Investigation of the possibility of accumulation of metal nanoparticles and their oxides in the organs of laboratory mice

全文:

Введение. Значимость исследований по изучению воздействия наночастиц (НЧ) на всевозможные виды растений, животных и организм человека несомненна. Наночастицы различной химической природы продуцируются в ходе промышленных процессов и образуются естественным путем в природе [1]. Так или иначе в организм человека из окружающей среды поступают многообразные субстанции, в том числе в нанодисперсном состоянии. На стадии изучения находится вопрос о возможности накопления различных наночастиц в легких, головном мозге, печени, почках, репродуктивной и других системах и органах в зависимости от пути их поступления [2, 3]. При положительном ответе на данный вопрос, очень мало сведений о каскадном эффекте НЧ, а также их воздействии на плод и фертильности особей обоего пола.  Поэтому, для нас наибольший интерес представляет системное воздействие НЧ металлов и оксидов на животные организмы и прогнозирование их благоприятного или негативного влияния.

Удельная площадь поверхности экспоненциально возрастает с уменьшением размера наночастиц, что ведет к увеличению биологической активности [4, 5]. Металлы и их оксиды в ультрадисперсном состоянии имеют принципиально иные свойства в сравнении с теми же веществами в макросостоянии или в состоянии ионов [6]. Потенциал НЧ чрезвычайно высок, они способны преодолевать биологические барьеры потому используются в медицине как терапевтические и диагностические инструменты [7, 8]. Вместе с тем они обладают прооксидантной и антиоксидантной активностью и при проникновении в органы и ткани вызывают каскад ответных реакций на окислительный стресс [9]. Образующиеся в определенных производственных процессах НЧ и производимые для медицинских и сельскохозяйственных целей нанопорошки помимо биологической активности, стимуляции процессов роста и развития, защиты от заболеваний, доставки к клеткам лекарственных препаратов несут и угрозу для растительного и животного организма, как способные вызвать окислительный стресс и дисфункцию клеток 10,11,12]. 

Диалектика данного вопроса предполагает всестороннее изучение токсикологической безопасности всевозможных НЧ, воздействующих на человека, животных и растения [13, 14, 15, 16]. Производствам, связанным с наноматериалами необходимо реально оценивать степень токсикологической опасности хорошо известного материала в новой, ультрадисперсной форме [17, 18, 19]. Для подтверждения приемлемого профиля риска необходимы исследования как in vitro, так и in vivo.

 

Материалы и методы. Для эксперимента использованы НЧ меди и кобальта с размерностью 20-50 нм, а также оксида меди и оксида кобальта размером 40-60 нм, произведенные в Московском институте стали и сплавов (МИСиС) химико-металлургическим методом в результате металлизации в токе водорода соответствующих гидроксидов. Объектом исследования являлись лабораторные мыши ICR (ФГБУН «Научный центр биометрических технологий Федерального медико-биологического агентства», Московская область). На протяжении всего периода мыши получали полнорационный гранулированный корм, сбалансированный по питательности, энергии, витаминно-минеральному составу и произведенный в соответствии с ГОСТ Р 50258-92.

В течение эксперимента проводились регулярные взвешивания на лабораторных весах OHAUS (Москва) с ценой деления 0,01 г. Каждую особь взвешивали перед началом и по окончании эксперимента, а также на 6, 11, 16 и 21 день. Проводились визуальные осмотры тела каждого животного. Двигательная активность измерялась определением «вертикального» двигательного компонента ориентировочной реакции, основанного на подсчете количества вставаний животных на задние лапы (вертикальных стоек мышей) в установке из оргстекла диаметром 135 мм и высотой 350 мм в течение 2-х минут.

Объекты исследования разделены на пять групп (n=6). 1-я группа – интактная; 2-я получала суспензию нанодисперсной меди, 3-я – нанодисперсного кобальта, 4-я – нанодисперсного оксида меди, 5-я – нанодисперсного оксида кобальта. Суспензию готовили из расчета 0,02 мг/кг путем добавления нанопорошка каждого вида к соответствующему объему дистиллированной воды. Мыши получали суспензию перорально однократно перед утренним кормлением в течение 20 дней. Перед каждым применением суспензию в течение 15 минут диспергировали в ультразвуковой ванне Град 13-35 (НТК Солтек, Москва) на максимальной мощности.

