.ст. после холода (N3; p > 0.05) (рис. 2), что показано в координатах Лайнуивера-Берка и показало конкурентный тип ингибирования  реакции медиатор рецептор.

Краткосрочная холодовая адаптация потенцирует десенситизацию α-адренорецепторов (1/Кm) в условиях функционального симпатолизиса, преимущественно за счёт модуляции аффинности рецептор-лигандного взаимодействия (1/Кm чувствительности адренорецепторов).

Наблюдаемая дозозависимая динамика (7.64-кратное снижение ответа при 0.5 мкг/кг и 1.28-кратное при 30 мкг/кг) указывает на конкурентный характер ингибирования, что согласуется с моделью частичного агонизма.

 

 

Рис.2. Увеличение перфузионного давления в бедренной артерии в 4 группах кроликов на 8 доз эпинефрина в контрольной группе животных (N1), кроликов при симпатолизисе (N2), животных после 5 дней холодовой адаптации (N3), животных после 5 дней холодовой адаптации при симпатолизисе (N4) в двойных обратных координатах Лайниувера-Берка.

Ось абсцисс: доза эпинефрина в обратной величине 1/(мкг/кг). Ось ординат: перфузионное давление в обратной величине 1/(мм рт ст.).

Fig. 2. Increase in perfusion pressure in the femoral artery in 4 groups of rabbits by 8 doses of epinephrine in the control group of animals (N1), rabbits during sympatholysis (N2), animals after 5 days of cold adaptation (N3), animals after 5 days of cold adaptation during sympatholysis ( N4) in double inverse Lainiover-Burk coordinates.

X-axis: epinephrine dose in reciprocal 1/(µg/kg). Y-axis: perfusion pressure in reciprocal value 1/(mmHg).

 

В ходе исследования, проведённого на кроликах после пятидневной холодовой адаптации, было выявлено, что симпатолизис, то есть увеличение кровотока в работающих мышцах (N4), происходит преимущественно за счёт снижения чувствительности (1/Кm) альфа-адренорецепторов артериальных сосудов сокращающихся мышц. Однако 5-ДХА существенно снижает симпатолизис (N4) по сравнению с животными, не подвергавшимися холодовой адаптации (N2).

 

Из полученных данных можно сделать вывод, что после пяти дней холодовой адаптации при работе мышц будет наблюдаться значительно меньший кровоток, что не позволит выполнять физические нагрузки, особенно интенсивные, на уровне, сопоставимом с контролем.

Снижение резерва функциональной гиперемии (симпатолизиса) после 5-СХА может лимитировать толерантность к физическим нагрузкам in vivo за счёт нарушения перфузионно-метаболического баланса.

При увеличении дозы эпинефрина с 5 мкг/кг до 30 мкг/кг указанная закономерность сохранялась. После пятидневной адаптации к холоду (группа N4) сужение артерий у кроликов при симпатолизисе было менее выраженным, чем без симпатолизиса (группа N3).

После пятидневной адаптации к холоду при дозе эпинефрина 30 мкг/кг перфузионное давление повысилось (группа N3) на 282 ± 2,5 мм рт. ст., а при симпатолизисе (группа N4) — на 220 ± 3 мм рт. ст., что в 1,28 раза меньше (p < 0,05).

Анализ прессорной реакции артерий на введение эпинефрина на фоне пятидневной адаптации к холоду при симпатолизисе (группа N4) выявил, что при низких дозах эпинефрина симпатолизис значительно сильнее подавлял прессорную реакцию артерий по сравнению с высокими дозами. Если при введении низких доз эпинефрина в количестве 0,5 мкг/кг прессорная реакция артерий снижалась в 7,64 раза, то при введении высокой дозы эпинефрина в количестве 30 мкг/кг симпатолизис вызывал лишь 1,28-кратное уменьшение сокращения артерий (см. таблицу 1).

ОБСУЖДЕНИЕ

Данное исследование впервые предоставляет количественную оценку изменений реактивности α-адренорецепторов (α-AR) артерий скелетных мышц в условиях функционального симпатолизиса при 5 дневной адаптации к холоду. В отличие от предыдущих работ, фокусирующихся на физиологических проявлениях симпатолизиса [5–7], нами применён метод двойных обратных координат Лайнуивера-Берка, позволивший выявить 24.3-кратное снижение аффинности рецепторов (1/Km) к эпинефрину при сохранении их количества (Pm) (рис. 2). Это подтверждает гипотезу о ключевой роли десенситизации α-AR, а не их даунрегуляции (изменение количества адренорецепторов), в механизмах функциональной гиперемии.