На 21-й, последний день эксперимента, выпаивание не производили. Мышей подвергали эвтаназии путем декапитации с предварительной наркотизацией изофлураном и произвели забор органов согласно МУ 1.2.2745-10 «Порядок отбора проб для характеристики действия наноматериалов на лабораторных животных». Извлеченные органы (печень, почки, репродуктивная система) отдельно по каждой группе животных были высушены в сушильном шкафу втечение 72 ч при температуре 75⁰ и измельчены в фарфоровых ступках фарфоровыми пестиками. Биоматериал был передан в лабораторию Регионального центра зондовой микроскопии федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Рязанский государственный радиотехнический университет им. В.Ф. Уткина» для определения элементного состава.  Исследования осуществляли на рентгенофлуоресцентном спектрометре Arl QuantX (Швейцария), действие которого основано на энергодисперсионном рентгенофлуоресцентном методе и дающем усредненные по поверхности результаты. Возбужденное в образце вторичное излучение регистрируется энергодисперсионным каналом, который включает в себя детектор и многоканальный амплитудный анализатор. Безэталонный полуколичественный элементный анализ производится с помощью программы UniQuant.  Точечный анализ элементного состава образцов проводился на сканирующем электронном микроскопе JEOL JSM-6610LV (Япония) c энергодисперсионной приставкой-микроанализатором INCA X-MAX. После предварительной пробоподготовки образцы помещали на предметном столике, камера образцов откачивалась, происходило формирование изображения с привязкой к конкретной точке на поверхности.

Статистическую обработку данных поводили в программе Statistica 12.0. Нормальность распределения данных определяли по Колмогорову-Смирнову и Шапиро-Уилку. Сравнение групп по влиянию наночастиц на волосяной покров проводили с применением теста ANOVA, считая достоверными значения при р<0,05. В случаях непараметрического распределения данных использовали критерий Крускала-Уоллиса, указыва средние величины, верхний и нижний квартилли (р<0,02). Сравнение зависимых величин – влияние наночастиц на изменение содержания эссенциальных элементов – проводили с помощью коэффициента корреляции Спирмена (р<0,05).

 

Результаты. Масса тела. Первые дни эксперимента отличий в группах по весу и поведенческим реакциям не наблюдалось. Начиная с четвертого дня особи 4-й группы, получающие суспензию наночастиц оксида меди, употребляли меньше корма, а с 7-го дня ухудшился аппетит у мышей 2-й группы, которым давали нанодисперсную медь. Проводимые в течение всего периода взвешивания показали потерю в весе в группах, получавших в суспензиях медь и оксид меди. Особи обоего пола опытной группы, которых выпаивали нанодисперсным кобальтом употребляли больше корма и демонстрировали прибавку в весе (рис. 1).

Волосяной покров. На 7-й день у 2-х женских особей, получавших нанодисперсную медь, появились «залысины» на голове. Проводимые измерения показали слабое развитие процесса облысения. На 9-й день исследований у 3-х особей-самок 4-й группы (CuO) обнаружено уменьшение шерстяного покрова в нижней части брюшка, продолжавшееся до конца эксперимента (рис.2).

 

    

 

Двигательная активность. Подсчет количества вставаний особей интактной и опытных групп на задние лапки с опорой и без опоры в специальной установке проводился раз в три дня. C 6-го дня эксперимента мыши-самки 5-й группы (CoO) демонстрировали снижение активности. Ту же тенденцию проявляли самцы 2-й группы (Cu) с 9-го дня исследований. Особи обоего пола 3-й группы (Co) c 6-го дня показывали большую частоту вставаний, а на 13-й и 14-й день самки этой группы активно двигались в клетке в течение длительного времени (рис. 3).

 

Элементный состав биоматериалов. По суммарным результатам проведенных исследований следы меди на уровне предельного разрешения метода были обнаружены во всех биологических образцах органов (печени, почках, репродуктивной системе) животных экспериментальных групп, получавших суспензии наночастиц меди и наночастиц оксида меди (рис.4).

 

Элементный кобальт, также на уровне предельного разрешения, был зафиксирован в печени почках и репродуктивной системе 3-й группы мышей, получавших наноразмерный кобальт. Снижение или повышение других фиксируемых данными методами исследования элементов в сравнении с контрольной группой приведено в таблице 1. Следует отметить, что в группах, получавших нанодисперсные медь и оксид меди наблюдалось существенное достоверное (р<0,01) увеличение калия в репродуктивной системе. Статистически достоверное увеличение железа наблюдалось во всех опытных группах. Уровень цинка недостоверно возрастал в 3-й, 4-й и 5-й группах и только в печени.

 

Общая тенденция по всем группам – наличие элементного кислорода исключительно в репродуктивной системе при полном отсутствии его у особей интактной группы (рис.5).

 

  

Также, во всех группах, кроме контрольной, в репродуктивной системе обнаружен алюминий, являющийся токсическим элементом (таблица 2). У самок группы, получавшей суспензию нанооксида меди, в репродуктивной системе содержится 0,1 – 0,2 весовых процентов натрия.

 

Обсуждение. Многочисленные исследования подтверждают проникновение НЧ через дыхательные пути (трансцитоз через эпителий). Нанопорошки способны проникать в дерму с последующей транслокацией в региональные лимфоузлы через лимфу. Затем НЧ могут проникать в кровяное русло и распределяться по всему телу. Основными органами-мишенями являются печень, почки, головной мозг, а также репродуктивная система.   Показатели транслокации вполне вероятно невысоки, а данные о накоплении противоречивы и зависят от повреждения органа. При пероральном введении суспензий наночастиц по мнению ряда авторов происходит их всасывание путем как эндоцитоза так и пиноцетоза [5, 7, 20]. Этому процессу способствует белковая корона, формирующаяся на поверхности НЧ, попавших в организм и состоящая из твердой – белки имеющие высокое сродство к поверхности НЧ и мягкой – слабо связанные белки фаз [21, 22]. Через кровяное русло наноразмерные частицы доставляются к органам и тканям, где способны накапливаться [23, 24, 25]

Обнаружение лишь следов меди и кобальта на уровне предельного разрешения примененными методиками нашего исследования свидетельствует об отсутствии способности к накоплению частиц малого размера. Данные других исследователей подтверждают, что наночастицы меди и кобальта имеют тенденцию к накоплению в печени, почках и других органах [26, 27]. Наночастицы способны удаляться посредством фагоцитоза, причем обратно пропорционально их размерам [10, 28].

Вводимые наночастицы меди и оксида меди оказывали токсическое действие в большей степени на женские особи, проявляющееся потерей веса и выпадением шерсти. У самцов негативное действие нанодисперсной меди выражалось потерей веса и снижением двигательной активности. Снижение двигательной активности женских особей наблюдалось как результат воздействия НЧ оксида кобальта. Учитывая отсутствие накопления использованных наночастиц, такие последствия могут быть обратимы.

Действие наноразмерного кобальта, напротив, оказалось положительным и привело к повышению массы тела и двигательной активности как самок, так и самцов. Наши результаты согласуются с исследованиями других авторов, установивших положительное действие наноразмерного кобальта на гематологические показатели, эритропоэз, снижение уровня холестерина и мочевины [29, 30, 31].