Анализ литературы выявил пробел в исследованиях краткосрочных адаптационных процессов. Хотя временные рамки холодовой адаптации широко варьируют (от 1 дня до нескольких лет) [11, 13, 14], большинство работ посвящено долгосрочным эффектам (>30 дней). Наши данные о 5-суточной экспозиции (−10°C) согласуются с клиническими наблюдениями за вахтовыми работниками, у которых кардиоваскулярные и нейровегетативные нарушения (ортостаз, аритмии, нарушение сна) достигают пика на 3–10 сутки, нивелируясь к 20–30 дню [33]. Однако в отличие от этих исследований, акцентирующих системные реакции, наша работа впервые демонстрирует, что даже незавершённая фаза адаптации (5 суток) критически модулирует локальные механизмы  регуляции тонуса артерий через изменение адренореактивности.

Полученные результаты имеют аспекты новизны. Это дозозависимая динамика: 7.64-кратное подавление вазоконстрикторного ответа при низких дозах эпинефрина (0.5 мкг/кг) и 1.28-кратное при высоких (30 мкг/кг), что требует пересмотра классических моделей симпатолизиса. Временнáя специфика: Сравнение с данными после 30-суточной адаптации [31, 32] показывает, что 5-дневная экспозиция индуцирует переходное состояние, при котором компенсаторные механизмы (напр., активация а-AR) ещё не сформированы.

Пятисуточная холодовая адаптация нарушает баланс между метаболическими потребностями мышц и адренергической регуляцией, снижая резерв функциональной гиперемии. Это объясняет клинические наблюдения ограничения толерантности к нагрузкам в ранние сроки адаптации [33] и подчёркивает необходимость фармакологической коррекции α-адренергического соотношения в экстремальных условиях.

В нашей работе мы использовали для оценки адренореактивности артерий 8 доз эпинефрина при фармакокинетическом и фармакодинамическом методе анализа, включая анализ в двойных обратных координатах Лайниувера–Берка. Другие исследователи не проводили подобных опытов, не изучали симпатолизис после 5 дней холодовой адаптации.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Пятисуточная холодовая адаптация при симпатолизисе увеличила количество прессорных адренорецепторов (Pm) артерий и увеличила их чувствительность (1/Km) к эпинефрину. Симпатолизис после 5 дней холодовой адаптации (N4) был на все дозы эпинефрина намного меньше, чем без холода (N2), что доказывало уменьшение кровотока в работающих мышцах при симпатолизисе на фоне холода. Анализ этого механизма в двойных обратных координатах Лайниувера-Берка выявил при симпатолизисе после холода увеличение количества активных a-AR (в 1,407 раза или на 40,7%) до Pm=312,5 мм рт.ст. по сравнению с Pm=222 мм рт.ст. при симпатолизисе без холода. Одновременно после холода (N4) при симпатолизисе увеличилась чувствительность (1/Km) в 1,632 раза (на 63,2%) альфа-адренорецепторов к эпинефрину до 1/Km=0,08 по сравнению с величиной 1/Km=0,049 при симпатолизисе без холода (N2). Полученные данные позволяют сделать следующее заключение, что усиление адренергической вазоконстрикции после 5 дней холода оптимизирует теплосбережение, но снижает перфузионный резерв работающих мышц, что потенциально лимитирует физическую работоспособность. Обнаруженные механизмы объясняют феномен "ранней холодовой астении" у лиц с краткосрочной арктической экспозицией, характеризующейся снижением толерантности к нагрузкам при сохранении базового гемодинамического гомеостаза.

Перспективой использования результатов работы является изучение роли а-адренергических рецепторов в компенсации выявленного дисбаланса, а также поиск фармакологических модуляторов, способных восстановить перфузионно-метаболическое соответствие в условиях незавершённой холодовой адаптации.

Об авторах

Владимир Николаевич Ананьев

ГНЦ РФ Институт медико-биологических проблем РАН, г. Москва, Россия

Автор, ответственный за переписку.
Email: noradrenalin1952@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4679-6441
SPIN-код: 1718-8446
Scopus Author ID: 7005547287
https://e.mail.ru/inbox/?back=1%2C1&from=mail.login&rb_test_id=424

Доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник  отдела 0-07 ГНЦ РФ  Института медико-биологических проблем РАН, г. Москва, Россия

Россия, адрес: 123007, Россия, Москва, Хорошевское шоссе, 76

Георгий Владимирович Ананьев

АО "ФАРМСТАНДАРТ г. Москва

Email: gvananiev@pharmstd.ru
ORCID iD: 0009-0005-4287-8430
SPIN-код: 4845-8340

медицинский советник

Россия, г. Москва

Владимир Иванович Торшин

ФГАОУ ВО Российский университет дружбы народов Минздрава России, Москва, РФ

Email: vtorshin@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3950-8296
SPIN-код: 8602-3159

Доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой нормальной физиологии

Россия, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая д.6.

Ольга Васильевна Ананьева

ФГБОУ ВО Тюменский государственный медицинский университет Минздрава России

Email: olvasan@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0672-9164
SPIN-код: 1239-5484

доктор медицинских наук, профессор

Россия, г. Тюмень, ул. Одесская 52

Список литературы

Дополнительные файлы