НЧ кобальта и меди, по мнению авторов способствуют увеличению содержания в тканях таких эссенциальных элементов как кальций, железо, медь, марганец, цинк [25, 32]. По результатам спектрометрического анализа можно утверждать, что наночастицы меди и оксида меди проявляли синергизм к калию, особенно в репродуктивной системе самок (r=0,85 и r=0,87 соответственно), что в целом положительно, поскольку может способствовать увеличению числа фолликулов, а также желтых тел и мест имплантации [33]. Медь коррелирует кальцию и железу в тканях печени (r=0,79), сере и железу в репродуктивной системе (r=0,78 и r=0,73). Кальций играет положительную роль в регенерации печени, участвуя, через ряд генов в передаче сигнала в жизненном цикле клеток [34]. Увеличение серы благоприятно, как элемента, входящего в состав цистеина и его окисленной формы – цистина, а также в состав меланина обладающих антиоксидантной и антистрессорной активностью. При этом в репродуктивной системе все применяемые наночастицы проявили антагонизм к кальцию, наиболее проявленный кобальтом (r=-0,69) и оксидом кобальта (r=-0,75). Иначе воздействовали нанодисперсный кобальт и оксид кобальта в почках, способствуя увеличению кальция (r=-0,84), возможными последствиями которого будут снижение фильтрации и повышение уровня кальция в крови.  В дальнейшем, при длительном воздействии НЧ, можно прогнозировать нарушение работы печени, почек и репродуктивной системы, обусловленное влиянием именно этих микроэлементов.

Алюминий, вводимый лабораторным животным в виде солей, приводит к увеличению ПОЛ, снижению числа сперматозоидов и их оплодотворяющей способности, а у самок – к снижению жизнеспособности потомства [35]. Достоверное увеличение эссенциального, проявляющего токсичность алюминия в репродуктивной системе, обусловленное воздействием применяемых в нашем эксперименте НЧ в вероятно приведет к уменьшению сперматогенеза [36, 37].

Корреляция применяемых в эксперименте НЧ с повышением кислорода в тканях репродуктивной системы неоднозначна. Наличие элементного кислорода в репродуктивной системе с одной стороны может говорить о повышение АФК именно в этих органах, повышенной способности реагирования ответа на токсическое воздействие, обусловленное необходимостью защиты функции воспроизведения. С другой стороны, есть вероятность более высокой уязвимости репродуктивной системы к действию наночастиц, а в случае повышения элементного железа (r=-0,65) в группе, получавшей суспензию нанодисперсной меди есть вероятность оксигенации фосфолипидов и развития ферроптоза [37].

 

Заключение. Всем известно мнение древних целителей, утверждавших, что яд от лекарства отличается только дозой. Определив дозу терепевтического эффекта того или иного вида наночастиц необходимо знать способность накопления этих наночастиц. Следует также учитывать опосредованное отдаленное действие вводимых наночастиц через изменение микроэлементного состава органов, которое может иметь как благоприятное влияние, так и негативные последствия.

Основной вопрос нашей работы решен отрицательно. Наночатицы Cu, Co, CuO, CoO, поступающие в организм мышей перорально в концентрации 0,02 мг/кг, не накапливаются в печени, почках и репродуктивной системе.

Результаты эксперимента по морфометрическим показателям определенно свидетельствуют об эффективно положительном воздействие нанодисперсного кобальта и оксида кобальта в применяемой нами дозе. Учитывая полученные нами данные в комплексе, можно рекомендовать НЧ кобальта к использованию в медицинских целях.

 

作者简介

Inna Obidina

РязГМУ

Email: inna.obidina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7235-6415

к. б. н., доцент, кафедра общей химии

俄罗斯联邦, г. Рязань, ул. Высоковольтная, д. 9

Gennady Churilov

Email: genchurilov@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4056-9248
SPIN 代码: 2096-4817

д-р биол наук, профессор

Ivan Chernykh

Email: ivchernykh88@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5618-7607
SPIN 代码: 5238-6165

д-р б.н., доцент, заведующий кафедрой фармацевтической химии и фармакогнозии ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России

Yulia Ivanycheva

Email: julnic79@mail.ru
ORCID iD: 0009-0007-6930-7296
SPIN 代码: 1636-3360

канд. биол. наук, доцент

Elizaveta Pronina

Email: pronina.em2002@yandex.ru

студентка 6 курса лечебного факультета ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России 

Tamriko Matua

编辑信件的主要联系方式.
Email: matua.2001@mail.ru

студентка 6 курса лечебного факультета ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России

参考

补充文件